Фотоактивируемое химическое обесцвечивание красителей

Фотоактивируемое химическое обесцвечивание красителей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В биологии и в медицине для наблюдения различных мишеней в биологическом образце можно использовать различные способы. Например, анализ белков в гистологических срезах и других цитологических препаратах можно проводить, используя методы гистохимии, иммуногистохимии (ИГХ) или иммунофлуоресценции. Анализ белков в биологических образцах можно также проводить, используя твердофазные иммунологические анализы, например, используя методы Вестерн-блоттинга, или используя анализы на основе клеток, которые можно проводить, например, с применением проточной цитометрии.

Многие из современных методов могут обнаружить в одном образце лишь небольшое число мишеней одновременно (такие как ИГХ или флуоресцентные Вестерн-блоттинги, где число обнаружимых мишеней ограничено флуоресцентной системой обнаружения). Для дальнейшего анализа мишеней может потребоваться использование дополнительных биологических образцов из источника, что ограничивает способность к определению относительных характеристик мишеней, таких как присутствие, отсутствие, концентрация и/или пространственное распределение множественных биологических мишеней в биологическом образце. Кроме того, в некоторых случаях для анализа может быть доступно ограниченное количество образца или для отдельного образца может потребоваться дополнительный анализ.

Способы многократного анализа отдельного образца описаны в патенте США №7629125 и в патенте США №7741046. В частности, в патенте США №7741046 предложены способы обнаружения множественных мишеней в биологическом образце, в которые вовлечено использование окисления для инактивации генераторов сигнала (например, для обесцвечивания флуоресцентных красителей). Реакцию окисления осуществляют путем использования окисляющих реагентов, таких как пероксид водорода.

Кроме того, сигнал может быть инактивирован непрерывным воздействием излучения на генератор сигнала, т.е. фотообесцвечиванием. Подобно инактивации сигнала окислением, этот процесс может быть продолжительным и может не проходить до завершения, приводя в результате к сниженному отношению сигнал/шум. Кроме того, непрерывное воздействие излучения на образец может повредить биологический образец. Таким образом, все еще существует необходимость в более быстрых, более мягких и более чувствительных способах последовательного анализа биологических мишеней.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении раскрыты новые способы высокопроизводительного мультиплексного анализа образца. В способах используют, например, процесс цитирования сигнала, где в каждом цикле стадия фотореакции дает возможность повторно использовать одни и те же генераторы сигнала, например флуорофоры, в последующем цикле для обнаружения дополнительных маркеров, например белков. Эти способы можно применять, например, для последовательного анализа биологического образца, чтобы различать среди прочего присутствие, отсутствие, концентрацию и/или пространственное распределение множественных биологических мишеней в биологическом образце. Стадия фотореакции может включать нанесение агента переноса электрона, например боратной соли, и инициацию фотореакции, например, посредством облучения образца видимым светом, для инактивации генератора сигнала, например флуоресцентного красителя.

В некоторых воплощениях преимущества раскрытых способов могут включать быстрое разрушение сигнала в каждом цикле. Например, в некоторых случаях гашение наблюдают примерно за 20 секунд по сравнению с более чем 15 минутами при традиционных способах. В некоторых воплощениях раскрытые способы также могут характеризоваться отсутствием остаточной флуоресценции даже в мишенях с высокой экспрессией, приводящим в результате, например, к повышенному отношению сигнал/шум. Раскрытые способы также не повреждают биологический образец или его компоненты, например эпитопы, так что один и тот же образец можно использовать для множества циклов. Также в некоторых воплощениях, по сравнению с непосредственным фотообесцвечиванием флуоресцентных красителей, раскрытые способы обладают преимуществами, поскольку не требуют света высокой мощности, который может повредить компоненты биологического образца.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающий:

(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;

(б) наблюдение сигнала от по меньшей мере одного зонда, связанного на стадии (а);

(в) приведение образца, содержащего связанный зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона;

(г) облучение образца со стадии (в);

(д) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце со стадии (г); и

(е) наблюдение сигнала от зонда, связанного на стадии (д).

В некоторых воплощениях зонд на стадии (а) содержит генератор оптического сигнала, и сигнал, наблюдаемый на стадии (б), представляет собой оптический сигнал. В следующих воплощениях генератор оптического сигнала представляет собой генератор флуоресцентного сигнала, и оптический сигнал, наблюдаемый на стадии (б), представляет собой флуоресцентный сигнал.

В некоторых воплощениях стадия (а) включает связывание более чем одного зонда с двумя или более чем двумя мишенями.

В некоторых воплощениях облучение образца на стадии (г) осуществляют в присутствии буфера. В некоторых воплощениях облучение осуществляют при рН 5-9. В некоторых воплощениях облучение осуществляют при рН 6-8.

В некоторых воплощениях облучение образца на стадии (г) осуществляют при температуре 4-50°C. В предпочтительном воплощении облучение образца осуществляют при температуре 20-30°C.

В некоторых воплощениях облучение образца на стадии (г) осуществляют посредством воздействия на образец светом с длиной волны от 350 нм до 1,3 мкм. В некоторых воплощениях облучение образца осуществляют посредством воздействия светом с длиной волны 400-700 нм на образец.

В некоторых воплощениях реагент переноса электрона представляет собой боратную соль. В некоторых воплощениях боратная соль представлена следующей структурной формулой:

где:

каждый из R₁, R₂ и R₃ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, где алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил возможно замещен одним или более чем одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из (C₁-C₄)алкила, (C₁-C₄)алкокси, (С₁-С₄)алкиламино, амино, гидроксила, циано, галогена или нитро;

R₄ представляет собой алкил, алкенил или алкинил, где алкил, алкенил или алкинил возможно замещен одним или более чем одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из (С₁-С₄)алкила, (С₁-С₄)алкокси, (С₁-С₄)алкиламино, амино, гидроксила, циано, галогена или нитро; и

M⁺ выбран из группы, состоящей из органических и неорганических катионов.

В некоторых воплощениях каждый из R₁, R₂ и R₃ представляет собой арил. В некоторых воплощениях арил представляет собой фенил. В некоторых воплощениях фенил представляет собой незамещенный фенил.

В некоторых воплощениях R₄ представляет собой возможно замещенный алкил. В некоторых воплощениях R₄ представляет собой незамещенный бутил.

В некоторых воплощениях каждый из R₁, R₂ и R₃ представляет собой возможно замещенный арил, и R₄ представляет собой возможно замещенный алкил. В следующем воплощении каждый из R₁, R₂ и R₃ представляет собой незамещенный фенил, R₄ представляет собой незамещенный бутил, и боратная соль представляет собой трифенилбутилборатную соль.

В некоторых воплощениях M⁺ представляет собой неорганический катион. В некоторых воплощениях неорганический катион представляет собой Li⁺, Na⁺ или К⁺.

В некоторых воплощениях зонд содержит связывающий агент и генератор сигнала. В некоторых воплощениях генератор сигнала представляет собой генератор флуоресцентного сигнала. В некоторых воплощениях генератор флуоресцентного сигнала включает цианиновый краситель. В некоторых воплощениях цианиновый краситель представляет собой Cy3 или Cy5.

В некоторых воплощениях цианиновый краситель представляет собой Cy3; облучение образца на стадии (д) осуществляют путем использования оптических фильтров, и оно включает воздействие на образец светом с длиной волны 520-580 нм и приводит в результате к селективному фотовозбуждению Cy3.

В некоторых воплощениях цианиновый краситель представляет собой Cy5; облучение образца на стадии (д) осуществляют путем использования оптических фильтров, и оно включает воздействие на образец светом с длиной волны 620-680 нм и приводит в результате к селективному фотовозбуждению Cy5.

В некоторых воплощениях биологический образец на стадии (а) включает клеточные органеллы, целые клетки или тканевые срезы. В некоторых воплощениях образец включает белки, углеводы или нуклеиновые кислоты.

В некоторых воплощениях стадии (в)-(е) повторяют один или более чем один раз. В некоторых воплощениях стадии (в)-(е) повторяют по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, по меньшей мере 30, по меньшей мере 60, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 150 раз. В некоторых воплощениях стадии (в)-(е) повторяют 25-30 раз. В других воплощениях стадии (в)-(е) повторяют 2-10 раз.

В некоторых воплощениях стадии (в) и (г) проводят в течение от примерно 20 секунд до примерно 60 минут. В некоторых воплощениях стадии (в) и (г) проводят в течение от примерно 20 секунд до примерно 15 минут. В некоторых воплощениях стадии (в) и (г) проводят в течение от примерно 20 секунд до примерно 5 минут.

В некоторых воплощениях стадии (в) и (г) проводят при температуре 4-50°C. В предпочтительном воплощении стадии (в) и (г) проводят при температуре 20-30°C.

В некоторых воплощениях способ также включает измерение одного или более чем одного значения интенсивности сигнала, наблюдаемого на следующих стадиях наблюдения: на стадии (б), на стадии (е) или на стадиях (б) и (е). В некоторых воплощениях способ дополнительно включает коррелирование значения интенсивности с количеством мишени, присутствующей в образце.

В некоторых воплощениях и зонд на стадии (а) и зонд на стадии (д) содержат генератор сигнала. В некоторых воплощениях генератор сигнала на стадии (а) является таким же, как генератор сигнала на стадии (д). В других воплощениях генератор сигнала на стадии (а) отличается от генератора сигнала на стадии (д).

В некоторых воплощениях сигналы, наблюдаемые как на стадии (б), так и на стадии (е), могут быть обнаружены в одном канале обнаружения. В других воплощениях сигнал, наблюдаемый на стадии (б) или на стадии (е), может быть независимо обнаружен в разных каналах обнаружения.

В некоторых воплощениях компоненты биологического образца, отличные от зонда, значительно не модифицируются.

В некоторых воплощениях после стадии (г) не наблюдается обнаружимый сигнал.

В некоторых воплощениях генератор сигнала включает хромофор или Раман-активную метку.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающий:

(а) связывание множественных зондов с множественными мишенями, присутствующими в биологическом образце;

(б) наблюдение первого набора сигналов от первого набора зондов, связанных на стадии (а);

(в) приведение образца, содержащего связанные зонды со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона;

(г) облучение образца со стадии (в);

(д) генерирование второго набора сигналов от второго набора зондов, связанных на стадии (а);

(е) наблюдение второго набора сигналов.

В некоторых воплощениях облучение образца на стадии (г) инициирует фотореакцию, по существу инактивирующую генератор сигнала путем фотоактивируемого химического обесцвечивания. В некоторых воплощениях фотореакция включает межмолекулярный перенос электрона. В других воплощениях фотореакция включает внутримолекулярный перенос электрона.

В некоторых воплощениях генератор сигнала модифицируется необратимо. В некоторых воплощениях генератор сигнала модифицируется необратимо посредством фотореакции, инактивирующей генератор сигнала посредством фотоактивируемого химического обесцвечивания.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ высокопроизводительного мультиплексного анализа биологического образца, включающий:

процесс цитирования сигнала, где в каждом цикле за окрашиванием и визуализацией следует нанесение реагента переноса электрона и облучение биологического образца.

В некоторых воплощениях способ дает возможность быстрого цитирования сигнала без значительного модифицирования компонентов биологического образца, отличных от зонда.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой набор для зондирования множественных мишеней в биологическом образце, содержащий:

множественные зонды, содержащие связывающий агент, соединенный с генератором сигнала;

реагент переноса электрона, который при контакте с генератором сигнала способен к обесцвечиванию генератора сигнала при облучении.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой серию из по меньшей мере двух изображений, показывающих оптически меченные биологические мишени, где:

изображения получены в процессе зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающем:

(а) связывание по меньшей мере одного оптического зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;

(б) наблюдение сигнала от оптического зонда, связанного на стадии (а);

(в) приведение образца, содержащего связанный оптический зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона;

(г) облучение образца со стадии (в);

(д) связывание по меньшей мере одного оптического зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце со стадии (г); и

(е) наблюдение сигнала от оптического зонда, связанного на стадии (д).

В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ зондирования мишеней в биологическом образце, включающий:

(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;

(б) наблюдение сигнала от зонда, связанного на стадии (а);

(в) приведение образца, содержащего связанный зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электрона; и

(г) облучение образца со стадии (в).

В некоторых воплощениях настоящее изобретение представляет собой способ зондирования множественных мишеней в биологическом образце, включающий:

(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце, содержащем множественные мишени;

(б) связывание по меньшей мере одного контрольного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в биологическом образце;

(в) наблюдение сигнала от зонда, связанного на стадии (а), и контрольного сигнала от контрольного зонда, связанного на стадии (б);

(г) приведение образца со стадии (в) в контакт с реагентом переноса электрона, способным к селективному взаимодействию с зондом, но не с контрольным зондом;

(д) облучение образца со стадии (г);

(е) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более чем одной мишенью, присутствующей в образце со стадии (д); и

(ж) наблюдение сигнала от зонда, связанного на стадии (е).

В некоторых воплощениях стадии (а) и (б) проводят одновременно. В некоторых воплощениях стадия (ж) также включает наблюдение сигнала от контрольного зонда, связанного на стадии (б).

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой полутоновое изображение графика, показывающего оптическую плотность красителя Cy3 при 550 нм после инкубации с солью трифенилбутилборат лития в различных концентрациях и облучения в течение 4 или 10 минут.

На Фиг. 2 показаны полутоновые изображения образцов, окрашенных Cy3-конъюгированным цитокератином, до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.

На Фиг. 3 показаны полутоновые изображения образцов, окрашенных Cy5-конъюгированным пан-кадгерином, до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.

На Фиг. 4 показано полутоновое изображение спектра флуоресценции красителя BODIPY до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.

На Фиг. 5 показано полутоновое изображение спектра флуоресценции красителя родамина до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.

На Фиг. 6 показано полутоновое изображение спектра флуоресценции красителя 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридинона (DDAO) до и после фотоактивируемого химического обесцвечивания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явным образом не диктует иное. Приблизительные формулировки, используемые в данном изобретении на протяжении всего описания и формулы изобретения, могут быть применены для модификации какого-либо количественного выражения, которое может допустимо варьировать, не приводя в результате к изменению основной функции, к которой оно относится. Соответственно, значение, модифицируемое таким термином, как "примерно", не ограничено указанным точным значением. Если не указано иное, все числа, которыми выражены количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакций и т.д., используемые в описании и в формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "примерно". Соответственно, если не указано противоположное, числовые параметры, указанные в последующем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближениями, которые могут варьировать в зависимости от желаемых свойств, которые подразумевают получить в настоящем изобретении. По крайней мере каждый числовой параметр следует по меньшей мере истолковывать в свете числа указанных значащих цифр и путем применения обычных методов округления.

Как используют в данном изобретении, термин "алкил" относится к насыщенным алифатическим группам, включающим прямоцепочечные алкильные группы (например метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил, нонил, децил и т.д.), разветвленные алкильные группы (изопропил, трет-бутил, изобутил и т.д.). В некоторых воплощениях прямоцепочечный или разветвленный алкил имеет 6 или менее атомов углерода (например C₁-C₆ для прямой цепи, С₃-С₆ для разветвленной цепи) в своем скелете или 4 атома углерода или менее в своем скелете (например C₁-C₄ для прямой цепи, С₃-С₄ для разветвленной цепи). Термин "(С₁-C₆)алкил" относится к алкильным группам, содержащим от 1 до 6 атомов углерода. Термин "(С₁-С₄)алкил" относится к алкильным группам, содержащим от 1 до 4 атомов углерода. Кроме того, термин алкил включает как "незамещенные алкилы", так и "замещенные алкилы", последние из которых относятся к алкильным группировкам, имеющим заместители, замещающие атом водорода на одном или более чем одном атоме углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, (C₁-C₄)алкил, (С₁-С₄)алкокси, амино (включая (C₁-C₄)алкиламино и (C₁-C₄)диалкиламино), гидроксил, циано, галоген или нитро. Циклоалкилы могут быть дополнительно замещены, например, описанными выше заместителями.

Как используют в данном изобретении, термин "алкенил" относится к ненасыщенным алифатическим группам, аналогичным по длине и возможному замещению описанным выше алкилам, но содержащим по меньшей мере одну двойную связь. Например, термин "алкенил" включает прямоцепочечные алкенильные группы (например этиленил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил, гептенил, октенил, ноненил, деценил и т.д.), разветвленные алкенильные группы. Кроме того, термин "алкенил" включает как "незамещенные алкенилы", так и "замещенные алкенилы", последние из которых относятся к алкенильным группировкам, имеющим заместители, замещающие атом водорода на одном или более чем одном атоме углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, (С₁-С₄)алкил, (C₁-C₄)алкокси, амино (включая (C₁-C₄)алкиламино и (С₁-С₄)диалкиламино), гидроксил, циано, галоген или нитро.

Как используют в данном изобретении, термин "алкинил" относится к ненасыщенным алифатическим группам, аналогичным по длине и возможному замещению описанным выше алкилам, но содержащим по меньшей мере одну тройную связь. Например, термин "алкинил" включает прямоцепочечные алкинильные группы (например этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил, гептинил, октинил, нонинил, децинил и т.д.) или разветвленные алкинильные группы. Кроме того, термин "алкинил" включает как "незамещенные алкинилы", так и "замещенные алкинилы", последние из которых относятся к алкинильным группировкам, имеющим заместители, замещающие атом водорода на одном или более чем одном атоме углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, (C₁-C₄)алкил, (C₁-C₄)алкокси, амино (включая (C₁-C₄)алкиламино и (С₁-С₄)диалкиламино), гидроксил, циано, галоген или нитро.

Как используют в данном изобретении, термин "алкокси" относится к замещенным и. незамещенным алкильным, алкенильным и алкинильным группам, ковалентно связанным с атомом кислорода. Примеры алкоксигрупп включают метокси, этокси, изопропилокси, пропокси, бутокси и пентокси, но не ограничены ими. В некоторых воплощениях прямоцепочечные или разветвленные алкоксигруппы имеют 4 атома углерода или менее (например C₁-C₄ для прямой цепи, С₃-С₄ для разветвленной цепи) в своем скелете. Термин "(С₁-С₄)алкил" относится к алкильным группам, содержащим от 1 до 4 атомов углерода.

Как используют в данном изобретении, термин "амин" или "амино" относится к соединениям или заместителям, где атом азота ковалентно связан по меньшей с одним атомом углерода или гетероатомом. Этот термин включает "алкиламино", включающий группы и соединения, где атом азота связан по меньшей мере с одной дополнительной алкильной группой. Термин "диалкиламино" включает группы, где атом азота связан по меньшей мере с двумя дополнительными алкильными группами. В некоторых воплощениях эти алкильные группы имеют 4 атома углерода или менее (например C₁-C₄ для прямой цепи, С₃-С₄ для разветвленной цепи) в своем скелете. Термин (С₁-С₄)алкиламино относится к группам и соединениям, где атом азота связан по меньшей мере с одной дополнительной (C₁-C₄)алкильной группой. Термин (C₁-C₄)диалкиламино относится к группам и соединениям, где атом азота связан по меньшей мере с двумя дополнительными (С₁-С₄)алкильными группами.

Как используют в данном изобретении, термин "арил" относится к группам, например 5- и 6-членным однокольцевым ароматическим группам, которые могут включать от нуля до четырех гетероатомов, например бензолу, фенилу, пирролу, фурану, тиофену, тиазолу, изотиазолу, имидазолу, триазолу, тетразолу, пиразолу, оксазолу, изоксазолу, пиридину, пиразину, пиридазину и пиримидину и тому подобному. Кроме того, термин "арил" включает полициклические арильные группы, например трициклические, бициклические, например нафталин, бензоксазол, бензодиоксазол, бензотиазол, бензоимидазол, бензотиофен, метилендиоксифенил, хинолин, изохинолин, нафтиридин, индол, бензофуран, пурин, бензофуран, деазапурин или индолизин. Арильные группы, имеющие гетероатомы в кольцевой структуре, могут также называться "арильными гетероциклами", "гетероарилами" или "гетероароматическими группами". Ароматическое кольцо может быть замещено в одном или более чем в одном кольцевом положении такими заместителями, как описано выше, как, например, (C₁-C₄)алкил, (C₁-C₄)алкокси, амино (включая (C₁-C₄)алкиламино и (C₁-C₄)диалкиламино), гидроксил, циано, галоген или нитро. Арильные группы могут быть также конденсированы или связаны через мостик с алициклическими или гетероциклическими кольцами, не являющимися ароматическими, таким образом, что образуют полицикл (например тетралин). Термин "гетероарил" включает ненасыщенные циклические соединения, такие как азирин, оксирен, дитиет, пирролин, пиррол, фуран, дигидрофуран, дигидротиофен, тиофен, пиразол, имидазол, оксазол, тиазол, изотиазол, 1,2,3-триазол, 1,2,4-триазол, дитиазол, тетразол, пиридин, пиран, пиримидин, пиран, тиапиран, диазин, тиазин, диоксин, триазин и тетразен.

Как используют в данном изобретении, термин "антитело" относится к иммуноглобулину, специфически связывающемуся с определенной пространственной и полярной организацией другой молекулы, и таким образом определен как комплементарный ей. Антитело может быть моноклональным или поликлональным и может быть получено методами, хорошо известными в данной области техники, такими как иммунизация хозяина и сбор сывороток (поликлональных), или путем получения стабильных гибридных клеточных линий и сбора секретируемого белка (моноклонального), или путем клонирования и экспрессии нуклеотидных последовательностей или их мутировавших вариантов, кодирующих по меньшей мере аминокислотные последовательности, необходимые для специфического связывания природных антител. Антитела могут включать полноразмерный иммуноглобулин или его фрагмент, где иммуноглобулины включают различные классы и изотипы, такие как IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3, IgM. Функциональные фрагменты антитела могут включать участки антитела, способные к сохранению связывания со сродством, подобным сродству полноразмерного антитела (например Fab, Fv и F(ab').sub.2 или Fab'). Кроме того, где это целесообразно, можно использовать агрегаты, полимеры и конъюгаты иммуноглобулинов или их фрагментов при условии, что их связывающее сродство к конкретной молекуле по существу сохранено.

Как используют в данном изобретении, термин "связывающий агент" относится к молекуле, которая связывается с одной или более чем одной мишенью в биологическом образце. Связывающий агент может специфически связываться с мишенью. Подходящие связывающие агенты могут включать один или более чем один из природных или модифицированных пептидов, белков (например антител, аффител или аптамеров), нуклеиновых кислот (например полинуклеотидов, ДНК, РНК или аптамеров), полисахаридов (например пектинов, сахаров), липидов, ферментов, субстратов ферментов или ингибиторов, лигандов, рецепторов, антигенов или гаптенов. Подходящий связывающий агент может быть выбран в зависимости от анализируемого образца и от мишеней, доступных для обнаружения. Например, мишень в образце может включать лиганд, а связывающий агент может включать рецептор, либо мишень может включать рецептор, а связывающий агент может включать лиганд. Подобным образом, мишень может включать антиген, а связывающий агент может включать антитело или фрагмент антитела, либо наоборот. В некоторых воплощениях мишень может включать нуклеиновую кислоту, а связывающий агент может включать комплементарную нуклеиновую кислоту. В некоторых воплощениях как мишень, так и связывающий агент могут включать белки, способные к связыванию друг с другом.

Как используют в данном изобретении, термин "биологический образец" относится к полученному от биологического субъекта образцу, включающему образец биологической ткани или жидкости, полученный in vivo или in vitro. Такие образцы могут представлять собой жидкость организма (например кровь, плазму крови, сыворотку или мочу), органы, ткани, фракции, клетки, выделенные из млекопитающих, включая людей, и клеточные органеллы, но не ограничены ими. Биологические образцы также могут включать срезы биологического образца, включающего ткани (например срезы органа или ткани). Биологические образцы могут также включать экстракты из биологического образца, например антиген или нуклеиновую кислоту из биологической жидкости (например крови или мочи). Биологические образцы могут содержать белки, углеводы или нуклеиновые кислоты.

Биологический образец может иметь прокариотическое происхождение, происхождение из простейших или эукариотическое происхождение (например из насекомых, простейших, птиц, рыб, рептилий). В некоторых воплощениях биологический образец представляет собой образец от млекопитающего (например от крысы, мыши, коровы, собаки, осла, морской свинки или кролика). В некоторых воплощениях биологический образец имеет происхождение из приматов (например от шимпанзе или человека).

Как используют в данном изобретении, термин "контрольный зонд" относится к агенту, имеющему в составе связывающий агент, соединенный с генератором сигнала, или к генератору сигнала, способному к прямому окрашиванию, так что генератор сигнала сохраняет по меньшей мере 80 процентов сигнала после контакта с реагентом переноса электрона и при последующем облучении. Подходящий генератор сигнала в контрольном зонде по существу не инактивируется, например по существу не обесцвечивается в результате фотоактивируемого химического обесцвечивания при контакте с реагентом переноса электрона и облучении. Подходящие примеры генераторов сигнала могут включать флуорофор, не претерпевающий обесцвечивание в используемых условиях (например DAPI).

Как используют в данном изобретении, термин "фермент" относится к молекуле белка, которая может катализировать химическую реакцию субстрата. В некоторых воплощениях подходящий фермент катализирует химическую реакцию субстрата с образованием продукта реакции, который может связываться с рецептором (например фенольные группы), присутствующим в образце. Рецептор может быть экзогенным (то есть рецептор снаружи прикреплен к образцу или к твердому носителю) или эндогенным (рецепторы, естественно присутствующие в образце или на твердом носителе). Примеры подходящих ферментов включают пероксидазы, оксидазы, фосфатазы, эстеразы и гликозидазы. Конкретные примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-D-галактозидазу, липазу и глюкозооксидазу.

Как используют в данном изобретении, термин "субстрат фермента" относится к химическому соединению, которое претерпевает химический катализ ферментом с образованием продукта реакции. В некоторых воплощениях продукт реакции способен к связыванию с рецептором, присутствующим в образце. В некоторых воплощениях субстраты ферментов, применяемые в способах по изобретению, могут включать нехромогенные или нехемилюминесцентные субстраты. Генератор сигнала может быть присоединен к субстрату фермента в виде метки.

Как используют в данном изобретении, термин "реагент переноса электрона" относится к реагенту, который может участвовать в фотореакции с молекулой, способной претерпевать фотовозбуждение. Этот термин также относится к композиции, содержащей реагент, который может участвовать в фотореакции с молекулой, способной претерпевать фотовозбуждение. В некоторых воплощениях молекула, способная претерпевать фотовозбуждение, может представлять собой генератор сигнала. В некоторых воплощениях реагент переноса электрона может передавать электрон генератору сигнала в ходе фотореакции. В альтернативных воплощениях реагент переноса электрона может принимать электрон от генератора сигнала в ходе фотореакции.

В некоторых воплощениях реагент переноса электрона, передающий электрон генератору сигнала в ходе фотореакции, может представлять собой боратную соль. В другом воплощении боратная соль представляет собой трифенилбутилборат.

В альтернативных воплощениях реагент переноса электрона, принимающий электрон от фотовозбужденной молекулы, может представлять собой ониевую соль [например гексафторфосфат дифенилиодония (DPI) или тетрафторборат диметилфенацилсульфония (DMPS)] или бутилтрифенилборат тетрабутиламмония (ТВАВ).

Как используют в данном изобретении, термин "флуорофор" или "генератор флуоресцентного сигнала" относится к химическому соединению, которое при возбуждении светом с определенной длиной волны испускает свет при другой длине волны. Флуорофоры могут быть описаны в отношении их профиля испускания или "цвета". Зеленые флуорофоры (например Cy3, флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и Oregon Green) могут характеризоваться испусканием при длинах волн, находящихся как правило в диапазоне 515-540 нанометров. Красные флуорофоры (например Texas Red, Cy5 и тетраметилродамин) могут характеризоваться испусканием при длинах волн, находящихся как правило в диапазоне 590-690 нанометров. Примеры флуорофоров включают 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфокислоту, акридин, производные акридина и изотиоцианата акридина, 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфокислоту (EDANS), 4-амино-N-[3-винилсульфонил)фенил]нафталимид-3,5-дисульфонат (Lucifer Yellow VS), N-(4-анилино-1-нафтил)малеимид, антраниламид, бриллиантовый желтый, кумарин, производные кумарина, 7-амино-4-метилкумарин (АМС, Кумарин 120), 7-амино-трифторметилкумарин (Кумарин 151), цианозин, 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), 5',5ʺ-дибромпирогаллолсульфонфталеин (бромпирогаллоловый красный), 7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин, 4,4'-диизотиоцианатодигидростильбен-2,2'-дисуьфокислоту, 4,4'-диизотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфокислоту, 5-[диметиламино]нафталин-1-сульфонилхлорид (DNS, дансилхлорид), флуоресцеин и производные, такие как 5-карбоксифлуоресцеин (РАМ), 5-(4,6-дихлортриазин-2-ил)аминофлуоресцеин (DTAF), 2'7'-диметокси-4'5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеин (JOE), флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), Q-FITC (XRITC); производное флуорескамина (флуоресценция при взаимодействии с аминами); IR144; IR1446; малахитовый зеленый изотиоцианат; 4-метилумбеллиферон; орто-крезолфталеин; нитротирозин; парарозанилин; феноловый красный, В-фикоэритрин; производное орто-фталдиальдегида (флуоресценция при взаимодействии с аминами); пирен и производные, такие как пирен, пиренбутират и сукцинимидил-1-пиренбутират; Reactive Red 4 (Cibacron. RTM. Бриллиантовый красный 3B-А), родамин и производные, такие как 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 6-карбоксиродамин (R6G), лиссамин-родамин В сульфонилхлорид, родамин (Rhod), родамин В, родамин 123, родамин Х изотиоцианат, сульфородамин В, сульфородамин 101 и сульфонилхлоридное производное сульфородамина 101 (техасский красный); N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA); тетраметилродамин, тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC); рибофлавин; хелатные производные розоловой кислоты и лантанида, цианины, пирилиевые красители, скварены, 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридинон (DDAO) и диметилакридинон (DAO), но не ограничены ими. В некоторых воплощениях флуорофор может представлять собой цианиновые, родаминовые, BODIPY или 1,3-дихлор-7-гидрокси-9,9-диметил-2(9Н)-акридиноновые (DDAO) красители. В предпочтительном воплощении флуорофор представляет собой цианиновый краситель. В другом воплощении цианиновый краситель представляет собой Cy3 или Cy5.

Как используют в данном изобретении, термин "in situ" в целом относится к событию, происходящему в исходной локализации, например в интактном органе или ткани или в репрезентативном сегменте органа или ткани. В некоторых воплощениях анализ мишеней in situ может быть проведен на клетках, имеющих происхождение из разнообразных источников, включающих организм, орган, образец ткани или клеточную культуру. Анализ in situ обеспечивает контекстную информацию, которая может быть утрачена, когда мишень извлечена из места ее происхождения. Соответственно, анализ мишеней in situ описывает анализ связанного с мишенью зонда, локализованного внутри целой клетки или образца ткани, при этом клеточная мембрана полностью интактна или частично интактна, причем связанный с мишенью зонд остается внутри клетки. Кроме того, способы, раскрытые в данном изобретении, можно применять для анализа мишене