Трансгенный объект сои mon 87708 и способы его применения

Трансгенный объект сои mon 87708 и способы его применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/243227, зарегистрированной 17 сентября 2009 года, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Список последовательностей, содержащийся в файле "55544-0001_seqlisting.txt", составляющем 19,5 килобайт (размер, определяемый Microsoft Windows®) и созданном 13 августа 2010 года, зарегистрирован посредством этого в электронном виде и включен в настоящий документ в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к трансгенному объекту Glycine max MON 87708. Объект проявляет устойчивость к гербициду дикамба. Изобретение также относится к растениям, частям растений, семенам растений, растительным клеткам, сельскохозяйственной продукции и способам, относящимся к объекту MON 87708, и относится к нуклеотидным молекулам, являющимся уникальными для объекта и созданным применительно к встраиванию трансгенной ДНК в геном растения Glycine max.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соя (Glycine max) является важной сельскохозяйственной культурой во многих регионах мира, и для получения сои с желаемыми свойствами к данной сельскохозяйственной культуре применяют способы биотехнологии. Одним таким желаемым свойством является устойчивость к гербицидам. Экспрессия в растении трансгена устойчивости к гербицидам может придавать растению желаемое свойство устойчивости к гербицидам, но на экспрессию трансгена могут влиять положение на хромосоме и геномный результат встраивания трансгена. Например, в растениях часто наблюдают разнообразие уровня и профиля экспрессии трансгена среди отдельных объектов, отличающихся по участку встраивания трансгена в хромосому, но в остальном идентичных. Также могут существовать нежелательные и/или желательные фенотипические или агрономические различия между объектами. Поэтому часто необходимыми являются получение и анализ большого числа отдельных растительных трансформированных объектов для селекции объекта, обладающего желаемым свойством и оптимальными фенотипическими и сельскохозяйственными характеристиками, необходимыми для того, чтобы делать его подходящим для коммерческих целей. Такая селекция часто требует наличия теплиц и полевых испытаний со многими объектами в течение многих лет во многих местах и в различных условиях, таким образом, можно собирать значительное количество агрономических, фенотипических и молекулярных данных. Затем с целью селекции коммерчески подходящего объекта команды ученых и агрономов должны анализировать полученные данные и наблюдения. Выбрав такой объект, затем можно применять его для интрогрессии желаемого свойства в другое генетическое окружение с применением способов селекции растений и, таким образом, получать ряд различных сортов сельскохозяйственных культур, обладающих желаемым свойством и соответствующим образом приспособленных к конкретным местным условиям выращивания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к трансгенным растениям сои, обозначаемым как объект MON 87708, проявляющим коммерчески приемлемую устойчивость к применению гербицида дикамба, показательный образец семян которых хранится в American Type Culture Collection (ATCC) как образец № PTA-9670. Изобретение также относится к новым молекулам ДНК, относящимся к объекту сои MON 87708, и способам применения данных молекул. Изобретение также относится к семенам, потомству, частям растений, клеткам и товарам объекта сои MON 87708. Изобретение также относится к способам применения объекта сои MON 87708 и способам получения устойчивой к дикамбе сои.

Изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, относящимся к объекту сои MON 87708. Данные рекомбинантные молекулы ДНК могут содержать нуклеотидные молекулы, обладающие нуклеотидной последовательностью, представляющей собой область геномной ДНК, фланкирующую инсерцию трансгена, и/или область инсерции трансгена, и/или непрерывную последовательность любой из данных областей, такой как область соединения между инсерцией трансгена и фланкирующей геномной ДНК объекта сои MON 87708. Изобретение также относится к молекулам ДНК, применимым в качестве праймеров и зондов, характерных для объекта сои MON 87708, и ампликонам, характерным для наличия объекта сои MON 87708. Также описывают растения сои, растительные клетки, части растений, товары, потомство и семена, содержащие данные молекулы.

Изобретение относится к способам, композициям и наборам, применимым для определения наличия и/или отсутствия ДНК, полученной из объекта сои MON 87708, и, таким образом, наличия и/или отсутствия объекта. Изобретение относится к способу определения MON 87708 посредством приведения содержащего ДНК образца в контакт с набором праймеров, с помощью которого при применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК из объекта сои MON 87708 получают амплифицированную ДНК, характерную для объекта сои MON 87708, проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты, таким образом, получения амплифицированной ДНК и определения наличия и/или отсутствия амплифицированной ДНК. Изобретение также относится к способу определения MON 87708 посредством приведения содержащего ДНК образца в контакт зондом, который при применении в реакции гибридизации с ДНК из объекта сои MON 87708 гибридизуется с молекулой ДНК, специфичной для объекта сои MON 87708, проведения реакции гибридизации и определения гибридизации зонда с молекулой ДНК. Также предоставляют наборы, включающие способы и композиции по изобретению, применимые для определения наличия ДНК, полученной из объекта сои MON 87708.

Изобретение относится к растению сои, семенам, растительной клетке, растению-потомку, части растения или товару, полученному из растения, растительной клетки или семян объекта сои MON 87708. Изобретение также относится к растению сои, семенам, растительной клетке, растению-потомку, части растения или товару, содержащим рекомбинантную молекулу ДНК, обладающую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-8 и комплементарных им цепей и их фрагментам. Изобретение также относится к растению сои, семенам, растительной клетке, растению-потомку, части растения или товару, полученным из растения или семян объекта сои MON 87708 и содержащим рекомбинантную молекулу ДНК, из которой в способе амплификации ДНК получают амплифицированную молекулу ДНК, содержащую SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8.

Изобретение относится к способу контроля сорняков в поле посредством посева объекта сои MON 87708 и затем нанесения эффективной дозы гербицида дикамба, способного контролировать сорняки без повреждения растений объекта сои MON 87708. Изобретение также относится к способу контроля сорняков в поле посредством нанесения эффективной дозы гербицида дикамба для контроля сорняков в поле и затем посева объекта сои MON 87708 в поле. Изобретение также относится к способу получения семян сои, по существу не содержащих семена вредоносных видов сорняков, посредством посева семян устойчивого к дикамбе сорта сои MON 87708 в поле, нанесения на поле повсходовой эффективной дозы гербицида дикамба, достаточной для уничтожения вредоносных видов сорняков, и сбора семян с поля.

Изобретение относится к способам получения растения сои и/или семян, устойчивых к нанесению гербицида дикамба, посредством полового скрещивания растения объекта сои MON 87708, содержащего SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, со вторым растением сои, таким образом, получая семена, выращивая семена для получения растений-потомков, обрабатывая растения-потомки дикамбой и выбирая устойчивое к дикамбе растение-потомка. Способы также могут включать самоопыление выбранного растения-потомка для получения множества растений-потомков второго поколения и селекции из них устойчивого к дикамбе растения. Способы также могут включать половое скрещивание выбранного растения-потомка с другим растением сои для получения семян, выращивание семян для получения второго поколения растений-потомков, обработку второго поколения растений-потомков дикамбой и селекцию устойчивого к дикамбе растения-потомка второго поколения. Изобретение относится к способам получения растения сои и/или семян, устойчивых к нанесению гербицида дикамба, посредством самоопыления устойчивого к дикамбе растения объекта сои MON 87708, содержащего SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, таким образом, получая семена, выращивая семена для получения растений-потомков, обрабатывая растения-потомки дикамбой; и селекции растения-потомка, устойчивого к дикамбе.

Изобретение относится к способам определения зиготности растения или семян объекта сои MON 87708, включающим приведение образца ДНК сои в контакт с набором праймеров, содержащим SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, и набором зондов, содержащим SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16; затем осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты с образцом, набором праймеров и набором зондов; затем определение в данной реакции амплификации нуклеиновой кислоты первого флуоресцентного сигнала, характерного для объекта MON 87708, и второго флуоресцентного сигнала, отличающегося от первого флуоресцентного сигнала и характерного для геномной ДНК природной сои, соответствующей положению инсерции трансгена объекта MON 87708; и анализ наличия и/или отсутствия первого флуоресцентного сигнала и второго флуоресцентного сигнала в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, где наличие обоих флуоресцентных сигналов свидетельствует о том, что образец является гетерозиготным по объекту MON 87708, и наличие только первого флуоресцентного сигнала свидетельствует о том, что образец является гомозиготным по объекту MON 87708.

Изобретение также относится к растению сои, семенам, растительной клетке или части растения, содержащим область гаплотипа сои в группе сцепления 9 в приблизительном положении 143.5, содержащую ген устойчивости к дикамбе и далее определяемую по "скользящему окну" гаплотипа 19743 и 19767, и способам их применения. Указанные выше и другие аспекты изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена организация трансгенной инсерции в геноме объекта сои MON 87708; [A] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 1, представляющей собой шестьдесят нуклеотидов соединения между геномной ДНК сои и 5'-областью инсерции ДНК трансгена; [Α'] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 7, представляющей собой сто нуклеотидов соединения между геномной ДНК сои и 5'-областью инсерции ДНК трансгена; [B] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 2, представляющей собой шестьдесят нуклеотидов соединения между геномной ДНК сои и 3'-областью инсерции ДНК трансгена; [Β'] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 8, представляющей собой сто нуклеотидов соединения между геномной ДНК сои и 3'-областью инсерции ДНК трансгена; [C] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 3, являющейся последовательностью генома сои, фланкирующей условно выделенный/обозначенный 5'-конец встроенной в геном объекта MON 87708 экспрессирующей кассеты; [D] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 4, являющейся последовательностью генома сои, фланкирующей условно выделенный/обозначенный 3'-конец встроенной в геном объекта MON 87708 экспрессирующей кассеты; [E] представляет различные элементы, содержащие SEQ ID NO: 5, и является последовательностью встроенной в геном объекта MON 87708 экспрессирующей кассеты; и [F] представляет непрерывную последовательность (предоставляемую как SEQ ID NO: 6), содержащую, как представлено на фигуре слева направо, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 4, в которые включают SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, т.к. данные последовательности присутствуют в геноме объекта MON 87708.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 является последовательностью шестидесяти нуклеотидов, представляющей собой 5'-соединение между геномной ДНК сои и встроенной трансгенной экспрессирующей кассетой. SEQ ID NO: 1 помещают в SEQ ID NO: 6 в нуклеотидное положение 1097-1156.

SEQ ID NO: 2 является последовательностью шестидесяти нуклеотидов, представляющей собой 3'-соединение между геномной ДНК сои и встроенной трансгенной экспрессирующей кассетой. SEQ ID NO: 2 помещают в SEQ ID NO: 6 в нуклеотидное положение 4100-4159.

SEQ ID NO: 3 является 5'-последовательностью, фланкирующей встроенную ДНК объекта сои MON 87708 до области инсерции трансгенной ДНК и включая ее.

SEQ ID NO: 4 является 3'-последовательностью, фланкирующей встроенную ДНК объекта сои MON 87708 до области инсерции трансгенной ДНК и включая ее.

SEQ ID NO: 5 является последовательностью встроенной трансгенной экспрессирующей кассеты.

SEQ ID NO: 6 является нуклеотидной последовательностью, представляющей собой контиг 5'-последовательности, фланкирующей встроенную ДНК объекта сои MON 87708 (SEQ ID NO: 3), последовательность встроенной ДНК (SEQ ID NO: 5), и 3' последовательности, фланкирующей встроенную ДНК объекта сои MON 87708 (SEQ ID NO: 4), и включает SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 7 является последовательностью ста нуклеотидов, представляющей собой 5'-соединение между геномной ДНК сои и встроенной трансгенной экспрессирующей кассетой.

SEQ ID NO: 8 является последовательностью ста нуклеотидов, представляющей собой 3'-соединение между геномной ДНК сои и встроенной трансгенной экспрессирующей кассетой.

SEQ ID NO: 9 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ13570 и применяемого для идентификации объекта сои MON 87708. Он комплементарен встроенной экспрессирующей кассете в области, близкой к 3'-краю инсерции трансгена. ПЦР-ампликон, получаемый при анализе TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) с применением сочетания праймеров SQ13570 и SQ13571 (SEQ ID NO: 10), является положительным результатом наличия объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 10 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ13571 и применяемого для идентификации объекта сои MON 87708. Он комплементарен 3'-области, фланкирующей встроенную экспрессирующую кассету и близкой к краю инсерции ДНК трансгена. ПЦР-ампликон, получаемый при анализе TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) с применением сочетания праймеров SQ13570 (SEQ ID NO: 9) и SQ13571, является положительным результатом наличия объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 11 является последовательностью зонда, обозначаемого как зонд PB4655 и применяемого для идентификации объекта сои MON 87708. Он комплементарен области, охватывающей 3'-соединение встроенной экспрессирующей кассеты и геномной ДНК. Данный зонд является 6-FAM™-меченым синтетическим олигонуклеотидом. Испускание флуоресцентного сигнала в реакции амплификации с применением праймеров SQ13570 и SQ13571 (SEQ ID NO: 9-10) в сочетании с 6-FAM™-меченым зондом PB4655 является характерным для объекта MON 87708 в анализе TAQMAN®.

SEQ ID NO: 12 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ20632 и применяемого для идентификации зиготности объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 13 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ20636 и применяемого для идентификации зиготности сои дикого типа и объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 14 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ20637 и применяемого для идентификации зиготности сои дикого типа.

SEQ ID NO: 15 является последовательностью зонда, обозначаемого как зонд PB10130 и применяемого для анализа зиготности объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 16 является последовательностью зонда, обозначаемого как зонд PB10131 и применяемого для анализа зиготности сои дикого типа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Для лучшего определения изобретения и руководства специалистам в данной области в практическом осуществлении изобретения предоставляют следующие определения и способы. Если не указано иначе, термины следует понимать в соответствии с общепринятым применением специалистами в соответствующей области техники.

Изобретение относится к трансгенному объекту сои MON 87708, проявляющему коммерчески приемлемую устойчивость к применению гербицида дикамба. Объект содержит одиночную инсерцию трансгенной ДНК в хромосому/геном идиоплазмы сои. "Объект" получают: (i) трансформацией растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, включающей интересующий трансген, (ii) восстановлением популяции растений, получаемых от инсерции трансгена в геном растения, и (iii) селекцией конкретного растения, отличающегося инсерцией трансгена в конкретном положении в геном растения. Термин "объект" относится к исходному трансформанту, включающему трансген, встроенный в конкретном положении в геном растения. Термин "объект" также относится к потомству трансформанта, включающему трансген, встроенный в конкретном положении в геном растения. Такое потомство можно получать половым ауткроссингом между трансформантом или его потомством и другим растением. Таким другим растением может являться трансгенное растение, содержащее тот же или другой трансген, и/или нетрансгенное растение, такое как один из различных сортов. Даже после повторного обратного скрещивания с реккурентным родителем, встроенная ДНК и фланкирующая ДНК из трансформированного родителя присутствуют в потомстве от скрещивания в том же геномном положении.

Как применяют в настоящем документе, термин "соя" обозначает Glycine max и включает все сорта растений, которые можно скрещивать с соей, включая дикие сорта сои, а также растения, принадлежащие к Glycine, позволяющие осуществлять скрещивание между видами.

Термин "объект" также относится к молекуле ДНК из исходного трансформанта, содержащей встроенную ДНК и фланкирующую геномную ДНК сои, непосредственно прилегающую к каждой стороне встроенной ДНК. Данную молекулу ДНК получают встраиванием трансгенной ДНК в геном растения сои, т.е. трансформацией. Таким образом, данная молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, специфичную для объекта и уникальную для генома растения сои, в который встраивают трансгенную ДНК, поскольку данная нуклеотидная последовательность содержит последовательность и конкретной области геномной ДНК сои, и трансгенной ДНК инсерции. Таким образом, расположение встроенной ДНК в объекте сои MON 87708 в отношении окружающей ДНК генома растения сои является специфичным и уникальным для объекта сои MON 87708. Данная молекула ДНК также является составной частью хромосомы объекта сои MON 87708 и в связи с этим является стационарной в растении и может передаваться потомству растения.

Объект MON 87708 содержит трансген, придающий устойчивость к применению гербицида дикамба к растению сои. "Дикамба" относится к 3,6-дихлор-2-метоксибензойной кислоте. Дикамба является синтетическим ауксиновым гербицидом, применимым для контроля широколистных сорняков. Растения сои трансформировали монооксигеназой дикамбы (DMO), ферментом, клонированным из Stenotrophomonas maltophilia, как правило, обнаруживаемого в грунтовой ризосфере. Монооксигеназа дикамбы является ферментом, катализирующим деактивацию дикамбы посредством реакции O-деметилирования негербицидного соединения 3,5-дихлорсалициловой кислоты. В некоторых регионах мира семена вредоносных видов сорняков могут контаминировать собранные семена сои, которые могут влиять на здоровье и питание животных, которых кормят контаминированными товарами сои. Данные растения можно удалять с поля сои обработкой гербицидом дикамба. Члены данной группы вредоносных сорняков включают Cardaria spp., Heliotropium spp., Centaurea spp., Senecio spp., Crotalaria spp., Solanum spp., Xanthium spp., Amsinckia spp., Cassia spp., Sesbania spp., Datura spp., Ricinus spp., Argemone spp., Corchorus spp., Impomoea spp. и Echium spp.

Как применяют в настоящем документе, термин "рекомбинантный" относится к форме ДНК, и/или белку, и/или организму, не обнаруживаемых в природе в норме и в связи с этим получаемых вмешательством человека. Таким вмешательством человек может получать рекомбинантную молекулу ДНК и/или рекомбинантное растение. Как применяют в настоящем документе, "рекомбинантная молекула ДНК" является молекулой ДНК, содержащей сочетание молекул ДНК, не существующих в природе совместно, и является результатом вмешательства человека, например, молекулой ДНК, состоящей из сочетания, по меньшей мере, двух гетерологичных друг другу молекул ДНК, и/или молекулой ДНК, искусственно синтезированной и содержащей полинуклеотидную последовательность, отличающуюся от полинуклеотидной последовательности, существующей в природе в норме, и/или молекулой ДНК, содержащей трансген, искусственно встроенный в геномную ДНК клетки-хозяина и соответствующую фланкирующую ДНК генома клетки-хозяина. Примером рекомбинантной молекулы ДНК является описываемая в настоящем документе молекула ДНК, полученная при инсерции трансгена в геномную ДНК сои, которая в конечном итоге может приводить к экспрессии молекулы рекомбинантной РНК и/или белка в таком организме. Как применяют в настоящем документе, "рекомбинантное растение" является растением, не существующим в природе в норме, являющимся результатом вмешательства человека и содержащим трансген и/или гетерологичную молекулу ДНК, встроенную в его геном. В результате таких геномных изменений, рекомбинантное растение заметно отличается от родственного растения дикого типа. Примером рекомбинантного растения является растение сои, описываемое в настоящем документе как объект MON 87708.

Как применяют в настоящем документе, термин "трансген" относится к нуклеотидной молекуле, искусственно встроенной в геном клетки-хозяина. Такой трансген может являться гетерологичным клетке-хозяину. Термин "трансгенное растение" относится к содержащему такой трансген растению.

Как применяют в настоящем документе, термин "гетерологичный" относится к первой молекуле, не обнаруживаемой в природе в норме в сочетании со второй молекулой. Например, молекулу можно получать из первых видов и встраивать в геном вторых видов. Таким образом, молекула будет гетерологичной хозяину и искусственно встроенной в геном клетки-хозяина.

Как применяют в настоящем документе, термин "химерный" относится к отдельной молекуле ДНК, получаемой слиянием первой молекулы ДНК со второй молекулой ДНК, где ни первую, ни вторую молекулу ДНК не обнаруживают в норме в такой конфигурации, т.е. слитой с другой. Таким образом, химерная молекула ДНК является новой молекулой ДНК, в ином случае не обнаруживаемой в норме в природе.

Изобретение относится к молекулам ДНК и их соответствующим нуклеотидным последовательностям. Как применяют в настоящем документе, термин "ДНК", "молекула ДНК", "нуклеотидная молекула" относится к молекуле ДНК геномного или синтетического происхождения, т.е. полимеру дезоксирибонуклеиновых оснований или полинуклеотидной молекуле, читаемой с 5'-конца (в обратном направлении) к 3'-концу (в прямом направлении). Как применяют в настоящем документе, термин "последовательность ДНК", "нуклеотидная последовательность" или "полинуклеотидная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. Применяемая в настоящем документе номенклатура предусмотрена Разделом 37 Кодекса федеральных нормативных актов США § 1.822 и изложена в таблицах в WIPO Standard ST.25 (1998), Приложение 2, Таблицы 1 и 3. Как правило, нуклеотидные последовательности по изобретению, предоставляемые как SEQ ID NO: 1-8, и их фрагменты, описывают со ссылкой только на одну цепь из двух комплементарных нуклеотидных цепей. Косвенно, комплементарные последовательности (т.е. последовательности комплементарной цепи), также обозначаемые в данной области как обратные комплементарные последовательности, находятся в объеме изобретения и определенно предназначены для включения в объем заявленного объекта изобретения.

Нуклеотидную последовательность, соответствующую полной нуклеотидной последовательности встроенной трансгенной ДНК и значительным сегментам геномной ДНК сои, фланкирующей конец встроенной трансгенной ДНК, предоставляют в настоящем документе как SEQ ID NO: 6. Ее часть является встроенной трансгенной ДНК, предоставляемой как SEQ ID NO: 5. Нуклеотидную последовательность геномной ДНК сои, физически связанную фосфодиэфирной связью с 5'-концом встроенной трансгенной ДНК и, таким образом, фланкирующую его, представляют, как указано в SEQ ID NO: 3. Нуклеотидную последовательность геномной ДНК сои, физически связанную фосфодиэфирной связью с 3'-концом встроенной трансгенной ДНК и, таким образом, фланкирующую его, представляют, как указано в SEQ ID NO: 4.

Объект сои MON 87708 дополнительно содержит две области, одну, охватывающую 5'-положение, и одну, охватывающую 3'-положение, где трансгенную ДНК встраивают в геномную ДНК, обозначаемые в настоящем документе как 5'- и 3'-соединение, соответственно. "Последовательность соединения" или "область соединения" относится к последовательности ДНК и/или соответствующей молекуле ДНК, охватывающей встроенную трансгенную ДНК и прилегающую фланкирующую геномную ДНК. Последовательности соединения условно можно представлять двумя последовательностями 60 нуклеотидов, предоставляемыми как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, каждая представляющая собой 30 нуклеотидов фланкирующей геномной ДНК, прилегающей к 30 нуклеотидам встроенной ДНК и непрерывной с ними. Альтернативно, последовательности соединения условно можно представлять двумя последовательностями 100 нуклеотидов, предоставляемыми как SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, каждая представляющая собой 50 нуклеотидов фланкирующей геномной ДНК, прилегающей к 50 нуклеотидам встроенной ДНК и непрерывной с ними. Эти нуклеотиды соединены фосфодиэфирной связью и присутствуют в объекте сои MON 87708 как часть генома. В сое идентификация одной или нескольких SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 в образце, полученном из растения сои, семян или части растения, свидетельствует о том, что ДНК получали из объекта сои MON 87708, и она является характерной для наличия в образце ДНК из объекта сои MON 87708. Таким образом, изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8. Любой сегмент ДНК, полученный из трансгенного объекта сои MON 87708, достаточный для того, чтобы содержать SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, находится в объеме изобретения. Кроме того, любой полинуклеотид, содержащий последовательность, комплементарную любым последовательностям, описываемым в данном параграфе, находится в объеме изобретения. На фиг.1 представлено физическое расположение SEQ ID NO: 1-5 и 7-8 относительно SEQ ID NO: 6, расположенной от 5' к 3'.

Изобретение относится к примерам молекул ДНК, которые можно применять в качестве праймеров или зондов для определения в образце наличия ДНК, полученной из растения сои объекта MON 87708. Такие праймеры или зонды являются специфичными для целевой последовательности нуклеиновой кислоты и в связи с этим применимы для идентификации последовательности нуклеиновой кислоты объекта сои MON 87708 способами по изобретению, описываемыми в настоящем документе.

Как правило, "праймер" является высокоочищенным выделенным полинуклеотидом, сконструированным для применения в конкретных способах отжига или гибридизации, включающих термическую амплификацию. Можно применять пару праймеров с матрицей ДНК, такой как образец геномной ДНК сои, в термической амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), для получения ампликона, где ампликон, получаемый в такой реакции, будет обладать последовательностью ДНК, соответствующей последовательности матрицы ДНК, находящейся между двумя участками гибридизации праймеров на матрице. Как применяют в настоящем документе, "ампликон" является частью или фрагментом ДНК, синтезированным с применением способов амплификации. Ампликон по изобретению содержит, по меньшей мере, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8. Как правило, праймер конструируют для гибридизации с комплементарной целевой цепью ДНК для образования гибрида между праймером и целевой цепью ДНК, и наличие праймера является точкой распознавания полимеразой для начала элонгации праймера (т.е. полимеризации дополнительных нуклеотидов в удлиняющейся нуклеотидной молекуле) с применением целевой цепи ДНК в качестве матрицы. Как применяют в настоящем изобретении, пары праймеров предназначены для обозначения двух праймеров, связывающих противоположные цепи двухцепочечного нуклеотидного сегмента в целях последовательной амплификации полинуклеотидного сегмента между положениями, целевыми для связывания отдельных членов пары праймеров, как правило, в термической реакции амплификации или других общепринятых способах амплификации нуклеиновых кислот. Примеры молекул ДНК, применимых в качестве праймеров, предоставляют как SEQ ID NO: 9-10. Пара праймеров, предоставляемая как SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, применима в качестве первой молекулы ДНК и второй молекулы ДНК, отличающейся от первой молекулы ДНК, и каждая обладает достаточной длиной непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6 для функционирования в качестве ДНК-праймеров, с помощью которых при совместном применении в термической реакции амплификации с матрицей ДНК, получаемой из объекта сои MON 87708, получают ампликон, содержащий SEQ ID NO: 2.

"Зонд" является выделенной нуклеиновой кислотой, комплементарной цепи целевой нуклеиновой кислоты. Зонды по изобретению включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие материалы зондов, специфически связывающиеся с целевой последовательностью ДНК, и определение такого связывания может являться применимым в диагностике, различении, определении или подтверждении наличия такой целевой последовательности ДНК в конкретном образце. Зонд можно прикреплять к общепринятой детектируемой метке или репортерной молекуле, например, радиоактивному изотопу, лиганду, хемилюминесцентному средству или ферменту. Пример молекулы ДНК, применимой в качестве зонда, предоставляют как SEQ ID NO: 11.

Зонды и праймеры по изобретению могут обладать полной идентичностью последовательностей с целевой последовательностью, хотя общепринятыми способами можно конструировать праймеры и зонды, отличающиеся от целевой последовательности, сохраняющие способность гибридизоваться преимущественно с целевыми последовательностями. Для того чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила в качестве праймера или зонда, ей только необходимо являться достаточно комплементарной в последовательности, чтобы являться способной образовывать стабильную двухцепочечную структуру в конкретных применяемых концентрациях растворителя и соли. Для идентификации в образце наличия трансгенной ДНК из объекта сои MON 87708 можно применять любой общепринятый способ гибридизации или амплификации нуклеиновой кислоты. Как правило, зонды и праймеры составляют, по меньшей мере, приблизительно 11 нуклеотидов, по меньшей мере, приблизительно 18 нуклеотидов, по меньшей мере, приблизительно 24 нуклеотида, или, по меньшей мере, приблизительно 30 нуклеотидов или больше. Такие зонды и праймеры специфически гибридизуют с последовательностью ДНК в строгих условиях гибридизации. Общепринятые строгие условия описывают в Sambrook et al., 1989 и в Haymes et al.: Nucleic acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Как применяют в настоящем документе, две молекулы нуклеиновой кислоты способны специфически гибридизоваться друг к другу, если две молекулы способны образовывать антипараллельную двухцепочечную структуру нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты "комплементарна" другой молекуле нуклеиновой кислоты, если они проявляют полную комплементарность. Как применяют в настоящем документе, молекулы проявляют "полную комплементарность", когда каждый нуклеотид одной из молекул комплементарен нуклеотиду другой. Две молекулы "минимально комплементарны", если они могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, позволяющей им оставаться отожженными друг с другом, по меньшей мере, при общепринятых условиях "пониженной строгости". Аналогично, молекулы являются "комплементарными", если они могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, позволяющей им оставаться отожженными друг с другом, по меньшей мере, при общепринятых условиях "повышенной строгости". Таким образом, отклонения от полной комплементарности являются допустимыми при условии, что такие отклонения не устраняют полностью способность молекул образовывать двухцепочечную структуру.

Как применяют в настоящем документе, термин "выделенный" относится к молекуле, по меньшей мере, частично отделенной от других молекул, в норме с ней ассоциированных в своем естественном или природном состоянии. В одном из вариантов осуществления термин "выделенный" относится к молекуле ДНК, по меньшей мере, частично отделенной от нуклеиновых кислот, в норме фланкирующих молекулу ДНК в своем естественном или природном состоянии. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с регуляторными или кодирующими последовательностями, с которыми они в норме не ассоциированы, например, в результате рекомбинантных способов, в настоящем документе считают выделенными. Такие молекулы считают выделенными даже при встраивании в хромосому клетки-хозяина или присутствии в растворе нуклеиновой кислоты с другими молекулами ДНК.

Для выделения и манипуляций с молекулой ДНК или ее фрагментом, описываемым в настоящем изобретении, можно применять любое количество способов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, технологию ПЦР (полимеразная цепная реакция) можно применять для амплификации конкретной исходной молекулы ДНК и/или для получения вариантов исходной молекулы. Молекулы ДНК или их фрагменты также можно получать другими способами, такими как прямой синтез фрагмента химическими средствами, который общепринято проводят с применением автоматического синтезатора олигонуклеотидов.

Таким образом, молекулы ДНК и соответствующие нуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе являются применимыми, в частности, для идентификации объекта сои MON 87708, селекции сортов растений или гибридов, содержащих объект сои MON 87708, определения наличия в образце ДНК, полученной из трансгенного объекта сои MON 87708, и контроля образцов на наличие и/или отсутствие объекта сои MON 87708 или частей растений, полученных из растений объекта сои MON 87708.

Изобретение относится к растениям сои, потомству, семенам, растительным клеткам, частям растений (таким как пыльца, семязачаток, стручок, ткань цветка, ткань корня, ткань стебля и ткань листа) и товарам. Данные растения, потомство, семена, растительные клетки, части растений и товары содержат определяемое количество полинуклеотида по изобретению, т.е. такого как полинуклеотид, обладающий, по меньшей мере, одной из последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-8. Растения, потомство, семена, растительные клетки и части растений по изобретению также могут содержать один или несколько дополнительных трансгенов. Такой трансген может являться любой нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок или молекулу РНК, придающей желаемое свойство, включая, в качестве неограничивающих примеров, повышенную устойчивость к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную засухоустойчивость, повышенное качество семян, улучшенное питательное качество и/или повышенную устойчивость к гербицидам, где желаемое свойство измеряют в отношении растения сои без такого дополнительного трансгена.

Изобретение относится к растениям сои, потомству, семенам, растительным клеткам и части растения, такой как пыльца, семязачаток, стручок, ткань цветка, корня или стебля и листья, полученным из трансгенного растения объекта сои MON 87708. Показательный образец семян объекта сои MON 87708 депонирован в соответствие с Budapest Treaty в целях предоставления изобретения. Хранилищем, выбранным для получения депозита, является American Type Culture Collection (ATCC) по адресу 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA, Zip Code 20110. В хранилище ATCC семенам объекта MON 87708 присваивали № доступа PTA-9670.

Изобретение относится к микроорганизму, содержащему молекулу ДНК, обладающую SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, присутствующей в его геноме. Примером такого микроорганизма является трансгенная растительная клетка. Микроорганизмы, такие как растительная клетка по изобретению, применимы во многих промышленных областях применения