Лекарственный препарат для лечения и/или профилактики рака

Лекарственный препарат для лечения и/или профилактики рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к лекарственному препарату для лечения и/или профилактики рака, характеризуемому сочетанием антитела или его фрагмента, обладающего иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1, с противоопухолевым средством, и к применению такого препарата.

Уровень техники

Рак является лидирующей причиной смертности. Проводимая в настоящее время терапия рака заключается в сочетании основного хирургического вмешательства с лучевой терапией и химиотерапией. Кроме того, современное лечение включает в себя проведение сходного терапевтического лечения всех пациентов, имеющих рак одного и того же типа и на одной и той же стадии. По меньшей мере, в случае 40% пациентов первичная терапия оказывается неудачной, и поэтому их подвергают воздействию дополнительной серии лечения. Если лечение пациентов снова оказывается неудачным, появляются метастазы рака, в конце концов приводя к повышенной вероятности смертельного исхода. Таким образом, современная лучевая терапия и химиотерапия не могут быть совместимы с различными типами рака или отдельными пациентами с раком, и хирургическое лечение само по себе в настоящее время также недостаточно для полного излечения рака почти во всех случаях.

Различные основанные на антителах лекарственные средства, мишенью которых являются антигенные белки на злокачественных клетках, для лечения рака появились во всем мире в качестве способа преодоления указанных выше проблем в лечении рака. Конкретными примерами являются следующие средства. Было показано, что герцептин (зарегистрированная торговая марка), содержащий в качестве активного ингредиента моноклональное антитело, специфично связывающееся с Her2, продажи которого были одобрены в 1998 году в качестве терапевтического средства для пациентов с метастатическим раком молочной железы, оказывает такое клиническое действие, что герцептин может снижать количество смертельных исходов у пациентов с рецидивирующим и метастатическим раком молочной железы среди пациентов с метастатическим раком молочной железы, экспрессирующими Her2. Также было продемонстрировано, что герцептин не вызывает каких-либо других тяжелых побочных эффектов, кроме токсичности для сердца, по сравнению с обычными химиотерапевтическими средствами. В качестве другого заслеживающего внимания признака были показаны терапевтические эффекты комбинированного применения герцептина с химиотерапевтическими средствами против рака молочной железы (патентная литература 1-3). Однако большинство антигенных белков на злокачественных клетках, являющихся мишенью основанных на антителах лекарственных средств, таких как Her2, также экспрессируются в нормальных клетках, так что при введении антител цитотоксически повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены. В результате побочные эффекты могут вызывать беспокойство.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) экспрессируется, когда нормальные клетки в фазе покоя активируются или подвергаются клеточному делению, и он является внутриклеточным белком, который, как известно, образует внутриклеточные стрессовые гранулы с РНК в клетках для участия в транспорте мРНК и регуляции трансляции. При этом существует много других названий указанного CAPRIN-1, таких как GPI-заякоренный мембранный белок 1 или поверхностный маркерный белок 1 мембранного компонента (M11S1), поскольку такие белки были известны как якобы белки клеточной мембраны. Такие названия происходят на основании сообщения о том, что последовательность гена CAPRIN-1 соответствует мембранному белку, имеющему GPI-связывающую область и экспрессируемому в злокачественных клетках прямой и ободочной кишки (непатентная литература 1). Однако последовательность гена CAPRIN-1, представленная в указанном сообщении, оказалась неправильной, как было выявлено позднее. Недавно появилось следующее сообщение; а именно, делеция одного нуклеотида в последовательности гена CAPRIN-1, зарегистрированной в GenBank или тому подобной, вызывает сдвиг рамки, так что происходит утрата 80 аминокислот из C-конца, приводя к образованию артефакта (74 аминокислоты), который соответствует GPI-связывающей части, указанной в предыдущем сообщении, и кроме того, также присутствует другая ошибка с 5’-стороны генной последовательности, так что происходит утрата 53 аминокислот из N-конца (непатентная литература 2). Также недавно появилось сообщение о том, что белок, кодируемый последовательностью гена CAPRIN-1, зарегистрированной в GenBank или тому подобной, не является белком клеточной мембраны (непатентная литература 2).

Кроме того, на основе сообщения в непатентной литературе 1 о том, что CAPRIN-1 является белком клеточной мембраны, в патентной литературе 4 и 5 описано, что CAPRIN-1 (в качестве белка клеточной мембраны) под названием M11S1 может быть использован в качестве мишени для основанного на антителах лекарственного средства при терапии рака, хотя в рабочих примерах не описано лечение с применением антитела против данного белка. Однако, как сообщается в непатентной литературе 2, обычно полагали со времени подачи патентного документа 4 до настоящего времени, что CAPRIN-1 не экспрессируется на поверхности клетки. Содержание патентных документов 4 и 5, основанных только на неверной информации о том, что CAPRIN-1 является белком клеточной мембраны, не следует понимать как обычный уровень техники, известный специалистам в данной области.

Литература известного уровня техники

Патентная литература

Патентная литература 1: Публикация патента Японии (Kokai) No. 2006-316040A.

Патентная литература 2: патент США № 7485302.

Патентная литература 3: патент США № 7449184.

Патентная литература 4: публикация патента США № 2008/0075722.

Патентная литература 5: международная публикация WO2005/100998.

Непатентная литература

Непатентная литература 1: J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995.

Непатентная литература 2: J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004.

Сущность изобретения

Задача, решаемая изобретением

Целью настоящего изобретения является идентификация белка ракового антигена, специфично экспрессируемого на поверхности злокачественной клетки, для сочетания антитела, мишенью которого является белок ракового антигена, с противоопухолевым средством, и таким образом обеспечение применения в качестве лекарственного препарата для лечения и/или профилактики рака.

Проблема, решаемая изобретением

Целями настоящего изобретения являются: идентификация белка ракового антигена, специфично экспрессируемого на поверхности злокачественной клетки, и применение антитела, мишенью которого является белок ракового антигена, в качестве средства для лечения и/или профилактики рака.

Способы решения проблемы

В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения в настоящее время получили кДНК, кодирующую белок, который связывается с антителом, присутствующем в сыворотке собак с раком молочной железы, способом SEREX, используя как библиотеки кДНК, полученные из тканей семенников собак, так и сыворотки собак с раком молочной железы. Кроме того, авторы настоящего изобретения получили в настоящее время белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности, пронумерованные четными числами среди последовательностей SEQ ID NO: 2-30, и антитела против таких белков CAPRIN-1, на основе полученного гена собак и соответствующих гомологичных генов человека, коровы, лошади, мыши и кур. Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили в настоящее время, что белки CAPRIN-1 специфично экспрессируются в клетках рака, таких как рак молочной железы, опухоль головного мозга, лейкоз, лимфома, рак легкого, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак прямой и ободочной кишки, рак желудка и рак почек, и что часть белка CAPRIN-1 специфично экспрессируется на поверхности каждой злокачественной клетки. Таким образом, авторы изобретения в настоящее время обнаружили, что антитело или антитела против части CAPRIN-1, экспрессируемой на поверхности каждой злокачественной клетки можно сочетать с конкретным противоопухолевым средством, получая при этом значимые терапевтические эффекты при лечении рака. На основе указанных открытий было осуществлено настоящее изобретение, которое описано ниже.

Термин «рак», в используемом в настоящем описании смысле, применяют взаимозаменяемо с терминами «опухоль» или «карцинома».

Настоящее изобретение имеет следующие отличительные признаки.

(1) Лекарственный препарат для лечения и/или профилактики рака, включающий в себя сочетание антитела или его фрагмента, обладающего иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1, и одного или двух или больше типов противоопухолевых средств, при этом антитело или фрагмент и противоопухолевое средство или противоопухолевые средства объединяют вместо или используют по отдельности.

(2) Лекарственный препарат по п. (1) указанному выше, в котором антитело или его фрагмент, обладающий иммунологической реактивностью по отношению к указанному выше белку CAPRIN-1, представляет собой антитело или его фрагмент, который специфично связывается с внеклеточной областью белка CAPRIN-1, существующей на поверхности злокачественной клетки.

(3) Лекарственный препарат по п. (1) или (2), указанному выше, в котором антитело или его фрагмент, обладающий иммунологической реактивностью по отношению к указанному выше белку CAPRIN-1, представляет собой антитело или его фрагмент, который специфично связывается с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 37, во внеклеточной области белка CAPRIN-1, существующей на поверхности злокачественной клетки, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в виде SEQ ID NO: 37.

(4) Лекарственный препарат по любому из пп. (1)-(3), указанному выше, в котором указанный выше белок CAPRIN-1 является белком человека.

(5) Лекарственный препарат по любому из пп. (1)-(4), указанному выше, в котором указанным выше противоопухолевым средством являются любые противоопухолевые средства, которые описаны в настоящей публикации.

(6) Лекарственный препарат по п. (5), указанному выше, в котором противоопухолевое средство выбрано из группы, состоящей из циклофосфамида, паклитаксела, доцетаксела, винорелбина и их фармацевтически приемлемых солей и производных.

(7) Лекарственный препарат по любому из п.п. (1)-(6), указанному выше, в котором злокачественной опухолью является рак молочной железы, опухоль головного мозга, лейкоз, лимфома, рак легкого, мастоцитома, рак почек, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак желудка или рак прямой и ободочной кишки.

(8) Лекарственный препарат по любому из пп. (1)-(7), указанному выше, в котором антитело является моноклональным антителом, поликлональным антителом или рекомбинантным антителом.

(9) Лекарственный препарат по любому из пп. (1)-(8), указанному выше, в котором антитело является антителом человека, гуманизированным антителом, химерным антителом, одноцепочечным антителом или биспецифичным антителом.

(10) Способ лечения и/или профилактики рака, включающий в себя введение лекарственного препарата по любому из пп. (1)-(9), указанному выше, субъекту, у которого предполагается наличие рака.

(11) Способ по п. (10), указанному выше, включающий в себя введение субъекту антитела или его фрагмента и противоопухолевого средства, которые находятся в указанном выше лекарственном препарате, одновременно или раздельно.

Настоящее описание включают все или часть содержания, которое раскрыто в описаниях и/или на чертежах в заявке на выдачу патента Японии № 2010-023455, на основании которой настоящая заявка притязает на приоритет.

Преимущества настоящего изобретения

Согласно настоящему изобретению могут быть получены неожиданные синергетические эффекты в виде уменьшения и регрессии массивного рака без выявления значимых побочных эффектов.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает картины экспрессии генов, кодирующих белки CAPRIN-1, в нормальных тканях и в линиях опухолевых клеток. Указатель № 1 обозначает картины экспрессии генов, кодирующих белки CAPRIN-1, и указатель № 2 обозначает картины экспрессии генов GAPDH.

Фиг.2 показывает цитотоксичность, проявляемую моноклональными анти-CAPRIN-1-антителами (№1-№11), которые взаимодействуют с клеточной поверхностью линии злокачественных клеток молочной железы MDA-MB-157, которые экспрессируют CAPRIN-1. Указатель №3 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №1. Указатель №4 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела № 2. Указатель № 5 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №5. Указатель №6 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №4. Указатель № 7 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела № 5. Указатель № 8 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №6. Указатель № 9 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №7. Указатель № 10 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №8. Указатель № 11 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9. Указатель № 12 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №10. Указатель № 13 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №11. Указатель № 14 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления моноклонального антитела, которое реактивно по отношению к самому белку CAPRIN-1, но не взаимодействует с поверхностью злокачественной клетки. Указатель № 15 обозначает цитотоксическую активность, проявляемую в случае добавления PBS вместо антител.

Фиг. 3 показывает противоопухолевое действие, получаемое при использовании противоопухолевого средства циклофосфамида в сочетании с моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом, взаимодействующим с поверхностью злокачественных клеток, у голых мышей, которым трансплантировали линию злокачественных клеток молочной железы MCF-7, экспрессирующих CAPRIN-1. Указатель №16 обозначает размер опухоли у мыши при добавлении PBS вместо антитела. Указатель № 17 обозначает размер опухоли у мыши при введении циклофосфамида. Указатель № 18 обозначает размер опухоли у мыши при введении моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №2. Указатель № 19 обозначает размер опухоли у мыши при введении циклофосфамида и анти-Her2-антитела. Указатель № 20 обозначает размер опухоли у мыши при введении циклофосфамида и моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №2.

На фиг. 4 показано противоопухолевое действие, полученное при использовании противоопухолевого средства паклитаксела в сочетании с моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом, которое взаимодействует с поверхностью злокачественных клеток, у голых мышей, которым трансплантировали линию злокачественных клеток молочной железы MCF-7, экспрессирующих CAPRIN-1. Указатель № 21 обозначает размер опухоли у мыши при введении PBS вместо антитела. Указатель № 22 обозначает размер опухоли у мыши при введении паклитаксела. Указатель № 23 обозначает размер опухоли у мыши при введении моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №2. Указатель № 24 обозначает размер опухоли у мыши при введении паклитаксела и анти-Her2-антитела. Указатель № 25 обозначает размер опухоли у мыши при введении паклитаксела и моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №2.

На фиг. 5 показано противоопухолевое действие, полученное при использовании противоопухолевого средства доцетаксела в сочетании с моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом, взаимодействующим с поверхностью злокачественных клеток, у голых мышей, которым трансплантировали линию злокачественных клеток молочной железы MCF-7, экспрессирующих CAPRIN-1. Указатель № 26 обозначает размер опухоли у мыши при введении PBS вместо антитела. Указатель № 27 обозначает размер опухоли у мыши при введении доцетаксела. Указатель № 28 обозначает размер опухоли у мыши при введении моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №2. Указатель № 29 обозначает размер опухоли у мыши при введении доцетаксела и анти-Her2-антитела. Указатель № 30 обозначает размер опухоли у мыши при введении доцетаксела и моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №2.

На фиг. 6 показано противоопухолевое действие, полученное при использовании противоопухолевого средства винорелбина в сочетании с моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом, взаимодействующим с поверхностью злокачественных клеток у голой мыши, которой трансплантировали линию злокачественных клеток молочной железы MCF-7, экспрессирующих CAPRIN-1. Указатель № 31 обозначает размер опухоли у мыши при введении PBS вместо антитела. Указатель № 32 обозначает размер опухоли у мыши при введении винорелбина. Указатель № 33 обозначает размер опухоли у мыши при введении моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №2. Указатель № 34 обозначает размер опухоли у мыши при введении винорелбина и анти-Her2-антитела. Указатель № 35 обозначает размер опухоли у мыши при введении винорелбина и моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №2.

На фиг. 7 показано противоопухолевое действие, полученное при использовании противоопухолевого средства циклофосфамида в сочетании с моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом, взаимодействующим с поверхностью злокачественных клеток, у голой мыши, которой трансплантировали линию злокачественных клеток молочной железы MCF-7, экспрессирующих CAPRIN-1. Указатель № 36 обозначает размер опухоли у мыши при введении PBS вместо антитела. Указатель № 37 обозначает размер опухоли у мыши при введении циклофосфамида. Указатель № 38 обозначает размер опухоли у мыши при введении моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9. Указатель № 39 обозначает размер опухоли у мыши при введении циклофосфамида и анти-Her2-антитела. Указатель № 40 обозначает размер опухоли у мыши при введении циклофосфамида и моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9.

На фиг. 8 показано противоопухолевое действие, полученное при использовании противоопухолевого средства паклитаксела в сочетании с моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом, взаимодействующим с поверхностью злокачественных клеток, у голой мыши, которой трансплантировали линию злокачественных клеток молочной железы MCF-7, экспрессирующих CAPRIN-1. Указатель № 41 обозначает размер опухоли у мыши при введении PBS вместо антитела. Указатель № 42 обозначает размер опухоли у мыши при введении паклитаксела. Указатель № 43 обозначает размер опухоли у мыши при введении моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9. Указатель № 44 обозначает размер опухоли у мыши при введении паклитаксела и анти-Her2-антитела. Указатель № 45 обозначает размер опухоли у мыши при введении паклитаксела и моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9.

На фиг. 9 показано противоопухолевое действие, полученное при использовании противоопухолевого средства доцетаксела в сочетании с моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом, взаимодействующим с поверхностью злокачественных клеток, у голой мыши, которой трансплантировали линию злокачественных клеток молочной железы MCF-7, экспрессирующих CAPRIN-1. Указатель № 46 обозначает размер опухоли у мыши при введении PBS вместо антитела. Указатель № 47 обозначает размер опухоли у мыши при введении доцетаксела. Указатель № 48 обозначает размер опухоли у мыши при введении моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9. Указатель № 49 обозначает размер опухоли у мыши при введении доцетаксела и анти-Her2-антитела. Указатель № 50 обозначает размер опухоли у мыши при введении доцетаксела и моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9.

На фиг. 10 показано противоопухолевое действие, полученное при использовании противоопухолевого средства винорелбина в сочетании с моноклональным анти-CAPRIN-1-антителом, взаимодействующим с поверхностью злокачественных клеток, у голой мыши, которой трансплантировали линию злокачественных клеток молочной железы MCF-7, экспрессирующих CAPRIN-1. Указатель № 51 обозначает размер опухоли у мыши при введении PBS вместо антитела. Указатель № 52 обозначает размер опухоли у мыши при введении винорелбина. Указатель № 53 обозначает размер опухоли у мыши при введении моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9. Указатель № 54 обозначает размер опухоли у мыши при введении винорелбина и анти-Her2-антитела. Указатель № 55 обозначает размер опухоли у мыши при введении винорелбина и моноклонального анти-CAPRIN-1-антитела №9.

Способ осуществления изобретения

Противоопухолевую активность антитела против полипептида, представленного любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-30, пронумерованных четными числами, используемого в настоящем изобретении, можно оценить благодаря определению in vivo подавления опухолевого роста у животных с раком или благодаря исследованию того, проявляет ли антитело или не проявляет цитотоксичность посредством иммуноцитов или комплемента по отношению к опухолевым клеткам, экспрессирующим полипептид, in vitro, как описано далее.

В данном контексте нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих белки, содержащие аминокислотные последовательности, пронумерованные четными числами (т.е. SEQ ID NO: 2, 4, 6, ... , 28, 30) среди последовательностей SEQ ID NO: 2-30, представлены последовательностями, пронумерованными нечетными числами (т.е. SEQ ID NO: 1, 3, 5, ... , 27, 29) среди последовательностей SEQ ID NO: 1-29.

Аминокислотные последовательности, которые представлены в виде SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и 14 в списке последовательностей, приведенном в настоящем описании, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в виде полипептидов, которые связываются с антителами, специфично присутствующими в сыворотке от собаки с раком, способом SEREX с использованием библиотеки кДНК из ткани семенников собаки и сыворотки собаки с раком молочной железы. Аминокислотные последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 2 и 4, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в виде гомологов человека. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 16, является аминокислотной последовательностью CAPRIN-1, выделенной в качестве гомолога, присутствующего у коров. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 18, является аминокислотной последовательностью CAPRIN-1, выделенной в качестве гомолога, присутствующего у лошади. Аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 20-28, являются аминокислотными последовательностями CAPRIN-1, выделенными в качестве мышиных гомологов. Аминокислотная последовательность, представленная в виде SEQ ID NO: 30, является аминокислотной последовательностью CAPRIN-1, выделенного в качестве куриного гомолога (см. пример 1, описанный далее). Известно, что CAPRIN-1 экспрессируется, когда нормальные клетки в фазе покоя подвергаются активации или стимуляции клеточного деления.

Было известно, что CAPRIN-1 не экспрессируется на поверхности клеток; однако исследование, проведенное авторами настоящего изобретения, в настоящее время показало, что часть белка CAPRIN-1 экспрессируется на поверхности различных злокачественных клеток. В настоящем изобретении предпочтительно применяют антитела, которые связываются с частью белка CAPRIN-1, экспрессируемой на поверхности злокачественных клеток. Примером неполного пептида белка CAPRIN-1, который экспрессируется на поверхности злокачественных клеток, является полипептид, состоящий из последовательности из 7 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков № (аа) 50-98 или 233-305 в аминокислотных последовательностях, представленных в виде пронумерованных четными числами последовательностей SEQ ID NO: 2-30 в списке последовательностей, за исключением последовательностей SEQ ID NO: 6 и 18. Конкретные примеры включают аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 37, и аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с указанной аминокислотной последовательностью. Примеры антитела, используемого в настоящем изобретении, включают все антитела, которые (специфично) связываются с такими пептидами (или (специфично) узнают такие пептиды, или обладают иммунологической реактивностью по отношению к таким пептидам) и проявляют противоопухолевую активность.

Описанное выше анти-CAPRIN-1-антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть антителом любого типа, при условии, что оно может проявлять противоопухолевую активность. Примеры таких антител включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антител, такие как синтетические антитела, полиспецифичные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), человеческие антитела и их фрагменты, такие как Fab, F(ab’)₂ и Fv. Такие антитела и их фрагменты могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. В настоящем изобретении требуются антитела, способные специфично связываться с белком CAPRIN-1. Предпочтительно они являются моноклональными антителами. Также можно применять поликлональные антитела, при условии, что могут быть стабильно продуцированы гомогенные антитела. Также в том случае, когда субъектом является человек, требуются человеческие антитела или гуманизированные антитела, чтобы избежать, или чтобы подавить отторжение.

Термин «специфично связывающееся с белком CAPRIN-1» в используемом в настоящем описании смысле означает, что антитело специфично связывается с белком CAPRIN-1, но по существу не связывается с другими белками, отличными от белка CAPRIN-1.

Противоопухолевую активность антитела, которое можно применять в настоящем изобретении, можно оценивать, как описано ниже, путем исследования in vivo подавления роста опухоли у животных с раком или путем исследования того, проявляет ли оно или не проявляет цитотоксическую активность in vitro, которая опосредована иммуноцитами или комплементом, по отношению к опухолевым клеткам, экспрессирующим полипептид.

Кроме того, примерами субъектов для лечения и/или профилактики рака согласно настоящему изобретению являются млекопитающие, такие как человек, комнатные животные, домашние животные и животные для соревнований. Предпочтительным субъектом является человек.

Получение антигенов и антител, лекарственных препаратов и тому подобного, относящихся к настоящему изобретению, описано ниже.

Получение антигенов для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения анти-CAPRIN-1-антител, применяемых в настоящем изобретении, могут быть получены из любого вида животного без особого ограничения, такого как человек, собаки, крупный рогатый скот, лошади, мыши, крысы и куры. Однако белки или их фрагменты предпочтительно выбраны с учетом совместимости с исходными клетками, используемыми для слияния клеток. В общем, предпочтительными являются полученные от млекопитающих белки и, в частности, предпочтительным является белок, полученный из организма человека. Например, когда CAPRIN-1 является CAPRIN-1 человека, можно использовать белок CAPRIN-1 человека, его неполный пептид или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов можно получить, осуществляя доступ в GenBank (NCBI, U.S.A.) и используя такие алгоритмы, как BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

В настоящем изобретении на основе нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1 человека определили, что нуклеиновая кислота-мишень или белок-мишень содержит последовательность, имеющую 70-100%, предпочтительно 80-100%, более предпочтительно 90-100%, еще более предпочтительно 95-100% (например, 97-100%, 98-100%, 99-100% или 99,5-100%) идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью ORF или зрелой части CAPRIN-1 человека. В используемом в настоящем описании смысле термин «идентичность последовательности в %» относится к процентному содержанию (%) идентичных аминокислот (или нуклеотидов) относительно общего количества аминокислот (или нуклеотидов) при выравнивании двух последовательностей для достижения наибольшего сходства с введением или без введения пробелов.

Длина фрагмента белка CAPRIN-1 варьирует от длины аминокислот эпитопа (антигенной детерминанты), который является минимальной единицей, узнаваемой антителом, до длины, составляющей менее полной длины белка. Термин «эпитоп» относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно у человека, и минимальная единица эпитопа состоит примерно из 7-12 (непрерывно следующих друг за другом) аминокислот, например, 8-11 (непрерывно следующих друг за другом) аминокислот. Примеры неполной последовательности белка CAPRIN-1, специфично связывающейся с антителом, включают неполную последовательность, содержащую, по меньшей мере, примерно 7-12 аминокислот из аминокислотной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 37, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 37.

Полипептиды, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека или неполные пептиды белка, могут быть синтезированы способом химического синтеза, таким как Fmoc-способ (способ с использованием флуоренилметилоксикарбонила) или tBoc-способ (способ с использованием трет-бутилоксикарбонила) (под редакцией The Japanese Biochemical Society, Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, TOKYO KAGAKU DOZIN (Japan), 1981). Альтернативно указанные выше полипептиды также могут быть синтезированы обычными способами с использованием различных коммерчески доступных синтезаторов пептидов. Кроме того, с применением известных способов генетической инженерии (например,

получают полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид, и затем включают в экспрессирующий вектор, который затем вводят в клетку-хозяина, чтобы получить представляющий интерес полипептид в клетке-хозяине, и затем извлекают его.

Полинуклеотиды, кодирующие указанные выше полипептиды, можно легко получить известными способами генетической инженерии или обычными способами с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, может быть получена в ПЦР с использованием библиотеки хромосомной ДНК человека или кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы можно было амплифицировать нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Условия ПЦР могут быть соответствующим образом определены. Например, условия ПЦР включают в себя проведение 30 следующих циклов реакции: денатурация при 94°C в течение 30 секунд; отжиг при 55°C в течение периода времени от 30 секунд до 1 минуты; и элонгация при 72°C в течение 2 минут, с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимеразы или Pfu-полимеразы) и буфера для ПЦР, содержащего Mg²⁺, с последующим проведением реакции при 72°C в течение 7 минут. Однако условия ПЦР не ограничены приведенным выше примером. Способы ПЦР, условия и тому подобное описаны в публикации Ausubel с соавторами (Short Protocols in Molecular Biology, 3^rd Edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons (в частности в главе 15)).

Также на основе информации о нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности, представленной в виде последовательностей SEQ ID NO: 1-30 в списке последовательностей, приведенном в настоящем описании, получают соответствующие зонды или праймеры и затем, используя их, проводят скрининг библиотеки кДНК человека или тому подобной, с тем, так что можно выделить требуемую ДНК. Библиотеку кДНК предпочтительно конструируют из клеток, органов или тканей, которые экспрессируют белки, имеющие последовательности SEQ ID NO: 2-30, пронумерованные четными числами. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани, полученные из семенников, и рак или опухоли, такие как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легкого, рак прямой и ободочной кишки и тому подобные. Способы, такие как получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование генов-мишеней, известны специалисту в данной области и могут быть осуществлены способами, описанными Sambrook с соавторами (Molecular Cloning, 2^nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989)), Ausbel с соавторами (выше), и тому подобными. Из полученной таким образом ДНК может быть получена ДНК, кодирующая белок CAPRIN-1 человека или его неполный пептид.

Клетками-хозяевами могут быть любые клетки, при условии, что они могут экспрессировать указанный выше полипептид. Примерами прокариотических клеток являются без ограничения клетки Escherichia coli и тому подобные. Примерами эукариотических клеток являются без ограничения клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны (COS1) и клетки яичника китайского хомячка (CHO), линия клеток почки плода человека (HEK293), линии клеток кожи плода мыши (NIH3T3), дрожжевые клетки, такие как почкующиеся дрожжи и делящиеся дрожжи, клетки шелкопряда и ооциты Xenopus.

В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев экспрессирующий вектор, используемый в настоящем изобретении, содержит начало, реплицируемое в прокариотических клетках, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт множественного клонирования, терминатор, ген лекарственной резистентности, ген, комплементирующий ауксотрофность, и тому подобное. Примеры экспрессирующего вектора для Escherichia coli включают вектор на основе pUC, pBluescript II, систему экспрессии pET и систему экспрессии pGEX. ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, включают в такой экспрессирующий вектор, прокариотические клетки-хозяева трансформируют вектором, полученные таким образом трансформированные клетки культивируют и, таким образом, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в прокариотических клетках-хозяевах. В то же время полипептид также может быть экспрессирован в виде белка, слитого с другим белком.

При использовании в качестве клеток-хозяев эукариотических клеток экспрессирующий вектор, используемый в настоящем изобретении, представляет собой экспрессирующий вектор для эукариотических клеток, который содержит промотор, область сплайсинга, сайт добавления поли(A) и тому подобное. Примеры такого экспрессирующего вектора включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Подобно упоминаемому выше случаю ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, включают в такой экспрессирующий вектор, эукариотические клетки-хозяева трансформируют вектором, полученные таким образом трансформированные клетки культивируют и таким образом, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в эукариотических клетках-хозяевах. Когда используют векторы pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или тому подобные в качестве экспрессирующего вектора, указанный выше полипептид может быть экспрессирован в виде слитого белка, к которому может быть добавлена метка из числа различных меток, таких как His-метка (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-метка, myc-метка, HA-метка и GFP.

Для введения экспрессирующего вектора в клетки-хозяев