Структуры слитого белка шелка пауков для связывания с органической мишенью

Структуры слитого белка шелка пауков для связывания с органической мишенью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области рекомбинантных слитых белков, и, более конкретно, к слитым белкам, содержащим части, происходящие из белков шелка пауков (спидроинов). Настоящее изобретение относится к способам предоставления белковой структуры, которая представляет собой полимер, содержащий рекомбинантный слитый белок, который содержит части, происходящие из спидроинов. Также предусмотрены новые белковые структуры для связывания с органической мишенью.

Уровень техники

В прикладной химии белков частой проблемой является то, как создать или предоставить биологически активный пептид или белок в соответствующую область активности, как правило, к органической мишени, такой как нуклеиновая кислота, белок, комплекс белков, или комплекс белка(ов) и/или липидов и/или углеводов и/или нуклеиновой кислоты(кислот). Наиболее простым решением является предоставление просто водного раствора биологически активного пептида или белка. Однако многие применения требуют некоторых других средств для достижения желаемой цели. Например, пептиды/белки можно связывать со смесью липидов или химически иммобилизовывать на подложку.

Применения для пептидов/белков, иммобилизованных на подложку, включают методики препаративного и аналитического разделения, такие как биопроцессы, хроматография, улавливание и культура клеток, активные фильтры и диагностические способы. Структуры на основе белков внеклеточного матрикса, например коллагена, описаны в EP 704 532 и EP 985 732.

Также было предложено использовать белки шелка пауков в подложках. Шелк пауков представляет собой высококачественные природные полимеры, достигающие необычайной прочности и растяжимости вследствие комбинации сопротивления разрыву и упругости. Пауки имеют вплоть до семи различных желез, которые продуцируют различные типы шелка с различными механическими свойствами и функциями. Каркасная нить, продуцируемая большой ампуловидной железой, является наиболее прочной нитью. Она состоит из двух основных полипептидов, как правило, называемых спидроинами большой ампуловидной железы (MaSp) 1 и 2, но, например, ADF-3 и ADF-4 в Araneus diadematus. Эти белки имеют молекулярную массу в диапазоне 200-720 кДа. Белки каркасной нити пауков, или MaSp, имеют трехкомпонентный состав: неповторяющийся N-концевой домен, центральную повторяющуюся область, содержащую множество повторяющихся сегментов поли-Ala/Gly, и неповторяющийся C-концевой домен. Главным образом, полагают, что повторяющаяся область образует межмолекулярные контакты в волокнах шелках, в то время как точные функции концевых доменов менее понятны. Также полагают, что в сочетании с образованием волокон повторяющаяся область претерпевает структурное преобразование от случайной спирали и α-спиральной конформации до структуры β-слоя. C-концевая область спидроинов, главным образом, консервативна среди видов пауков и типов шелка.

В WO 07/078239 и Stark, M. et al., Biomacromolecules 8: 1695-1701, (2007) описан уменьшенный белок шелка пауков, состоящий из повторяющегося фрагмента с высоким содержанием Ala и Gly и C-концевого фрагмента белка, а также растворимые слитые белки, содержащие белок шелка пауков. Волокна белка шелка пауков образуются самопроизвольно при освобождении белка шелка пауков от его партнера по слиянию.

В Rising, A. et al., CMLS 68(2): 169-184 (2010) рассмотрены достижения в получении белков шелка пауков.

В US 2009/0263430 описано химическое присоединение фермента β-галактозидазы к пленкам укороченного белка шелка пауков. Однако химическое присоединение может требовать условий, которые неблагоприятны для стабильности и/или функции белка. Были разработаны белки, содержащие многократные повторы сегмента, происходящего из повторяющейся области белков шелка пауков, включающие сегмент связывания клеток RGD (Bini, E et al., Biomacromolecules 7:3139-3145 (2006)) и/или пептид R5 (Wong Po Foo, C et al., Proc Natl Acad Sci 103 (25): 9428-9433 (2006)) или другие белковые сегменты, вовлеченные в минерализацию (Huang, J et al., Biomaterials 28: 2358-2367 (2007); WO 2006/076711). В этих документах уровня техники пленки формируют путем растворения слитых белков в денатурирующем органическом растворителе гексафторизопропаноле (HFIP) и высушивания.

В US 2005/261479 A1 описан способ очистки рекомбинантных белков шелка, имеющих аффинную метку, вовлекающий магнитное выделение по аффинности индивидуальных белков шелка из комплексных смесей без образования волокон белка шелка или других полимерных структур.

Известные положки и ассоциированные с ними способы имеют определенные недостатки в отношении, например, экономичности, эффективности, стабильности, способности к регенерации, биоактивности и биосовместимости.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является предоставление новой белковой структуры, которая способна к селективному взаимодействию с органической мишенью.

Также задачей настоящего изобретения является предоставление белковой структуры, которая способна к селективному взаимодействию с органической мишенью, где структура образована без жестких растворителей, которые имеют непредсказуемый эффект на вторичную структуру или активность белка и/или остаются в белковой структуре.

Одной из задач настоящего изобретения является предоставление стабильной белковой структуры, которая способна к селективному взаимодействию с органической мишенью, которую можно легко регенерировать после применения, например, с помощью химической обработки.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление стабильной белковой структуры, которая является биосовместимой и подходящей для клеточной культуры и в качестве имплантата.

Другой задачей изобретения является предоставление белковой структуры с высокой плотностью находящихся на равных расстояниях функциональных групп, которые способны селективно взаимодействовать с органической мишенью.

Кроме того, задачей изобретения является предоставление белковой структуры, которая сохраняет ее способность селективного связывания при хранении при +4°C или при комнатной температуре в течение месяцев.

Также задачей изобретения является предоставление белковой структуры, которая поддается автоклавированию, т.е. сохраняет ее способность к селективному связыванию после стерилизующей тепловой обработки.

Для этих и других задач будет очевидно из представленного ниже описания, что, согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к слитому белку и белковой структуре, состоящей из полимеров, содержащих в качестве повторяющегося структурного элемента слитый белок, как указано в формуле изобретения.

В соответствии с родственным аспектом, настоящее изобретение относится к выделенной полинуклеиновой кислоте, кодирующей слитый белок, и к способу получения слитого белка, как указано в формуле изобретения.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу предоставления белковой структуры, как указано в формуле изобретения.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к аффинной среде, как указано в формуле изобретения.

Согласно одному аспекту, настоящее изобретение относится к каркасному материалу для клеток, как указано в формуле изобретения. Согласно родственному аспекту, настоящее изобретение также относится к комбинации клеток и каркасного материала для клеток в соответствии с формулой изобретения.

Согласно одному аспекту, настоящее изобретение относится к новым применениям белковой структуры и слитого белка, как указано в формуле изобретения.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу выделения органической мишени из образца, как указано в формуле изобретения.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу иммобилизации и необязательно культивирования клеток, как указано в формуле изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено выравнивание последовательностей C-концевых доменов спидроинов.

На фиг. 2 представлено выравнивание последовательностей N-концевых доменов спидроинов.

На фиг. 3 представлено макроскопическое волокно слитого белка, содержащего Z-домен.

На фиг. 4 представлен гель SDS-PAGE после очистки и анализа слитого белка, содержащего Z-домен.

На фиг. 5 представлены волокна, изготовленные из слитых белков, и контрольные волокна, которые иллюстрируют функциональность Z-домена в слитом белке.

На фиг. 6 представлена часть сформированной пленки, изготовленной из слитых белков, на дне планшета для культивирования тканей.

На фиг. 7-12 представлены невосстанавливающие гели SDS-PAGE, иллюстрирующие функциональность Z-домена в структурах слитых белков.

На фиг. 13-15 представлены невосстанавливающие гели SDS-PAGE, иллюстрирующие способность Z-домена в структурах слитых белков связывать IgG по сравнению с коммерческой матрицей с белком A.

На фиг. 16-17 представлены невосстанавливающие SDS-PAGE гели при процессах очистки на месте (CIP) структур слитых белков по сравнению с матрицей с белком A.

На фиг. 18 представлена интенсивность флуоресценции белковых пленок, смоченных биотинилированным Atto-565.

На фиг. 19 представлен график и линейная аппроксимация величин интенсивности флуоресценции для различных концентраций биотинилированного Atto-565 при связывании с пленкой слитого белка.

На фиг. 20 представлены графики величин интенсивности флуоресценции до (-) и после (+) добавления биотинилированного Atto-565 в лунки с пленками, изготовленными из слитого белка или контроля.

На фиг. 21 представлен график, на котором показана стандартная кривая и линейная аппроксимация полученных скоростей реакции при катализе свободной биотинилированной HRP в растворе.

На фиг. 22 представлен график, демонстрирующий скорость реакции при катализе биотинилированной HRP, иммобилизованной на пленке слитого белка, по сравнению с контролем.

На фиг. 23 представлен восстанавливающий гель SDS-PAGE с растворенными структурами слитых белков.

На фиг. 24-26 представлены графики, иллюстрирующие связывание IgG-HRP с пленкой слитого белка, содержащего Z-домены.

На фиг. 27 представлены графики, иллюстрирующие связывание IgG-Alexa Fluor 633 с пленкой слитого белка, содержащего Z-домены.

На фиг. 28 представлен невосстанавливающий гель SDS-PAGE, иллюстрирующий функциональность Z-домена в слитом белке после автоклавирования.

На фиг. 29 представлен гель SDS-PAGE продуктов расщепления при обработке протеазой 3C волокна слитого белка, содержащего Z-домены.

На фиг. 30 представлен невосстанавливающий гель SDS-PAGE, иллюстрирующий функциональность Z-домена в структурах слитого белка, образованных в присутствии органической мишени (IgG).

На фиг. 31-32 представлены невосстанавливающие гели SDS-PAGE, иллюстрирующие функциональность Abd-домена в структурах слитых белков.

На фиг. 33-34 представлены невосстанавливающие гели SDS-PAGE, иллюстрирующие функциональность C2-домена в структурах слитых белков.

Список прилагаемых последовательностей

SEQ ID NO

1 4Rep

2 4RepCT

3 NT4Rep

4 NT5Rep

5 NT4RepCTHis

6 NT

7 CT

8 консенсусная последовательность NT

9 консенсусная последовательность CT

10 повторяющаяся последовательность из MaSp1 Euprosthenops australis

11 консенсусная последовательность 1 G-сегмента

12 консенсусная последовательность 2 G-сегмента

13 консенсусная последовательность 3 G-сегмента

14 HisZQG4Rep4CT

15 HisZQG4Rep4CT (ДНК)

16 HisAbdQG4RepCT

17 HisAbdQG4RepCT (ДНК)

18 HisC2QG4RepCT

19 HisC2QG4RepCT (ДНК)

20 4RepCT 2

21 4RepCT 2 (ДНК)

22 M44RepCT

23 M44RepCT (ДНК)

24 modM44RepCT

25 modM44RepCT (ДНК)

26 4RepCTM4

27 4RepCTM4 (ДНК)

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение, главным образом, основано на идее, что можно получать твердые белковые структуры, способные селективно взаимодействовать с органической мишенью, в форме полимеров рекомбинантного слитого белка в качестве повторяющейся структурной единицы. Слитый белок содержит по меньшей мере одну неспидроиновую часть из более чем 30 аминокислотных остатков, которая способна селективно взаимодействовать с органической мишенью, и части, соответствующие по меньшей мере повторяющемуся и C-концевому фрагментам белка шелка пауков. Неожиданно, можно индуцировать структурную реорганизацию частей, происходящих из белка шелка пауков, и в результате образование полимерных твердых структур, в то время как неспидроиновая часть не подвергается структурной реорганизации, но сохраняет ее желаемую структуру и функцию, т.е. способность к селективному взаимодействию с органической мишенью. Белковые структуры можно получать без стадии химического присоединения или стадии способа денатурации, которая облегчает процесс и повышает вероятность получения слитого белка с сохраненной функциональностью его частей, в частности, когда функции зависят от вторичной структуры частей. Образование этих полимеров слитого белка можно тщательно контролировать, и в результате развития этой идеи были достигнуты представленные ниже новые белковые структуры, способы получения белковых структур и применения белковых структур в различных применениях и способах.

Таким образом, слитый белок по изобретению обладает как желаемой активностью селективного взаимодействия, так и присущей ему активностью твердой подложки, которые реализуются в белковой структуре в физиологических условиях. Необходимо учитывать, что является неожиданным, что активность связывания слитого белка сохраняется, несмотря на ковалентное присоединение неспидроиновой части к спидроиновой части, когда последняя структурно реорганизуется с образованием полимерных твердых структур. В действительности, стабильность при нагревании и/или химическая стабильность и/или связывающая активность части, обеспечивающей активность селективного взаимодействия, могут увеличиваться при встраивании в структуру слитого белка по изобретению. Белковая структура также обеспечивает высокую и предсказуемую плотность активности селективного взаимодействия с органической мишенью. Утрата ценных белковых частей с активностью селективного взаимодействия минимизируется, поскольку все экспрессированные белковые части связаны с твердой подложкой.

Полимеры, которые образованы из слитых белков по изобретению, представляют собой твердые структуры и пригодны по их физическим свойствам, особенно пригодна комбинация высокого сопротивления разрыву, упругости и легкой массы. Особенно пригодным признаком является то, что происходящие из спидроина части слитого белка являются биохимически стабильными и пригодными для регенерации, например, кислотой, основанием или хаотропными агентами, и пригодны для стерилизации нагреванием, например, автоклавирования при 120°C в течение 20 мин. Полимеры также пригодны вследствие их способности обеспечивать прикрепление и рост клеток. Свойства каркасной нити являются привлекательными для разработки новых материалов для медицинских или технических целей. В частности, белковые структуры по изобретению пригодны для препаративных и аналитических процессов разделения, таких как хроматография, улавливание клеток, селекция и культивирование, активные фильтры и диагностические способы. Белковые структуры по изобретению также пригодны в медицинских устройствах, таких как имплантаты и медицинские продукты, такие как системы закрытия раны, лейкопластыри, швы, повязки на рану и каркасы для иммобилизации клеток, культивирования клеток, инженерии ткани и направленной регенерации клеток.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному слитому белку, который способен к селективному взаимодействию с органической мишенью, причем этот слитый белок содержит части B, REP и CT, и необязательно NT. Настоящее изобретение также относится к белковой структуре, которая способна к селективному взаимодействию с органической мишенью, где указанная белковая структура представляет собой полимер, содержащий, и необязательно состоящий из, рекомбинантный слитый белок согласно изобретению, т.е. содержащий, и необязательно состоящий из, части B, REP и CT, и необязательно NT.

Хотя части REP и CT слитых белков в примерах всегда относятся к конкретным белкам, например белкам, происходящим из большого спидроина 1 (MaSpl) из Euprosthenops australis, считается, что настоящее описание применимо к любым структурно сходным частям для цели получения структур слитых белков по изобретению. Более того, хотя часть B, которая обеспечивает активность селективного взаимодействия слитых белков, в примерах всегда относится к конкретным белковым частям, например, частям, происходящим из белка A, белка G и стрептавидина, считается, что настоящее изобретение применимо к любой структурно и/или функционально сходной части B для цели получения структур слитых белков по изобретению, способных к селективному взаимодействию с органической мишенью.

Конкретные слитые белки согласно изобретению определяются формулами B_x-REP-B_y-CT-B_z и B_x-CT-B_y-REP-B_z, где x, y и z представляют собой целые числа от 0 до 5; и x+y+z≥1, необязательно дополнительно содержащими одну часть NT на любом конце слитого белка или между любыми двумя белковыми частями в слитом белке. Если x+y+z>1, т.е. если существует две или более частей B, они могут быть идентичными или могут отличаться. Две или более частей B могут обладать способностью селективного взаимодействия с одной и той же органической мишенью или с различными органическими мишенями. Предпочтительно, чтобы две или более части B были по существу идентичными, каждая из которых обладает способностью к селективному взаимодействию с той же органической мишенью.

В предпочтительных слитых белках по изобретению x, y и z представляют собой целые числа от 0 до 2, предпочтительно от 0 до 1. В определенных предпочтительных слитых белках по изобретению y=0. В более предпочтительных конкретных слитых белках по изобретению y=0 и либо x, либо z, равны 0, т.е. слитые белки определяются формулами B_X-REP-CT, B_X-CT-REP, REP-CT-B_Z и CT-REP-B_Z, где x и z представляют собой целые числа от 1 до 5. В предпочтительных слитых белках по изобретению y=0, x и z представляют собой целые числа от 0 до 1; и x+z=1. Таким образом, определенные предпочтительные слитые белки по изобретению определяются формулами B-REP-CT, B-CT-REP, REP-CT-B и CT-REP-B. В предпочтительных слитых белках по изобретению необязательная часть NT отсутствует.

Термин "слитый белок" в рамках настоящего изобретения означает что его получают путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, т.е. ДНК или РНК, которая создана искусственно путем комбинирования двух или более последовательностей нуклеиновых кислот, которые в норме не встречаются вместе (генетическая инженерия). Слитые белки по изобретению представляют собой рекомбинантные белки, и, таким образом, они не идентичны встречающимся в природе белкам. В частности, спидроины дикого типа не являются слитыми белками по изобретению, поскольку они не экспрессируются рекомбинантной нуклеиновой кислотой, как указано выше. Комбинированные последовательности нуклеиновых кислот кодируют различные белки, неполные белки или полипептиды с определенными функциональными свойствами. Полученный слитый белок или рекомбинантный слитый белок представляет собой единый белок с функциональными свойствами, происходящими из каждого из исходных белков, неполных белков или полипептидов. Более того, слитый белок по изобретению и соответствующие гены являются химерными, т.е. белковые/генные части происходят из по меньшей мере двух различных видов. Части REP и CT, а также необязательная часть NT происходят из белка шелка пауков. Для устранения сомнений, часть B согласно изобретению представляет собой неспидроиновый белок или полипептид, т.е. она не происходит из белка шелка пауков. В частности, часть B по изобретению не происходит из C-концевого, повторяющегося или N-концевого фрагментов белка шелка пауков.

Слитый белок, как правило, состоит из от 170 до 2000 аминокислотных остатков, как например, от 170 до 1000 аминокислотных остатков, как например, от 170 до 600 аминокислотных остатков, предпочтительно от 170 до 500 аминокислотных остатков, как например, от 170 до 400 аминокислотных остатков. Небольшой размер является преимущественным, поскольку более длинные белки, содержащие фрагменты белка шелка пауков, могут образовывать аморфные агрегаты, для растворения и полимеризации которых требуется применение жестких растворителей. Рекомбинантный слитый белок может содержать более 2000 остатков, в частности, в случаях, где белок шелка пауков содержит более одной части B и/или когда он содержит часть NT.

Термины "спидроины" и "белки шелка пауков" используют взаимозаменяемо на протяжении описания, и они охватывают все известные белки шелка пауков, включая белки шелка пауков большой ампуловидной железы, которые, как правило, сокращенно обозначают "MaSp", или "ADF" в случае Araneus diadematus. Эти белки шелка пауков большой ампуловидной железы, главным образом, бывают двух типов: 1 и 2. Эти термины, более того, включают неприродные белки с высокой степенью идентичности и/или сходства с известными белками шелка пауков.

Следовательно, термин "неспидроин" подразумевает белки, которые не происходят из белка шелка пауков, т.е. с низкой степенью (или отсутствием) идентичности и/или сходства с белками шелка пауков.

Белковая структура по изобретению способна к селективному взаимодействию с органической мишенью. Эта способность является присущей слитому белку по изобретению, и, более конкретно, части B слитого белка. Никакие взаимодействия частей REP и CT, а также необязательной части NT, с органическими молекулами не охватываются термином "способен к селективному взаимодействию с органической мишенью". Для устранения сомнений, термин "способен к селективному взаимодействию с органической мишенью" не охватывает димеризацию, олигомеризацию или полимеризацию слитых белков по изобретению, которые основаны на взаимодействиях, вовлекающих части REP и CT, а также необязательную часть NT.

Термин "органическая мишень" охватывает все химические молекулы, содержащие углерод, за исключением того, что специалист в данной области традиционно считает неорганическими молекулами, например, карбонатов, простых оксидов углерода, цианидов, алмаза и графита. Для устранения сомнений, неорганические молекулы, соли и ионы, такие как диоксид кремния и хлорид кальция, не являются органическими. Органическая мишень может представлять собой комплекс, содержащий или состоящий из органических молекул, например, рецепторный комплекс на клеточной поверхности. Органическая мишень может представлять собой мономер, димер, олигомер или полимер одного или нескольких типов органических молекул, которые могут удерживаться вместе ковалентными связями или другими типами связей. Также она, безусловно, может представлять собой просто единичную органическую молекулу. Предпочтительные органические мишени по изобретению включают, но не ограничиваются ими, нуклеиновые кислоты, белки и полипептиды, липиды и углеводы, а также их комбинации. Кроме того, предпочтительные органические мишени по изобретению включают, но не ограничиваются ими, иммуноглобулины, молекулы, содержащие иммуноглобулин или его производные, альбумин, молекулы, содержащие альбумин или его производные, биотин и молекулы, содержащие биотин или его производные или аналоги.

В контексте настоящего изобретения, "специфическое" или "селективное" взаимодействие лиганда, например, части B слитого белка по изобретению, с его мишенью означает, что взаимодействие является таким, что отличие между специфическим и неспецифическим, или между селективным и неселективным, взаимодействием становится значимым. Взаимодействие между двумя белками иногда измеряют с помощью константы диссоциации. Константа диссоциации описывает прочность связывания (или аффинность) между двумя молекулами. Как правило, константа диссоциации между антителом и его антигеном составляет от 10^-7 до 10^-11 M. Однако высокая специфичность не обязательно требует высокой аффинности. Было показано, что молекулы с низкой аффинностью (в молярном диапазоне) к их партнеру, являются настолько же специфичными, как и молекулы со значительно более высокой аффинностью. В случае настоящего изобретения, специфическое или селективное взаимодействие относится к степени, с которой конкретный способ можно использовать для определения присутствия и/или количестве конкретного белка, белка-мишени или его фрагмента, в данных условиях в присутствии других белков в образце природной или переработанной биологической или биохимической жидкости. Иными словами, специфичность или селективность представляет собой способность различать родственные белки. В настоящем описании термины “специфичный” и “селективный” иногда используют взаимозаменяемо.

Слитый белок по изобретению также может содержать один или несколько линкерных пептидов. Линкерный пептид(ы) может быть расположен между любыми частями слитого белка, например, между частями CT и REP, между двумя частями B, между частями B и CT, и между частями B и REP, или он может быть расположен на любом конце слитого белка. Если слитый белок содержит две или более частей B, линкерный пептид(ы) также может быть расположен между двумя частями B. Линкер(ы) может обеспечивать спейсер между функциональными единицами слитого белка, но также может помочь в идентификации и очистке слитого белка, как например, His-метка и/или Trx-метка. Если слитый белок содержит два или более линкерных пептида для идентификации и очистки слитого белка, предпочтительно, чтобы они были разделены спейсерной последовательностью, например His₆-спейсер-His₆-. Линкер также может представлять собой сигнальный пептид, такой как частица, распознающая сигнал, которая направляет слитый белок к мембране и/или обеспечивает секрецию слитого белка из клетки-хозяина в окружающую среду. Слитый белок также может включать участок расщепления в его аминокислотной последовательности, который обеспечивает расщепление и удаление линкер(ов) и/или других соответствующих частей, как правило, части или частей B. Различные участки расщепления известны специалисту в данной области, например, участки расщепления для химических агентов, таких как CNBr после остатков Met, и гидроксиламин между остатками Asn-Gly, участки расщепления для протеаз, таких как тромбин или протеаза 3C, и последовательности самосплайсинга, такие как последовательности самосплайсинга интеинов.

Части REP, CT и B связаны друг с другом прямо или непрямо. Прямая связь подразумевает прямое ковалентное связывание между частями без встроенных между ними последовательностей, таких как линкеры. Непрямое связывание также подразумевает, что части связаны ковалентными связями, но что существуют встроенные последовательности, такие как линкеры и/или одна или несколько дополнительных частей, например часть NT.

Часть или части B могут быть расположены внутри или на любом конце слитого белка, т.е. расположены на C-конце или на N-конце. Предпочтительно, чтобы часть или части B были расположены на N-конце слитого белка. Если слитый белок содержит один или несколько линкерный пептид(ов) для идентификации и очистки слитого белка, например, His-метку(и) или Trx-метку(и), предпочтительно, чтобы он был расположен на N-конце слитого белка.

Предпочтительный слитый белок имеет форму расположенной на N-конце части B, присоединенный линкерным пептидом из 1-30 аминокислотных остатков, как например, 1-10 аминокислотных остатков, к расположенным на C-конце частям REP и CT. Линкерный пептид может содержать участок расщепления. Необязательно, слитый белок имеет N-концевой или C-концевой линкерный пептид, который может содержать метку для очистки, такую как His-метка, и участок расщепления.

Другой предпочтительный слитый белок имеет форму расположенной на N-конце части B, связанной непосредственно с расположенными на C-конце частями REP и CT. Необязательно, слитый белок имеет N-концевой или C-концевой линкерный пептид, который может содержать метку для очистки, такую как His-метка, и участок расщепления.

Белковая структура по изобретению представляет собой полимер, содержащий в качестве повторяющейся структурной единицы рекомбинантные слитые белки по изобретению, что подразумевает, что она содержит упорядоченное множество слитых белков по изобретению, как правило, значительно больше 100 элементов слитого белка, например 1000 элементов слитого белка или более. Необязательно, полимер может содержать в качестве дополнительной повторяющейся структурной единицы дополнительные белки без части B, предпочтительно белки, происходящие из шелка пауков. Это может быть преимущественным, если часть B слитого белка является крупной и/или объемной. Эти дополнительные белки, как правило, содержат часть REP и часть CT, и необязательно часть NT. Предпочтительные дополнительные белки по изобретению могут иметь любые структуры, указанные в настоящем описании, с удаленной частью B. Предпочтительно, чтобы дополнительный слитый белок был по существу идентичным слитому белку с удаленной частью B. Однако предпочтительно, чтобы белковая структура по изобретению представляла собой полимер, состоящий из рекомбинантных слитых белков по изобретению в качестве повторяющегося структурного элемента, т.е. чтобы белковая структура по изобретению представляла собой полимер из рекомбинантного слитого белка по изобретению.

Количество слитых элементов в полимере предполагает, что белковая структура достигает значительного размера. В предпочтительном варианте осуществления белковая структура имеет размер по меньшей мере 0,1 мкм по меньшей мере по двум измерениям. Таким образом, термин "белковая структура", как используют в рамках изобретения, относится к полимерам слитого белка, имеющим толщину по меньшей мере 0,1 мкм, предпочтительно, к макроскопическим полимерам, видимым для человеческого глаза, т.е. имеющим толщину по меньшей мере 1 мкм. Термин "белковая структура" не охватывает неструктурные агрегаты или преципитаты. Хотя мономеры слитого белка растворимы в воде, понятно, что белковые структуры по изобретению представляют собой твердые структуры, т.е. не растворимы в воде. Белковые структуры представляют собой полимеры, содержащие в качестве повторяющихся структурных элементов мономеры рекомбинантных слитых белков по изобретению.

Предпочтительно, чтобы белковая структура по изобретению имела физическую форму, выбранную из группы, состоящей из волокна, пленки, пены, сети, решетки, сферы и капсулы.

Предпочтительно, чтобы белковая структура по изобретению представляла собой волокно или пленку с толщиной по меньшей мере 0,1 мкм, предпочтительно по меньшей мере 1 мкм. Предпочтительно, чтобы волокно или пленка имели толщину в диапазоне 1-400 мкм, предпочтительно 60-120 мкм. Предпочтительно, чтобы волокна имели длину в диапазоне 0,5-300 см, предпочтительно 1-100 см. Другие предпочтительные диапазоны представляют собой 0,5-30 см и 1-20 см. Волокно обладает способностью оставаться неизмененным в ходе физического манипулирования, т.е. его можно использовать для прядения, тканья, скручивания, вязки и сходных процессов. Пленка является преимущественной в том, что она является липкой и прилипает к твердым структурам, например, к пластмассе микропланшетов для титрования. Это свойство пленки облегчает процессы промывания и регенерации и в высокой степени пригодно для целей разделения. Особенно пригодной белковой структурой является пленка или волокно, где часть B представляет собой Z-домен, происходящий из белка A стафилококков, или белкового фрагмента, имеющего по меньшей мере 70% идентичность с ним, см. например примеры 1-6.

Также предпочтительно, чтобы белковая структура по изобретению имела прочность на растяжение выше 1 МПа, предпочтительно выше 2 МПа, более предпочтительно 10 Мпа или выше. Предпочтительно, чтобы белковая структура по изобретению имела прочность на растяжение выше 100 МПа, более предпочтительно 200 Мпа или выше.

Часть REP представляет собой белковый фрагмент, содержащий от 70 до 300 аминокислотных остатков, и происходит из повторяющегося фрагмента белка шелка пауков. Это подразумевает, что часть REP имеет повторяющийся характер с чередованием между богатыми аланином участками и богатыми глицином участками. Часть REP, как правило, содержит более 70, как например, более 140, и менее 300, предпочтительно менее 240, как например, менее 200, аминокислотных остатков, и сама по себе может быть подразделена на несколько L (линкерных) сегментов, A (богатых аланином) сегментов и G (богатых глицином) сегментов, как более подробно объяснено ниже. Как правило, указанные линкерные сегменты, которые являются необязательными, расположены на концах части REP, в то время как остальные сегменты в свою очередь являются богатыми аланином и богатыми глицином. Таким образом, часть REP, главным образом, может иметь следующие структуры, где n представляет собой целое число:

L(AG)_nL, как например, LA₁G₁A₂G₂A₃G₃A₄G₄A₅G₅L;

L(AG)_nAL, как например, LA₁G₁A₂G₂A₃G₃A₄G₄A₅G₅A₆L;

L(GA)_nL, как например, LG₁A₁G₂A₂G₃A₃G₄A₄G₅A₅L; или

L(GA)_nGL, как например, LG₁A₁G₂A₂G₃A₃G₄A₄G₅A₅G₆L.

Следовательно, некритично то, что богатый аланином или богатый глицином сегмент находится рядом с N-концевым или C-концевым линкерными сегментами. Предпочтительно, чтобы n представляло собой целое число от 2 до 10, предпочтительно от 2 до 8, предпочтительно от 4 до 8, более предпочтительно, от 4 до 6, т.е. n=4, n=5 или n=6.

В предпочтительных вариантах осуществления содержание аланина в части REP согласно изобретению составляет выше 20%, предпочтительно выше 25%, более предпочтительно выше 30% и ниже 50%, предпочтительно ниже 40%, более предпочтительно ниже 35%. Это является преимущественным, поскольку предусматривается, что более высокое содержание аланина обеспечивает более жесткую и/или более прочную и/или менее растяжимую структуру.

В определенных вариантах осуществления часть REP лишена остатков пролина, т.е. в части REP отсутствуют остатки пролина.

Далее, обращаясь к сегментам, которые составляют часть REP по изобретению, следует подчеркнуть, что каждый сегмент является индивидуальным, т.е. любые два сегмента A, любые два сегмента G или любые два сегмента L конкретной части REP могут быть идентичными или могут не быть идентичными. Таким образом, не является главным признаком изобретения то, что каждый тип сегмента идентичен в конкретной части REP. Вместо этого, в описании далее представлено квалифицированному специалисту руководство, как сконструировать индивидуальные сегменты и собрать их в часть REP, которую, тем самым, считают происходящей из повторяющегося фрагмента белка шелка пауков, и которая составляет часть функционального слитого белка по изобретению.

Каждый индивидуальный сегмент A представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую от 8 до 18 аминокислотных остатков. Предпочтительно, чтобы каждый индивидуальный сегмент A содержал от 13 до 15 аминокислотных остатков. Также возможно, чтобы большинство или более двух сегментов A содержало от 13 до 15 аминокислотных остатков, и чтобы меньшинство, такое как один или два сегмента A, содержало от 8 до 18 аминокислотных остатков, как например, 8-12 или 16-18 аминокислотных остатков. Широкое большинство этих аминокислотных остатков представляют собой остатки аланина. Более конкретно, от 0 до 3 аминокислотных остатков не являются остатками аланина, а остальные аминокислотные остатки являются остатками аланина. Таким образом, все аминокислотные остатки в каждом индивидуальном сегменте A представляют собой остатки аланина без исключения, или за исключением одного, двух или трех аминокислотных остатков, которые могут представлять собой любую аминокислоту. Предпочтительно, чтобы замещающая аланин аминокислота(ы) представляла собой природную аминокислоту, предпочтительно индивидуально выбранную из группы из серина, глутаминовой кислоты, цистеина и глицина, более предпочтительно серина. Безусловно, возможно, чтобы один или несколько из сегментов A представляли собой полностью аланиновые сегменты, в то