Конструкции рекомбинантного непатогенного вируса болезни марека, кодирующие антигены вируса инфекционного ларинготрахеита и вируса болезни ньюкасла

Конструкции рекомбинантного непатогенного вируса болезни марека, кодирующие антигены вируса инфекционного ларинготрахеита и вируса болезни ньюкасла

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке по пункту 35 U.S.C. § 119(e) испрашивается приоритет временной заявки США, имеющей серийный No. 61/549844, поданной 21 октября 2011 г., полное содержание которой таким образом включено в настоящее описание в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым конструкциям рекомбинантного мультивалентного непатогенного вируса болезни Марека, кодирующим и экспрессирующим белковые антигены вируса инфекционного ларинготрахеита и вируса болезни Ньюкасла, и к способам их использования в вакцинах для домашней птицы.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Патогенные вирусы домашней птицы не только являются истощающими для кур, но также являются дорогостоящими для птицеводов, поскольку большинство из возникающих заболеваний являются инфекционными, и промышленное птицеводство существенно опирается на ограниченные, крупномасштабные предприятия для разведения. Вакцинация молодых цыплят часто является единственным целесообразным средством для борьбы с этими вирусами. Хотя аттенуированные или убитые вирусные вакцины для домашней птицы остаются важными на рынке, в последние годы значительные ресурсы потрачены на разработку вакцин, содержащих рекомбинантные вирусные конструкции, экспрессирующие белковые антигены патогенных вирусов. Более того, значительные усилия прикладывают для конструирования стабильных и эффективных мультивалентных рекомбинантных векторов на основе непатогенного вируса болезни Марека (rMDV_np), экспрессирующих чужеродные гены из множества вирусных патогенов. Такие мультивалентные вакцины могут служить для минимизации количества инъекций, вводимых цыплятам, и, таким образом, снижать дискомфорт и стресс вакцинируемых цыплят, также как значительно снижать стоимость работ и материалов. Вакцинация отдельными мультивалентными конструкциями также может являться предпочтительной по сравнению с альтернативными мультивалентными вакцинами rMDV_np, содержащими множество рекомбинантных моновалентных конструкций rMDV_np, поскольку эти альтернативные вакцины, по меньшей мере до настоящего времени, приводили к защите только против одного вирусного патогена. Неудача таких альтернативных вакцин предположительно обусловлена тем, что одна из моновалентных конструкций rMDV_np перерастает другие моновалентые кострукции rMDV_np, таким образом, предотвращая индукцию значительного иммунного ответа этими другими конструкциями rMDV_np. В любом случае, несмотря на значительные усилия в прошлом для конструирования стабильных и эффективных мультивалентных рекомбинантных векторов rMDV_np, экспрессирующих чужеродные гены из множества вирусных патогенов, до настоящего времени доказана безуспешность таких попыток.

Одним из вирусных заболеваний домашней птицы, с которым можно бороться посредством вакцинации, является болезнь Марека. Болезнь Марека представляет собой патогенное заболевание, тяжело поражающее кур во всем мире.

Болезнь Марека возникает преимущественно у молодых кур в возрасте между 2 и 5 месяцами. Клинические признаки включают в себя: прогрессирующий паралич одной или нескольких конечностей, нарушение координации из-за паралича ног, свисание конечностей из-за поражения крыльев и опущенное положение головы из-за поражения мышц шеи. В случаях острого заболевания может возникать тяжелая депрессия. Может развиваться также атрофия бурсы и тимуса.

Этиологическим фактором для болезни Марека является вирус болезни Марека серотипа 1 (MDV1), ассоциированный с клетками вирус, имеющий геном - двухцепочечную ДНК. MDV1 представляет собой лимфотрофный альфавирус герпеса птиц, который как: (i) инфицирует B-клетки, что может приводит к цитолизу, так и (ii) латентно инфицирует T-клетки, что может индуцировать T-клеточную лимфому. Близко родственный вирулентному штамму MDV1, вирус болезни Марека серотипа 2 (MDV2), ранее известный как вирус герпеса 3 Gallid, представляет собой естественным образом ослабленный штамм MDV, как показано, от слабо патогенного до непатогеного у кур [Petherbridge et al., J. Virological Methods 158:11-17 (2009)]. SB-1 представляет собой специфический штамм MDV2, как показано, пригодный для вакцин против MDV1 [см., например, Murthy and Calnek, Infection and Immunity 26(2) 547-553 (1979)].

Другой близкородственный альфавирус герпеса, вирус болезни Марека серотипа 3 (MDV3), более широко известный как вирус герпеса индеек (HVT), представляет собой непатогенный вирус домашних индеек [см., например, Kingham et al., J. of General Virology 82:1 123-1 135 (2001)]. Два общепринятых штамма HVT представляют собой штамм PB1 и штамм FC126. Поскольку HVT также является непатогенным для кур, он действительно индуцирует длительный защитный иммунный ответ у кур против MDV1. Соответственно, HVT используют в вакцинах для домашней птицы против вирулентного MDV1 в течение многих лет, как правило, в комбинации с SB-1, который более присутствует в кровотоке, чем HVT, но считается менее безопасным. Альтернативно, когда стада заражены особенно вирулентными штаммами MDV1, HVT можно комбинировать с вакциной Риспен. Вакцина Риспен представляет собой изолят, происходящий из умеренно вирулентного штамма MDV1, который затем дополнительно ослабляли пересевом клеток. Однако штамм Rispen's охраняет некоторую вирулентность по отношению к высоко чувствительным линиям кур.

Последовательность полного генома HVT описана [Afonso et al., J. Virology 75(2):971-978 (2001)], и, как большинство альфавирусов герпеса, HVT обладает значительным количеством потенциальных, не являющихся необходимыми участков для вставки [см., например, U.S. 5187087; U.S. 5830745; U.S. 5834305; U.S. 5853733; U.S. 5928648; U.S. 5961982; U.S. 6121043; U.S. 6299882 B1]. Показано также, что HVT поддается генетической модификации и, таким образом, его использовали в качестве рекомбинантного вектора в течение многих лет [WO 87/04463]. Соответственно, опубликовано, что рекомбинантные векторы HVT экспрессируют чужеродные гены, кодирующие антигены, например, из вируса болезни Ньюкасла (NDV), [Sondermeijer et al., Vaccine, 11:349-358 (1993); Reddy et al., Vaccine, 14:469-477 (1996)], вируса инфекционного бурсита (IBDV), [Darteil et al., Virology, 211:481-490 (1995); Tsukamoto et al., J. of Virology 76(11):5637-5645 (2002)] и вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) [Johnson et al., Avian Disease, 54(4):1251-1259 (2010); WO 92/03554; U.S. 6875856]. Полная геномная последовательность MDV2 также известна [см. номер доступа в GenBank: AB049735.1 и Petherbridge et al., выше]. Геномная организация MDV2 очень похожа на организацию HVT, где область US, в частности, является идентичной области US HVT [см., Kingham et al., выше].

Кроме того, сконструирован рекомбинантный химерный вирус, известный как новый вирус птичьего герпеса (NAHV), в котором конкретные области генома HVT заменены на соответствующие области генома MDV1. NAHV используют также для экспрессии чужеродных генов, кодирующих антигены из других вирусов домашней птицы [U.S. 5965138; U.S. 6913751].

Подобно MDV, вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV) представляет собой альфавирус герпеса, тяжело поражающий кур во всем мире [Fuchs et al., Veterinary Research 38:261-279 (2007)]. ILTV вызывает у кур острое респираторное заболевание, характеризующееся угнетением дыхания, одышкой и выделением кровавой мокроты. Репликация вируса ограничена клетками дыхательных путей, где в трахее инфекция вызывает эрозию и геморрагию тканей.

Болезнь Ньюкасла является другим высоко инфекционным и истощающим заболеванием кур. Этиологическим фактором для болезни Ньюкасла является вирус болезни Ньюкасла (NDV). NDV принадлежит к отряду Mononegavirales и состоит в семействе Paramyxoviridae. Вирусы болезни Ньюкасла имеют геном из несегментированной, антисмысловой одноцепочечной РНК. NDV сгруппированы в три отдельных патотипа в соответствии с их вирулентностью. Инфекция домашней птицы этими непатогенными лентогенными штаммами NDV является по существу бессимптомной. Прямопротивоположно этому мезогенные (средне патогенные) и велогенные (высоко патогенные) штаммы NDV вызывают обширное заболевание, которое может быть летальным. Большинство типов NDV инфицируют дыхательную систему и/или нервную систему и могут приводить к одышке и искривлению шеи.

Вирус инфекционного бурсита (IBDV), называемый также вирусом болезни Гумборо, представляет собой возбудитель заболевания инфекционного бурсита. IBDV вызывает острую, высоко инфекционную вирусную инфекцию лимфоидной ткани кур, где первичной мишенью является жизненно важный иммунологический орган птиц: сумка Фабриция. Уровень заболеваемости в чувствительных стадах является высоким, с быстрой потерей массы и уровнями смертности от среднего до высокого. Цыплята, выздоровевшие после заболевания, могут иметь иммунодефициты из-за разрушения (или разрушения частей) сумки Фабриция. Это делает их особенно восприимчивыми к вторичным инфекциям.

IBDV является членом семейства Birnaviridae. Вирусы этого семейства имеют геном, состоящий из двух сегментов (A и B) двухцепочечной РНК. Существует два серотипа IBDV - серотипы 1 и 2, которые можно дифференцировать посредством тестов нейтрализации вируса (VN). Показано, что вирусы серотипа 1 являются патогенными для кур, в то время как вирусы серотипа 2 вызывают только подострое заболевание у индеек. Исторически, серотип 1 вирусов IBDV состоит только из одного типа, известного в настоящее время как «классический» вирус IBD. Более недавно появились так называемые «варианты» штаммов IBDV. Классический штамм и варианты штаммов IBDV можно идентифицировать и различать посредством теста нейтрализации вируса с использованием панели моноклональных антител или посредством RT-ПЦР [Wu et al., Avian Diseases, 51:515-526(2007)]. Хорошо известные классические штаммы IBDV включают в себя D78, Faragher 52/70 и STC, в то время как 89/03 представляет собой хорошо известный вариант штамма. Множество живых или инактивированных вакцин IBDV являются коммерчески доступными, например, живая вакцина, такая как NOBILIS^R Gumboro D78 (MSD Animal Health).

Как указано выше, поскольку HVT может действовать как антиген, обеспечивающий значительную защиту против болезни Марека, и как рекомбинантный вектор, его используют в настоящее время в качестве вектора-платформы для таких мультивалентных вакцин, как Innovax^®-ILT (выпускаемой Merck Animal Health), защищающей против ILTV; и Innovax^®-ND-SB (выпускаемой Merck Animal Health) и Vectormune^® HVT-NDV (выпускаемой Ceva) - обе из которых защищают против NDV. Следует отметить, однако, до настоящего времени ни для одной из мультивалентных вакцин, содержащих рекомбинантный HVT, кодирующий антигены из более чем одного патогена, не показано стабильности и эффективности, даже несмотря на то, что такие вакцины предложены более пятнадцати лет назад [см., например, U.S. 5965138]. Действительно, Innovax^®-ILT содержит только рекомбинантный HVT, содержащий два чужеродных гена, т.е. ILTV gD и ILTV gI, которые, как доказано, являются безопасными, эффективными и стабильными. Однако эти два чужеродных гена происходят из одного и того же патогена, и более того, они естественным образом прерываются и нуждаются в совместной экспрессии, чтобы позволять надлежащую иммунизацию против ILTV.

Соответственно, несмотря на явные преимущества стабильных, мультивалентных рекомбинантных конструкций MDV_np, которые могут эффективно экспрессировать чужеродные антигены из двух или более различных патогенов, и значительные усилия для их конструирования, до настоящего времени, ни одной из них не ожидается. Таким образом, существует явная необходимость преодоления общих неудач в этой области посредством конструирования новых, стабильных рекомбинантных векторов MDV_np, которые можно использовать в мультивалентных вакцинах в качестве единственного активного средства для защиты против двух или нескольких различных не относящихся к MDV1 вирусных патогенов домашней птицы.

Цитирование любой ссылки в настоящем описании не следует рассматривать как допущение, что такая ссылка является доступной в качестве «предшествующей области техники» в настоящем описании.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, настоящее изобретение относится к новым, стабильным и эффективным мультивалентным рекомбинантным непатогенным вирусам болезни Марека (rMDV_np) для применения в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов для множества вирусных патогенов. В частных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT). В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой рекомбинантный вирус болезни Марека серотипа 2 (rMDV2). rMDV_np, например, rHVT или rMDV2, можно использовать в вакцинах против патогенных вирусов домашней птицы.

В частных вариантах осуществления rMDV_np содержит первую нуклеиновую кислоту, вставленную в первый, не являющийся необходимым участок в геноме rMDV_np, и вторую нуклеиновую кислоту, вставленную во второй, не являющийся необходимым участок в геноме rMDV_np. Первая нуклеиновая кислота содержит как нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), так и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gI вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV). Вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F вируса болезни Ньюкасла (NDV). В конкретных вариантах осуществления этого типа первая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 16, и вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 15. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

В частных вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US2, в то время как второй, не являющийся необходимым участок, представляет собой не являющийся необходимым участок rMDV_np, отличный от участка US2. В родственных вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US2, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок UL7/8. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US2, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US10. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US2, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок UL 54.5. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, являются одинаковыми. В конкретных вариантах осуществления этого типа первую нуклеиновую кислоту и вторую нуклеиновую кислоту фактически конструируют в форме части одной и той же молекулы ДНК, которую вставляют в не являющийся необходимым участок rMDV_np. Такая молекула ДНК может представлять собой экспрессирующую кассету, кодирующую белок gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), белок gI вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) и белок F вируса болезни Ньюкасла (NDV). В конкретных вариантах осуществления этого типа молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Соответственно, в частных вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляют собой участок US2. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляют собой участок UL54.5. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляют собой участок UL7/8. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляют собой участок US10. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие белок gD ILTV, белок gI ILTV и белок F NDV, могут функционально находиться под контролем экзогенных промоторов, т.е. промоторов, не обнаруженных в природе в MDV_np. В некоторых вариантах осуществления эти три нуклеотидные последовательности функционально находятся под контролем различных промоторов, т.е. нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gD ILTV, функционально находится под контролем первого промотора, нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gI ILTV, функционально находится под контролем второго промотора, и нуклеотидная последовательность, кодирующая белок F NDV, функционально находится под контролем третьего промотора, где первый промотор, второй промотор и третий промотор - все являются различными. В частных вариантах осуществления промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gD ILTV, представляет собой эндогенный промотор gD ILTV. В конкретных вариантах осуществления промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gI ILTV, представляет собой эндогенный промотор gI ILTV. В частных вариантах осуществления этого типа промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gD ILTV, представляет собой эндогенный промотор gD ILTV, и промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gI ILTV, представляет собой эндогенный промотор gI ILTV. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок gD ILTV, белок gI ILTV или белок F NDV, представляет собой немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE). В частных вариантах осуществления этого типа промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F NDV, представляет собой промотор IE hCMV. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок gD ILTV, белок gI ILTV или белок F NDV, представляет собой промотор gpX вируса псевдобешенства (PRV). В родственных вариантах осуществления по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок gD ILTV, белок gI ILTV или белок F NDV, представляет собой промотор гена бета-актина кур. В конкретных вариантах осуществления промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F NDV, представляет собой промотор IE hCMV, промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gD ILTV, представляет собой эндогенный промотор gD ILTV, и промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gI ILTV, представляет собой эндогенный промотор gI ILTV.

В некоторых вариантах осуществления rMDV_np по настоящему изобретению, включающий вставки нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок gD ILTV, белок gI ILTV и белок F NDV, также включает одну или несколько экзогенных последовательностей терминатора транскрипции. В частных вариантах осуществления этого типа последовательность терминатора транскрипции находится ниже нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F NDV. В частных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие белок gD ILTV и белок gI ILTV, разделяют одну последовательность терминатора транскрипции, и нуклеотидная последовательность, кодирующая белок F NDV, имеет другую. В частных вариантах осуществления по меньшей мере одна из последовательностей терминатора транскрипции содержит синтетическую последовательность для полиаденилирования. В родственных вариантах осуществления по меньшей мере одна из последовательностей терминатора транскрипции содержит последовательность для полиаденилирования тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV TK). В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, содержащей в направлении от 5' до 3' в следующем порядке: (i) промотор gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), (ii) кодирующую последовательность белка gD ILTV, (iii) промотор gI ILTV, (iv) кодирующую последовательность белка gI ILTV, (v) немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE), (vi) кодирующую последовательность белка F NDV, и (viii) последовательность терминатора транскрипции. В частном варианте осуществления этого типа рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17.

Кроме того, настоящее изобретение относится к rMDV_np, в котором рекомбинантная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению вставлена в не являющийся необходимым участок вставки rMDV_np. В некоторых вариантах осуществления этого типа rMDV_np включает в себя не являющийся необходимым участок, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую в направлении от 5' до 3' в следующем порядке (i) промотор gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), (ii) кодирующую последовательность белка gD ILTV, (iii) промотор gI ILTV, (iv) кодирующую последовательность белка gI ILTV, (v) немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE), (vi) кодирующую последовательность белка F NDV, и (vii) последовательность терминатора транскрипции. В конкретных вариантах осуществления можно включать также промежуточные нуклеотидные последовательности, такие как линкеры, спейсерные последовательности и/или дополнительные кодирующие последовательности, см. пример 1 ниже. В конкретном варианте осуществления rHVT содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17, вставленную в не являющийся необходимым участок. В конкретных вариантах осуществления этих типов не являющийся необходимым участок представляет собой участок US2. В других таких вариантах осуществления не являющийся необходимым участок представляет собой участок UL54.5. В других таких вариантах осуществления не являющийся необходимым участок представляет собой участок UL7/8. В других таких вариантах осуществления не являющийся необходимым участок представляет собой участок US10. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Настоящее изобретение также относится к способам получения rMDV_np по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления конструируют гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gD ILTV, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gI ILTV, и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F NDV. Затем гетерологичную нуклеиновую кислоту вставляют в не являющийся необходимым участок rMDV_np по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления гетерологичная нуклеиновая кислота представляет собой экспрессирующую кассету. В конкретных вариантах осуществления этого типа экспрессирующая кассета содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17. В других вариантах осуществления конструируют первую гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gD ILTV и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gI ILTV; и конструируют вторую гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F NDV. Первую гетерологичную нуклеиновую кислоту вставляют в участок US2 rMDV_np, и вторую гетерологичную нуклеиновую кислоту вставляют в альтернативный, не являющийся необходимым участок rMDV_np. В конкретных вариантах осуществления такие гетерологичные нуклеиновые кислоты представляют собой экспрессирующие кассеты. В конкретных вариантах осуществления этого типа первая гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 16, и вторая гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 15. В конкретных вариантах осуществления способ получения rMDV_np представляет собой способ получения rHVT. В альтернативных вариантах осуществления способ получения rMDV_np представляет собой способ получения rMDV2.

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим любой rMDV_np по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам способствования защите домашней птицы против заболевания, вызванного ILTV и/или NDV и/или MDV1, посредством введения такой вакцины и/или иммуногенной композиции по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления такие способы способствуют защите кур. В конкретных вариантах осуществления этого типа вакцину по настоящему изобретению вводят подкожно. В других вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят in ovo.

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к стабильным, безопасным и эффективным иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим rMDV_np по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим любой rMDV_np по настоящему изобретению, который дополнительно комбинируют с дополнительным антигеном NDV, ILTV и/или MDV для улучшения и усиления вызванной иммуногенности. Кроме того, настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим любой rMDV_np по настоящему изобретению, который дополнительно комбинируют с антигеном для патогена, отличного от MDV, ILTV или NDV. В конкретном варианте осуществления этого типа антиген представляет собой антиген вируса инфекционного бурсита (IBDV). В более конкретном варианте осуществления - антиген IBDV слабого живого IBDV. В конкретных вариантах осуществления слабый живой IBDV представляет собой вариант IBDV. Настоящее изобретение также относится к способам способствования защите домашней птицы против заболевания, вызванного ILTV и/или NDV, и/или MDV1, и/или IBDV, посредством введения такой вакцины и/или иммуногенной композиции домашней птице (например, курам). В конкретных вариантах осуществления этого типа вакцину по настоящему изобретению вводят подкожно. В других вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят in ovo.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции и/или вакцины по настоящему изобретению содержат rHVT, содержащий вставку в участок US2 рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащий от 5' до 3': (i) промотор gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV); (ii) кодирующую последовательность белка gD ILTV; (iii) промотор gI ILTV; (iv) кодирующую последовательность белка gI ILTV; (v) немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE); (vi) кодирующую последовательность белка слияния вируса болезни Ньюкасла (NDV F); и (vii) последовательность терминатора транскрипции. В конкретных вариантах осуществления этого типа иммуногенные композиции и/или вакцины дополнительно содержат слабый живой вирус инфекционного бурсита (IBDV). В конкретных вариантах осуществления слабый живой IBDV представляет собой вариант IBDV. В более конкретных вариантах осуществления IBDV представляет собой 89/03. В более конкретных вариантах осуществления этого типа рекомбинантная нуклеиновая кислота обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17.

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим любой rMDV_np по настоящему изобретению, комбинированный с дополнительным антигеном NDV, ILTV и/или MDV, и патогеном, отличным от MDV, ILTV или NDV.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на следующие фигуры и подробное описание.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение генома HVT (FC126), состоящего из уникальной длинной (UL) области и уникальной короткой (US) области, каждая из которых обозначена прямой линией и фланкирована областями повтором, обозначенными как прямоугольники. Под схемой генома расположена линейка, указывающая локализацию фрагментов расщепления рестрикционным ферментом BamHI, относительно их положения в геноме, и буквенное обозначение, ассоциированное с каждым фрагментом (наибольшему фрагменту присвоена буква «A», следующему по величине фрагменту присвоена буква «B» и т.д. и т.п.). Положения (и их обозначение) каждого клонированного субгеномного фрагмента, используемого для реконструирования либо HVT (FC126), либо rHVT/NDV/ILT вирусов, указаны под картой рестрикции BamHI. Звездочкой (*) указано положение участков вставки: UL7/UL8 в 1196-05.1; UL54.5 в 1332-29.4; US2 в 1332-47.A2 или 1317-15.1-1.

Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение шести различных рекомбинантных HVT, изображающее гены, вставленные в остов HVT, и участок их вставки. Innovax-LT представляет собой rHVT, включающий экспрессирующую кассету, кодирующую гены ILTV gD и gI ILTV, вставленные в участок UL54.5 rHVT. Innovax-ND представляет собой rHVT, включающий экспрессирующую кассету, кодирующую ген слияния NDV, вставленную в участок US10 rHVT. 1348-34C представляет собой rHVT, включающий как экспрессирующую кассету, кодирующую гены gD ILTV и gI ILTV, вставленную в участок UL54.5 rHVT, так и экспрессирующую кассету, кодирующую ген слияния NDV, вставленную в участок US10 rHVT. 1332-62E представляет собой rHVT, включающий в себя экспрессирующую кассету, кодирующую гены gD ILTV, gI ILTV и ген слияния NDV, вставленную в участок US2 rHVT. 1317-46 представляет собой rHVT, включающий как экспрессирующую кассету, кодирующую гены gD ILTV и gI ILTV, вставленные в участок US2, так и экспрессирующую кассету, кодирующую ген слияния NDV, вставленную между UL7 и UL8 (т.е. в участок UL7/8) rHVT. 1332-70B представляет собой rHVT, включающий экспрессирующую кассету, кодирующую гены gD ILTV, gI ILTV и ген слияния NDV, вставленные в участок UL54.5 rHVT.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение преодолевает неудачу предшествующей области техники с возможностью конструировать векторы rMDV_np, которые как содержат чужеродные антигены, так и могут защищать против двух или более различных патогенов вирусов домашней птицы посредством предоставления уникальных рекомбинантных векторов MDV_np, которые кодируют и экспрессируют антигены из ILTV и NDV и которые защищают против вируса болезни Марека, болезни Ньюкасла, и инфекционного ларинготрахеита. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np по настоящему изобретению кодирует и экспрессирует чужеродные антигены только из ILTV и NDV и может способствовать защите против вируса болезни Марека, болезни Ньюкасла и инфекционного ларинготрахеита. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

До настоящего изобретения уже был сконструирован вектор HVT, содержащий ген NDV, вставленный в область US10. Показано, что этот вектор HVT-NDV является стабильным и экспрессирует достаточные уровни соответствующего продукта гена NDV, белка F NDV для защиты вакцинированных кур против заражения вирулентным NDV. Кроме того, уже сконструирован вектор HVT, содержащий пару генов ILTV, вставленных в область UL54.5 HVT. Показано, что этот вектор HVT-ILTV является стабильным и экспрессирует достаточные уровни соответствующих продуктов генов ILTV, белков gI и gD для защиты вакцинированных кур против заражения вирулентным вирусом ILTV.

Соответственно, сконструирована мультивалентная конструкция HVT для защиты против как NDV, так и ILTV, на основе успешных вышеописанных конструкций, т.е. вставки гена NDV-F в участок US10 и вставки генов gD и gI в участок UL54.5 [см. 1348-34C на фигуре 2]. Неожиданно, однако, после пассирования этой конструкции в культуре клеток рекомбинантный вирус утратил свою способность экспрессировать белки ILTVgD, ILTVgI и NDV F. Доказано, что это является правдой для ряда повторов рекомбинантных конструкций rHVT. Действительно, эти рекомбинантные вирусы являлись нестабильными и непригодными для дальнейшей разработки вакцин. Эти обнаружения показывают, что дизайн отдельного мультивалентного вектора rHVT, который может экспрессировать как белок NDV F, так и белки ILTVgD и ILTVgI, не является простым процессом, который можно экстраполировать из существующей информации. Действительно, если такие стабильные и эффективные мультивалентные векторы rHVT вообще были возможны, их дизайн необходимо было основывать на непредсказуемом наборе комплексных взаимодействий, минимально вовлекающих связь между используемыми участками вставки и чужеродными генами, подлежащими вставке. До настоящего времени такой дизайн конструкций rHVT невозможно было легко предсказать из известной предшествующей области техники.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к рекомбинантным векторам rMDV_np, в которые вставлены два гена из ILTV и один ген из NDV. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения все три гена вставляли в область US2 генома HVT. После вакцинации кур или яиц кур этим rHVT клетки иммунизированного хозяина экспрессировали белки, кодируемые вставленными генами. Более того, белки NDV и ILTV, экспрессированные rHVT, стимулировали иммунный ответ, защищающий вакцинированных кур против заболевания, вызванного NDV и ILTV. Соответственно, такие векторы rMDV_np можно использовать для обеспечения защиты против инфекции как NDV, так и ILTV. Ранее два отдельных вектора rHVT являлись необходимыми для защиты против этих двух вирусов, а именно, один для защиты против ILTV, и другой для защиты против NDV.

Настоящее изобретение, таким образом, является преимущественным по сравнению с другими современными способами, поскольку оно обеспечивает одновременную защиту против ILTV и NDV посредством инокуляции домашней птицы и/или яиц домашней птицы только одним рекомбинантным MDV_np. В частности, это позволяет вводить дополнительные вакцины способом in ovo, поскольку существует предел того, насколько большой объем можно инъецировать в яйцо и дополнительно экономит стоимость производства, поскольку необходим только один, а не два вектора. Более того, это может позволять включать в вакцину дополнительный антиген, такой как живой IBDV, например, штамм 89/03.

Более того, настоящее изобретение дополнительно включает в себя варианты осуществления, включающие в себя различные конструкции rMDV_np в одной и той же вакцине и/или в иммуногенной композиции. В конкретных вариантах осуществления этого типа вакцина и/или иммуногенная композиция содержит как rMDV2, так и rHVT, каждый из которых кодирует один или несколько чужеродных антигенов. Действительно, в отличие от комбинации двух rHVT, которая неизбежно приводит к тому, что одна конструкция существенно перерастает другую, комбинация rHVT с rMDV2 приводит к не такому значительному перерастанию. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления вакцина по настоящему изобретению содержит rHVT, кодирующий белок ILTVgD, белок ILTVgI и белок NDV F вместе с rMDV2, кодирующим другой антиген вируса домашней птицы.

Для более полного понимания настоящего изобретения представлены следующие определения.

Использование терминов в единственном числе для удобства в описании никаким образом не предназначено для ограничения этим. Таким образом, например, ссылка на композицию, содержащую «полипептид», включает в себя ссылку на один или несколько таких полипептидов.

Как применяют в настоящем документе, «непатогенный вирус болезни Марека» или «MDV_np» или «npMDV» представляет собой вирус семейства MDV, для которого показано от низкой патогенности до отсутствия патогенности для домашней птицы. Термин «MDV_np» включает в себя природные MDV, которые подвергали пассированию или иным сходным манипуляциям, но которые не включают вирусные конструкции, в которых конкретная область генома одного серотипа MDV заменена на соответствующую область другого серотипа MDV для получения химерного вируса, такого как новый вирус герпеса птиц (NAHV). В конкретных вариантах осуществления MDV_np представляет собой HVT. В других вариантах осуществления MDV_np представляет собо