Способ обнаружения рака поджелудочной железы

Способ обнаружения рака поджелудочной железы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения рака поджелудочной железы с использованием CAPRIN-1 в качестве маркера опухоли.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сообщается, что в Японии более 10000 пациентов имеют рефрактерный рак поджелудочной железы, его встречаемость увеличивается каждый год и предполагается, что количество пациентов будет продолжать увеличиваться. Даже если рак поджелудочной железы хирургически удалить, небольшое количество клеток часто инфильтруют и метастазируют в другие органы. Таким образом, рак поджелудочной железы часто рецидивирует, и выживаемость в течение 5 лет составляет только 9%; то есть, прогноз рака поджелудочной железы является очень плохим. Для цели предупреждения послеоперационного рецидива используют гемцитабин, средство против злокачественной опухоли. Однако основной целью введения гемцитабина является смягчение боли, и уменьшения размера опухоли или пользы для выживания едва ли можно ожидать. В некоторых лечебных учреждениях используют другое средство против злокачественной опухоли, TS-1, которое в настоящее время используют против рака желудка, хотя трудно ожидать каких-либо терапевтических эффектов.

Для улучшения прогноза рака поджелудочной железы является важным раннее обнаружение, как и в случае других злокачественных опухолей; однако раннее обнаружение является трудным, поскольку рак поджелудочной железы по существу не проявляет первоначальных симптомов. На сегодняшний день, активно используют способы обнаружения рака поджелудочной железы с использованием карциноэмбрионального антигена (CEA) и гликопротеинов (CA19-9 и Dupan-2) в биологических образцах в качестве маркеров рака поджелудочной железы. Однако уровни таких маркеров опухоли не повышаются до тех пор, пока рак поджелудочной железы не достигнет развернутой стадии, и такие маркеры иногда демонстрируют нормальные величины на стадии прогрессирования. Таким образом, такие опухолевые маркеры считаются недостаточными для точного обнаружения рака поджелудочной железы. Кроме того, большинство опухолевых маркеров, которые в настоящее время известны, присутствуют в жидкостях организма в очень низких количествах (на уровне пг/мл). Таким образом, для выявления таких малых количеств маркеров необходимы способы обнаружения с высокой чувствительностью или специализированные способы. В этих обстоятельствах можно ожидать, что новый способ обнаружения рака поджелудочной железы простым образом с высокой чувствительностью будет применим для диагностики рака поджелудочной железы. Для выявления рака поджелудочной железы на ранней стадии необходимо проходить периодическое всестороннее обследование. Таким образом, является желательным способ обнаружения злокачественной опухоли, который можно осуществлять простым образом с использованием образцов сыворотки крови или мочи без наложения физической или финансовой нагрузки как на здоровых индивидуумов без рака поджелудочной железы, так и на пациентов со злокачественной опухолью.

Также, рак поджелудочной железы является рефрактерным у собак. Хотя в абдоминальной области собаки, страдающей раком поджелудочной железы, может обнаруживаться образование, основными симптомами является быстрая потеря энергии, неустойчивая походка и нарушения походки вследствие гипогликемии. В большинстве случаев развитие злокачественной опухоли не обнаруживают, пока не появляются симптомы. Кроме того, часто, когда обнаруживают такие симптомы, рак поджелудочной железы, возможно, уже находится на развернутой стадии. Таким образом, в дополнение к хирургическому удалению рака поджелудочной железы, терапевтические способы ограничиваются поддерживающей терапией и введением средств против злокачественной опухоли. Как и в случае пациентов-людей, ранее обнаружение является важным для собак, страдающих раком поджелудочной железы, для эффективного лечения такого рака поджелудочной железы. Как и в случае человека, в прошлом отсутствовали диагностические средства для собак, которые позволяют обнаружение рака поджелудочной железы на ранней стадии простым образом. В области ветеринарной медицины способы обнаружения, такие как радиографические способы с использованием рентгеновского излучения, CT или MRI еще не стали распространенными. В настоящее время обнаружение проводят пальпацией, простым исследованием крови и рентгенофотографией, и диагностика в высокой степени зависит от опыта ветеринаров. Если бы были предоставлены простые средства для обнаружения злокачественной опухоли с высокой чувствительностью, которые можно использовать для диагностики рака поджелудочной железы у собак, то можно было бы проводить адекватное лечение, которое обеспечивает значительные преимущества для владельцев собак и ветеринаров.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) представляет собой внутриклеточный белок, который экспрессируется при активации или клеточном делении нормальных клеток в фазе покоя. Также известно, что CAPRIN-1 вовлечен в контроль транспорта и трансляции мРНК через образование цитоплазматических стрессовых гранул и РНК в клетке. Также показано, что гены, кодирующие белки CAPRIN-1, экспрессируются в семенниках собаки и человека и злокачественных опухолевых клетках, анализ FCM клеток рака молочной железы с использованием антител против CAPRIN-1 демонстрирует экспрессию CAPRIN-1 на поверхности клеток рака молочной железы, и иммуногистохимическое окрашивание с использованием тканей рака молочной железы демонстрирует экспрессию CAPRIN-1 в клетках рака молочной железы на высоком уровне. Кроме того, было описано, что антитела, упомянутые выше, могут повреждать клетки рака молочной железы через функционирование лимфоцитов, и что антитела против CAPRIN-1 проявляют высокие противоопухолевые эффекты в моделях на мышах, имеющих злокачественную опухоль, которым трансплантировали клетки рака молочной железы (патентный документ 1). Также было описано, что злокачественные опухоли, такие как рак молочной железы, можно диагностировать путем измерения либо антител, индуцированных в организме индивидуума против CAPRIN-1, присутствующих в сыворотке крови, либо полипептидов, которые подвержены взаимодействиям антиген-антитело с CAPRIN-1 (патентный документ 2). Однако вплоть до настоящего времени отсутствовали сообщения о том, что рак поджелудочной железы можно диагностировать путем измерения либо антител против CAPRIN-1, индуцированных в сыворотке крови пациента с раком поджелудочной железы, либо полипептидов, которые подвержены взаимодействиям антиген-антитело с CAPRIN-1.

Документы уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: международная публикация № WO 2010/016526

Патентный документ 2: международная публикация № WO 2010/016527

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМА, РЕШАЕМАЯ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Задачей настоящего изобретения является предоставление средств для обнаружения рака поджелудочной железы, которые пригодны для диагностики рака поджелудочной железы.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ

Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования. В результате, авторы настоящего изобретения открыли, что рак поджелудочной железы можно диагностировать, исследовать или обнаруживать на основании экспрессии CAPRIN-1 в раке поджелудочной железы, определения (или анализа) антител против CAPRIN-1, индуцированных в сыворотке крови пациента с раком поджелудочной железы с использованием белка CAPRIN-1, и связывания антител, продуцированных с использованием таких белков, с CAPRIN-1 в ткани рака поджелудочной железы. Это привело к осуществлению настоящего изобретения.

В частности, настоящее изобретение относится к способу обнаружения рака поджелудочной железы, включающему измерение экспрессии CAPRIN-1 в образце, взятом от индивидуума. Термин "обнаружение", как используют в рамках изобретения, может быть использован взаимозаменяемо с терминами "исследование" или "оценка". Также, настоящее изобретение относится к реагенту или набору для обнаружения рака поджелудочной железы, содержащим полипептид, который подвержен взаимодействию антиген-антитело с антителом против CAPRIN-1, индуцированным или стимулированным в организме индивидуума. Кроме того, настоящее изобретение относится к реагенту или набору для обнаружения рака поджелудочной железы, содержащим антитело, которое подвержено взаимодействию антиген-антитело с CAPRIN-1, или антигенсвязывающий фрагмент антитела. Более того, настоящее изобретение относится к реагенту или набору для обнаружения рака поджелудочной железы, содержащим полинуклеотид, специфически гибридизующийся с частичной последовательностью, содержащей по меньшей мере 15-19 нуклеотидов или по меньшей мере 20-30 нуклеотидов нуклеотидной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, …, 29. Выражение "реагент или набор для обнаружения рака поджелудочной железы", используемое в рамках изобретения, также может быть указано как "реагент или набор, обнаруживающие рак поджелудочной железы".

В частности, настоящее изобретение имеет признаки, описанные ниже.

(1) Способ обнаружения рака поджелудочной железы, включающий измерение наличия или количества полипептида, обладающего реактивностью в форме специфического связывания с антителом против белка CAPRIN-1 через взаимодействие антиген-антитело, или наличия или количества нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид, в образце, взятом от индивидуума.

(2) Способ согласно (1), где полипептид, подлежащий измерению, представляет собой белок CAPRIN-1, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей 85-90% или более идентичностью последовательности с белком CAPRIN-1.

(3) Способ согласно (1) или (2), где индивидуумом является человек или собака.

(4) Способ согласно (3), где индивидуумом является собака, и полипептид, подлежащий определению, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером.

(5) Способ согласно (4), где индивидуумом является собака, и полипептид, подлежащий определению, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14.

(6) Способ согласно (3), где индивидуумом является человек, и полипептид, подлежащий определению, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2 или 4.

(7) Способ согласно любому из (1)-(6), где наличие или количество полипептида определяют путем иммунологического определения антитела, индуцируемого против полипептида, подлежащего измерению, в организме индивидуума, которое может содержаться в образце.

(8) Способ согласно любому из (1)-(6), где наличие или количество нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определяют путем определения нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид, содержащейся в образце.

(9) Способ согласно (8), где наличие или количество нуклеиновой кислоты в образце измеряют с использованием полинуклеотида, специфически гибридизующегося с частичной последовательностью, содержащей по меньшей мере 15-19 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 20-25 нуклеотидов, и более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов нуклеотидной последовательности в нуклеиновой кислоте или последовательности, комплементарной ей.

(10) Способ согласно (9), где индивидуумом является собака, и полинуклеотид специфически гибридизуется с частичной последовательностью, содержащей по меньшей мере 15-19 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 20-25 нуклеотидов, и более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 или 13, или последовательности, комплементарной ей.

(11) Способ согласно (9), где индивидуумом является человек, и полинуклеотид специфически гибридизуется с частичной последовательностью, содержащей по меньшей мере 15-19 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 20-25 нуклеотидов, и более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, в нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1 или 3, или последовательности, комплементарной ей.

(12) Способ согласно любому из (1)-(6), где наличие или количество полипептида определяют путем определения полипептида, содержащегося в образце.

(13) Способ согласно (12), где анализ представляет собой иммунологический анализ.

(14) Способ согласно любому из (1)-(13), где образец представляет собой кровь, сыворотку, плазму крови, асцитную жидкость, плевральный выпот, ткани или клетки.

(15) Реагент или набор для обнаружения рака поджелудочной железы, содержащие один или несколько полипептидов, обладающих реактивностью в форме связывания через взаимодействие антиген-антитело с антителом, индуцированным против белка CAPRIN-1, в организме индивидуума.

(16) Реагент или набор для обнаружения рака поджелудочной железы, содержащие одно или несколько антител, которые подвержены взаимодействию антиген-антитело с полипептидом, обладающим реактивностью в форме связывания через взаимодействие антиген-антитело с антителом против белка CAPRIN-1 или с антигенсвязывающим фрагментом антитела, и продуцируемым в организме индивидуума.

(17) Реагент или набор согласно (15) или (16), где белок CAPRIN-1 обладает аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером.

(18) Реагент или набор согласно (16) или (17), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые подвержены взаимодействию антиген-антитело с полипептидом, представляют собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с поверхностью клетки рака поджелудочной железы.

(19) Реагент или набор согласно любому из (16)-(18), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые подвержены взаимодействию антиген-антитело с полипептидом, включают антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью в отношении полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере 7-12 последовательно расположенных аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков № 50-98 или аминокислотных остатков № 233-344 аминокислотной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, за исключением SEQ ID NO: 6 и 18, или в отношении полипептида, включающего этот полипептид в качестве частичной последовательности.

(20) Реагент или набор согласно любому из (16)-(19), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые подвержены взаимодействию антиген-антитело с полипептидом, представляют собой одно или несколько антител, выбранных из группы, состоящей из: антитела, связывающегося с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 43, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 44 и 45, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 44 и 46, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 44 и 47, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 44 и 48, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 49 и 50, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 51 и 52, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 53 и 54, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 55 и 56, или его антигенсвязывающего фрагмента; моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 57 и 58, или его антигенсвязывающего фрагмента; и моноклонального антитела, содержащего аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 59 и 60, или его антигенсвязывающего фрагмента.

(21) Реагент или набор для обнаружения рака поджелудочной железы, содержащие один или несколько полинуклеотидов, которые специфически гибридизуются с частичной последовательностью, содержащей по меньшей мере 15-19 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 20-25 нуклеотидов, и более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, в нуклеотидной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: 1-29 с нечетным номером и кодирующей белок CAPRIN-1, или в последовательности, комплементарной этой нуклеотидной последовательности.

(22) Способ обнаружения рака поджелудочной железы, включающий определение наличия или количества белка CAPRIN-1, антитела против белка CAPRIN-1 или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок CAPRIN-1, в образце от индивидуума с использованием по меньшей мере одного реагента или набора согласно любому из (15)-(21).

(23) Способ обнаружения рака поджелудочной железы согласно любому из (1)-(14), включающий определение наличия или количества белка CAPRIN-1, антитела против белка CAPRIN-1 или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок CAPRIN-1, в образце от индивидуума с использованием по меньшей мере одного реагента или набора согласно любому из (15)-(21).

В соответствии с настоящим изобретением, предусмотрен новый способ обнаружения рака поджелудочной железы. Как конкретно описано в примерах ниже, рекомбинантный полипептид, полученный на основе аминокислотной последовательности CAPRIN-1 (или Caprin-1), способен специфически взаимодействовать с антителом, которое существует в сыворотке пациента с раком поджелудочной железы. Соответственно, рак поджелудочной железы, имеющийся у индивидуума, можно обнаруживать путем определения антитела в образце способом по настоящему изобретению. Также рак поджелудочной железы, имеющийся у индивидуума, можно обнаруживать путем определения (или анализа) самого CAPRIN-1. Как описано в примерах ниже, кроме того, высокие уровни экспрессии гена CAPRIN-1 наблюдаются специфически в семенниках и клетках рака поджелудочной железы индивидуумов (далее, такой продукт экспрессии иногда называют "нуклеиновой кислотой, кодирующей (белок) CAPRIN-1"). Таким образом, рак поджелудочной железы также можно обнаруживать путем определения нуклеиновой кислоты. Кроме того, наличие или количество (экспрессии) CAPRIN-1 в ткани рака поджелудочной железы можно измерять с использованием антитела против CAPRIN-1. Такое определение можно проводить у пациентов с раком поджелудочной железы заранее, так чтобы можно было выбирать пациентов, для которых применимо нацеленное на CAPRIN-1 лекарственное средство (например, антительное лекарственное средство).

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствие со способом по настоящему изобретению, наличие или количество (экспрессии) CAPRIN-1 определяют с использованием образца, взятого от индивидуума. Примеры способов определения наличия или количества (экспрессии) CAPRIN-1 включают: способ иммунологического определения антитела против CAPRIN-1, содержащегося в образце (первый способ); способ иммунологического определения самого CAPRIN-1, содержащегося в образце (второй способ); и способ определения содержащейся в образце нуклеиновой кислоты, кодирующей CAPRIN-1, такой как мРНК или кДНК, синтезированная с мРНК (третий способ). В рамках настоящего изобретения наличие или количество (экспрессии) CAPRIN-1 можно определять любым из указанных выше способов. В рамках настоящего изобретения термин "определение" включает любое из следующих значений: обнаружение, качественное определение, количественное определение и полуколичественное определение.

Аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1 собаки. CAPRIN-1 собаки, имеющий такую аминокислотную последовательность, был идентифицирован как полипептид, связывающийся с антителом, специфически присутствующим в сыворотке, полученной от собаки со злокачественной опухолью (см. пример 1). Антитело против CAPRIN-1, обладающего аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, специфически индуцируется или стимулируется в организме собаки, имеющей злокачественную опухоль. В частности, рак поджелудочной железы собаки можно обнаруживать путем определения указанного выше антитела против CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, первым способом. Также рак поджелудочной железы собаки можно обнаруживать путем определения самого CAPRIN-1 в качестве антигена, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, вторым способом. Поскольку ген CAPRIN-1 экспрессируется на довольно высоких уровнях в клетках рака рак поджелудочной железы, рак поджелудочной железы собаки можно обнаруживать путем определения нуклеиновой кислоты в соответствии с третьим способом.

Термин "имеющий аминокислотную последовательность", используемый в настоящем описании, относится к аминокислотным остаткам, расположенным в данном порядке. Таким образом, например, выражение "полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2," относится к полипептиду, имеющему 709 аминокислотных остатков, который состоит из аминокислотной последовательности Met Pro Ser Ala … (частично пропущено) … Gln Gln Val Asn, соответствующей SEQ ID NO: 2. Также, выражение "полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2", может сокращенно указываться, например, как "полипептид SEQ ID NO: 2". Вышеуказанное применимо к выражению "имеющий/нуклеотидную последовательность". В этом случае, термин "имеющий" может быть заменен выражением "содержащий" или "состоящий из".

Также, термин "полипептид", используемый в настоящем описании, относится к молекуле, которая образуется из множества аминокислот посредством пептидной связи. Примеры такой молекулы включают не только полипептидные молекулы с большими количествами составляющих аминокислот, но также низкомолекулярные молекулы (олигопептиды) с небольшими количествами аминокислот и полноразмерные белки. Кроме того, настоящее изобретение охватывает полноразмерные белки CAPRIN-1, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером (т.е. SEQ ID NO: 2, 4, 6,⋅⋅⋅26, 28 и 30).

Термин "индивидуум", используемый в настоящем описании, относится к позвоночным, в том числе млекопитающим и птицам, предпочтительно млекопитающим, и более предпочтительно людям, собакам, коровам и лошадям.

Термин "образец", используемый в настоящем описании, относится к биологическому образцу, подвергаемому исследованию, нацеленному на обнаружение рака поджелудочной железы. Примеры образца включают жидкости организма, ткани и клетки, взятые от индивидуума. Примеры жидкостей организма включают, но не ограничиваются ими, кровь, сыворотку, плазму крови, асцитную жидкость и плевральный выпот. В объем термина "образец" входят ткани или клетки поджелудочной железы, предположительно пораженной злокачественной опухолью.

В способе по настоящему изобретению, мишенями, подлежащими измерению, являются не только CAPRIN-1 собаки SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, но также CAPRIN-1 других млекопитающих (который далее может быть указан как "гомолог" (или "ортолог") для CAPRIN-1 собаки). Когда он просто указан как "CAPRIN-1", также мишенью для определения является CAPRIN-1 другого млекопитающего, в том числе человека, в дополнение к CAPRIN-1 собаки. Как конкретно описано в примерах ниже, уровень экспрессии гена CAPRIN-1 человека является довольно высоким в клетках рака поджелудочной железы человека, в то время как в здоровом организме человека не обнаруживается антитело против гена CAPRIN-1 человека. Соответственно, рак поджелудочной железы млекопитающего, отличного от собаки, можно обнаруживать путем определения экспрессии CAPRIN-1 у млекопитающего. Примером CAPRIN-1 млекопитающего, отличного от собаки, который можно определять способом по настоящему изобретению, является, но не ограничивается этим, CAPRIN-1 человека. Нуклеотидные последовательности, кодирующие CAPRIN-1 человека, и их аминокислотные последовательности соответствуют SEQ ID NO: 1 и 3 и SEQ ID NO: 2 и 4 в списке последовательностей. Идентичность последовательностей между CAPRIN-1 человека и CAPRIN-1 собаки составляет 94% для нуклеотидной последовательности и 98% для аминокислотной последовательности. Идентичность последовательностей между генетически отдаленными млекопитающими, такими как собака и человек, для аминокислотных последовательностей CAPRIN-1 составляет вплоть до 98%. Таким образом, считается, что между собакой и млекопитающим, отличным от человека; т.е. CAPRIN-1 собаки и его гомологом, идентичность последовательности составляет приблизительно 85% или более. CAPRIN-1, экспрессия которого подлежит определению способом по настоящему изобретению, предпочтительно имеет 85% или более, более предпочтительно 90% или более, и еще предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью CAPRIN-1, соответствующей SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, хотя идентичность последовательностей не ограничивается этим.

В первом способе антитело, которое может присутствовать в образце, можно без труда определять с помощью иммуноанализа с использованием антигенного вещества, которое подвержено взаимодействию антиген-антитело с антителом. Сам по себе иммуноанализ является хорошо известным общепринятым способом, как конкретно описано ниже. В качестве антигенного вещества для иммуноанализа можно использовать, например, белок CAPRIN-1 собаки SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, который индуцирует антитело в организме собаки, имеющей злокачественную опухоль, или фрагмент, содержащий эпитоп такого белка. Кроме того, антитело обладает перекрестной реактивностью. Также с антителом, индуцированным против иммуногена, может связываться через взаимодействие антиген-антитело молекула, отличная от антигенного вещества, которое в действительности служит в качестве иммуногена, при условии, что молекула обладает структурой, аналогичной эпитопу иммуногена. В частности, между белком из определенного типа млекопитающего и его гомологом из другого животного идентичность их аминокислотных последовательностей является высокой, и эпитопные структуры часто аналогичны друг другу. Как конкретно описано в примерах ниже, CAPRIN-1 собаки с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14 подвержен взаимодействию антиген-антитело с антителом, индуцированным против CAPRIN-1 собаки в организме собаки, имеющей злокачественную опухоль. Также CAPRIN-1 человека подвержен взаимодействию антиген-антитело с антителом, индуцированным в организме собаки, имеющей злокачественную опухоль. Таким образом, в соответствии с первым способом по настоящему изобретению CAPRIN-1 из любого млекопитающего можно использовать в качестве антигена для иммуноанализа.

Когда антигенное вещество представляет собой белок и т.п., имеющий сложную структуру и являющийся высокомолекулярным, как правило, на молекуле присутствует множество участков, имеющих различные структуры. Таким образом, в организме индивидуума продуцируется множество типов антител, способных распознавать и связывать различные участки таких антигенных веществ. В частности, антитело, которое продуцируется у индивидуума против антигенного вещества, такого как белок, представляет собой поликлональное антитело, которое представляет собой смесь множества типов антител. Антитело, обнаруженное авторами настоящего изобретения, также представляет собой поликлональное антитело, которое специфически присутствует в сыворотке, полученной от индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, и специфически связывается, через взаимодействие антиген-антитело, с рекомбинантным белком CAPRIN-1. Термин "поликлональное антитело", используемый в рамках настоящего изобретения, относится к антителу, которое существует в сыворотке, полученной от индивидуума, содержащей антигенное вещество, и индуцировано против такого антигенного вещества.

В примерах ниже, полипептиды SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 (оба CAPRIN-1 собаки) и полипептид SEQ ID NO: 2 (CAPRIN-1 человека) были получены в качестве антигенов для иммуноанализа специфических антител у живых животных, имеющих злокачественную опухоль. Затем была подтверждена реактивность между этими полипептидами и антителами в сыворотке, полученными от индивидуума, имеющего злокачественную опухоль. Однако антитела, упомянутые выше, представляют собой поликлональные антитела, и они по своей природе связываются с полипептидами, состоящими из гомологов SEQ ID NO: 6, 8 и 2. Даже в случае фрагмента такого полипептида, он может связываться с антителом, содержащимся в сыворотке, полученной от индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, поскольку некоторые поликлональные антитела способны распознавать структуру фрагмента. Иными словами, как полипептид (т.е. полноразмерный белок CAPRIN-1) гомолога SEQ ID NO: 6, 8 или 2, так и его фрагмент можно аналогичным образом использовать для анализа поликлонального антитела, специфически содержащегося в сыворотке индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, и они пригодны для обнаружения злокачественной опухоли. Таким образом, полипептид, используемый в качестве антигена для иммуноанализа в первом способе по настоящему изобретению, не ограничивается только полипептидом, состоящим из полноразмерной области белка CAPRIN-1 (например, SEQ ID NO: 6, 8 или 2). Он может представлять собой фрагмент полипептида, состоящий из по меньшей мере 7-12, и предпочтительно по меньшей мере 8, 9 или 10, последовательно расположенных аминокислот аминокислотной последовательности белка CAPRIN-1, который подвержен взаимодействию антиген-антитело с поликлональным антителом против белка CAPRIN-1 (далее он для удобства может быть указан как "специфически реактивный частичный полипептид"). В данной области известно, что полипептид, содержащий приблизительно 7-12 или более аминокислотных остатков, может проявлять антигенность. Однако если количество аминокислотных остатков является слишком низким, такой полипептид с высокой вероятностью будет перекрестно реагировать с антителом против белка, отличного от белка CAPRIN-1, который присутствует в образце. С точки зрения повышения точности иммуноанализа, таким образом, количество аминокислотных остатков в полипептидном фрагменте предпочтительно составляет 20 или более, 30 или более, и 50 или более, более предпочтительно 100 или более или 150 или более, еще более предпочтительно 300 или более, и еще более предпочтительно 600 или более. Количество аминокислотных остатков может составлять 1000 или более, или 1500 или более.

Предпочтительные примеры полипептидов, используемых в качестве антигенов, включают полипептиды SEQ ID NO: 2-30 с четным номером или их фрагменты, содержащие эпитопы (например, полипептидный фрагмент, содержащий приблизительно 7-12 или более аминокислотных остатков).

Нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих белки, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-30 с четным номером (т.е. SEQ ID NO: 2, 4, 6... 28 и 30) соответствуют SEQ ID NO: 1-29 с нечетным номером (т.е. SEQ ID NO: 1, 3, 5...27 и 29).

Как правило, в данной области хорошо известно, что белковые антигены сохраняют антигенность, практически эквивалентную антигенности исходного белка, если в аминокислотной последовательности белка небольшое количество аминокислотных остатков заменены, удалены, добавлены и вставлены. Таким образом, для обнаружения злокачественной опухоли можно использовать полипептид, обладающей последовательностью, образованной из аминокислотной последовательности белка CAPRIN-1 путем замены, делеции и/или инсерции небольшого количества (предпочтительно одного или нескольких) аминокислотных остатков, имеющей 80% или более, 85-90% или более, предпочтительно 90% или более, более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 98% или более, и еще более предпочтительно 99% или более идентичность последовательности с исходной последовательностью, и, в частности, связывающийся через взаимодействие антиген-антитело с антителом против CAPRIN-1 (далее он для удобства может указываться как "специфически реактивный модифицированный полипептид") аналогично тому, как в случае полипептидов, описанных выше. Предпочтительно, специфически реактивный модифицированный полипептид обладает аминокислотной последовательностью, образованной из аминокислотной последовательности белка CAPRIN-1 путем замены, делеции и/или инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков. Термин "несколько", используемый в настоящем описании, относится к целому числу от 2 до 10, предпочтительно к целому числу от 2 до 6, и еще более предпочтительно к целому числу от 2 до 4.

Термин "идентичность последовательности", используемый в настоящем описании применительно к аминокислотным последовательностям, определяется выравниванием двух аминокислотных последовательностей, подвергаемых сравнению, так чтобы совпадало максимально возможное количество аминокислотных остатков, делением количества аминокислотных остатков, которые совпали, на общее количество аминокислотных остатков, а затем выражением результатов в значениях процентов (%). При описанном выше выравнивании при необходимости встраивают пропуски в одну или обе из последовательностей, подвергаемых сравнению. Такое выравнивание последовательностей можно проводить с использованием хорошо известной программы или алгоритма, таких как BLAST, FASTA, или CLUSTAL W (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 2264-2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997).

Двадцать типов аминокислот, составляющих встречающиеся в природе белки, можно подразделить на группы аминокислот, имеющих свойства, аналогичные друг другу: нейтральные аминокислоты, имеющие боковые цепи с низкой полярностью (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met и Pro); нейтральные аминокислоты, имеющие высокогидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr и Cys); кислые аминокислоты (Asp и Glu); основные аминокислоты (Arg, Lys и His); и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp и His). Известно, что замена среди этих аминокислот (т.е. консервативная замена) редко изменяет свойства полученного полипептида. Таким образом, когда осуществляют замену аминокислотных остатков CAPRIN-1, замену проводят среди представителей одной и той же группы, так чтобы вероятность сохранения связывания с соответствующим антителом была более высокой. Однако в рамках настоящего изобретения описанный выше вариант может вовлекать неконсервативную замену при условии, что обеспечивается активность индукции иммунитета, эквивалентная или практически эквивалентная активности индукции иммунитета у немодифицированного полипептида.

Также для обнаружения рака поджелудочной железы можно использовать полипептид (который далее для удобства может указываться как "специфически реактивный полипептид с вставкой"), который содержит, в качестве частичной последовательности, указанный полипептид, используемый в рамках настоящего изобретения (например, полученный присоединением другого (поли)пептида к одному или обоим концам полипептида, используемого в рамках настоящего изобретения) и специфически связывается через взаимодействие антиген-антитело с антителом против CAPRIN-1, аналогично случаям описанных выше полипептидов.

Полипептиды, используемые в рамках настоящего изобретения, можно синтезировать в соответствии со способом химического синтеза, таким как способ Fmoc (способ с флуоренилметилоксикарбонилом) или способ tBoc (способ с трет-бутилоксикарбонилом) (Japanese Biochemical Society (ed.), Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Protein Chemistry) IV, Kagaku Shushoku to Peptide Gousei (Chemical Modification and Peptide Synthesis), TOKYO KAGAKU DOZIN CO., LTD, Japan, 1981). Также полипептиды можно синтезировать общепринятым способом с использованием различных коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов. Альтернативно полипептиды можно без труда получать известными способами генетической инженерии (например, Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley & Sons). Из РНК, экстрагированной из ткани, экспрессирующей ген, кодирующий CAPRIN-1 ч