Конструкции гомодимерных белков

Конструкции гомодимерных белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым рекомбинантным слитым белкам, таким как молекулы на основе антител человека, называемые вакцинотелами, которые способны запускать как T-клеточный, так и B-клеточный иммунный ответ. Настоящее изобретение также относится к способу лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, например, множественной миеломы или гриппа, посредством этих специфических слитых белков.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ДНК-вакцинация является технически простым способом индукции иммунных ответов. Однако успех для мелких животных еще не воспроизведен в клинических исследованиях. В настоящее время последовало несколько стратегий для увеличения эффективности ДНК-вакцин.

Нацеливание белковых антигенов на антигенпредставляющие клетки (APC) может улучшать T- и B-клеточные ответы. Молекулы рекомбинантных иммуноглобулинов (Ig) хорошо подходят для этой цели. Например, короткими антигенными эпитопами можно заменять петли между β-цепями в константных доменах Ig, в то время как направленную доставку антигена получают, снабжая рекомбинантный Ig вариабельными (V) областями, специфическими для поверхностных молекул на APC. Однако такой способ не подходит для более крупных антигенов, содержащих неопределенные эпитопы, кроме того, рекомбинантные молекулы Ig с короткими T-клеточными эпитопами не могут вызывать образование антител против конформационных эпитопов. Для преодоления этих ограничений получены гомодимерные ДНК-вакцины (вакцинотела) на основе Ig, экспрессирующие инфекционные или опухолевые антигены размером по меньшей мере 550 а.к. с сохранением конформационных эпитопов.

Лиганд хемокинов (с C-C мотивом) 3 (CCL3) представляет собой белок, который у человека кодирован геном CCL3. CCL3, также известный как воспалительный белок-1α макрофагов (MIP-1α), представляет собой цитокин, принадлежащий к семейству CC-хемокинов, вовлеченных при остром воспалительном состоянии в рекрутирование и активацию полиморфноядерных лейкоцитов. В то время как CCL3 мыши представляет собой ген с одной копией, кодирующий зрелый хемокин из 69 аминокислот, гомолог человека дуплицирован и мутирован с образованием двух неаллельных вариантов, LD78α (CCL3) и LD78β (CCL3-L1), где оба обладают 74% гомологией с CCL3 мыши.

До настоящего времени ни одной ДНК-вакцины не одобрено для использования для человека из-за отсутствия эффективности. Не существует также эффективной вакцины, доступной для нескольких инфекционных заболеваний. В частности, ни одной терапевтической противораковой ДНК-вакцины не одобрено для использования для человека.

WO 2004/076489 относится к рекомбинантным молекулам на основе антител человека, называемых вакцинотелами, способным запускать как T-клеточный, так и B-клеточный иммунный ответ.

US20070298051 относится к использованию MIP-1-альфа для усиления иммунного ответа на иммуноген у млекопитающего.

EP920522 относится к полинуклеотидной векторной вакцине, содержащей продукт кДНК-мишени, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую цитокин или хемокин.

Fredriksen AB et al. (Mol Ther 2006; 13: 776-85) относится к ДНК-вакцинам, нацеливающим опухолевый антиген на антигенпредставляющие клетки.

Fredriksen AB and Bogen B (Blood 2007; 110: 1797-805) относится к слитым ДНК-вакцинам хемокин мыши - идиотип.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью вариантов осуществления изобретения является предоставление слитых белков, способных запускать эффективный иммунный ответ даже для слабых антигенов, таких как идиотипические антигены, полученные, например, из клеток миеломы.

Кроме того, целью вариантов осуществления изобретения является предоставление полинуклеотидов, таких как полинуклеотид ДНК, кодирующих слитый белок, запускающий эффективный иммунный ответ даже против слабых антигенов, таких как идиотипические антигены, происходящие, например, из клеток миеломы. Эти полинуклеотиды можно использовать в качестве иммуностимулирующей композиции или вакцины против злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, характеризующихся специфическим для заболевания или ассоциированным с заболеванием антигеном.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Автор(ы) настоящего изобретения обнаружили, что хемокин человека LD78β, его как полноразмерные, так и укороченные варианты, пригодны для использования в качестве нацеливающих групп, направляющих антигенные эпитопы к поверхности APC. Хемокин или его укороченный вариант связаны с рецепторами хемокинов на поверхности APC в форме гомодимерной белковой конструкции, что облегчает связывание двух идентичных хемокинов для обеспечения более эффективных нацеливания и передачи сигнала. Кроме того, гомодимерная конструкция обеспечивает то, что два идентичных антигенных эпитопа доставляют к APC, которые, в свою очередь, представляют их T-клеткам. Даже при относительно большом размере гомодимерных белковых конструкций, клетки являются способными продуцировать и экспортировать интактные молекулы.

Так, в первом аспекте, настоящее изобретение относится к гомодимерному белку из двух идентичных аминокислотных цепей, где каждая аминокислотная цепь содержит нацеливающую группу, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности 5-70 из SEQ ID NO: 1, и антигенную группу, где нацеливающая группа и антигенная группа соединены через мотив для димеризации.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к гомодимерному белку из двух идентичных аминокислотных цепей, где каждая аминокислотная цепь содержит нацеливающую группу, содержащую аминокислоты 3-70 из SEQ ID NO: 1, и антигенную группу, где нацеливающая группа и антигенная группа соединены через мотив для димеризации.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей мономерный белок, который может формировать гомодимерный белок по изобретению.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к гомодимерному белку по изобретению; для использования в качестве лекарственного средства.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей мономерный белок, который может формировать гомодимерный белок по изобретению; для использования в качестве лекарственного средства.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей гомодимерный белок по изобретению.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мономерный белок, который может формировать гомодимерный белок по изобретению.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мономерный белок, который может формировать гомодимерный белок по изобретению.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения гомодимерного белка по изобретению, где способ включает:

a) трансфекцию популяции клеток молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению;

b) культивирование популяции клеток;

c) сбор и очистку гомодимерного белка, экспрессированного из популяции клеток.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к вакцине против злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, содержащей иммунологически эффективное количество гомодимерного белка по изобретению или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мономерный белок, который может формировать гомодимерный белок по изобретению, где указанная вакцина является способной запускать как T-клеточный, так и B-клеточный иммунный ответ, и где указанный гомодимерный белок содержит антигенную группу, связанную с указанной злокачественной опухолью или инфекционным заболеванием.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к иммуномодулирующей или иммуностимулирующей композиции против злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, содержащей иммунологически эффективное количество гомодимерного белка по изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей мономерный белок, который может формировать гомодимерный белок по изобретению, где указанная иммуномодулирующая или иммуностимулирующая композиция является способной запускать как T-клеточный, так и B-клеточный иммунный ответ, и где указанный гомодимерный белок содержит антигенную группу, связанную с указанной злокачественной опухолью или инфекционным заболеванием.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания у пациента, где способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту гомодимерного белка по изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей мономерный белок, который может формировать гомодимерный белок по изобретению, где указанный гомодимерный белок содержит антигенную группу, связанную с указанной злокачественной опухолью или инфекционным заболеванием.

ПОДПИСИ К ФИГУРАМ

Фигура 1. Слитые вакцины, используемые в этом исследовании. (A) Схематическая структура слитого белка гомодимерный хемокин-антиген (вакцинотела). Указаны нацеливающая группа, группа для димеризации и антигенная группа, также как фрагменты, экспрессированные в различных группах. Во всех конструкциях группа для димеризации и шарнир происходят из IgG3 человека. Линкер G₃S₂G₃SG соединяет экзоны шарнира h1+h4 с доменом CH3. Линкер GLSGL соединяет CH3 и антигенную группу, в то время как линкер (G₄S)₃ соединяет V_H и V_L в антигенной группе. (B) Последовательности NH2-конца (а.к. 1-12) изоформ CCL3 человека, и контроль для них с точечной мутацией (C11S, указанный жирным). Штрих обозначает делецию. (C) Точечная мутация C11S предположительно разрушает S-S мостик в структуре хемокина (справа).

Фигура 2. Характеризация LD78-экспрессирующих вакцинотел посредством ELISA и вестерн-блоттинга.

Супернатанты временно трансфицированных клеток 293E, собранные на сутки 5, тестировали в ELISA с использованием mAb, специфических для различных компонентов молекул вакцинотел. (A), кодирующие scFv³¹⁵ вакцинотела с указанными нацеливающими группами оценивали посредством связывания с покрытием DNP-BSA (связывает scFv³¹⁵) и детекции с помощью биотинилированного HP6017 (связывает мотив для димеризации CH3). (B), кодирующие CκCκ вакцинотела с указанными нацеливающими группами оценивали посредством связывания с покрытием 187.1 mAb (связывает Cκ мыши) и детекции с помощью биотинилированного mAb 187.1. (C), кодирующие HA вакцинотела с указанными нацеливающими группами оценивали посредством связывания с MCA878-G (против мотива для димеризации CH3) и детекции с помощью биотинилированного mAb H36-4-52 против HA. (D), Вестерн-блоттинг вакцинотел с использованием в качестве зонда биотинилированного HP6017 в невосстанавливающих условиях. Слева направо, (LD78Fv³¹⁵)2, (LD78βC11SFv³¹⁵)2 и (LD78-2Fv³¹⁵)2.

Фигура 3. Белки вакцинотела LD78β связывают рецепторы хемокинов на клетках человека. Указанные гомодимерные белки при 25 мкг/мл смешивали с клетками HEK 293, стабильно трансфицированными CCR5 человека (A, B), или CCR1 человека (C, D). Связанные белки вакцинотела детектировали посредством биотинилированного mAb Ab2.1-4, специфического для антигенной группы scFv³¹⁵, затем PE-стрептавидина. Жирные линии: вакцинотела (LD78βFv³¹⁵)2 (A, C) и (LD78β-2Fv³¹⁵)2 (B, D). Пунктирная линия в (A): (LD78β(C11S)Fv³¹⁵)2. Закрашенная гистограмма: только биотинилированное mAb Ab2.1-4 и PE-стрептавидин.

Фигура 4. Белки вакцинотела LD78β связывают рецепторы хемокинов мыши и индуцируют хемотаксис клеток мыши. Вакцинотело (LD78βFv³¹⁵)2 (незакрашенная гистограмма), но не вариант C11S (закрашенная гистограмма), связывается со спленоцитами CD11b+ BALB/c (A) и обладает хемотактической активностью для лимфоцитарных клеток Esb/MP (B).

Фигура 5. Вакцинотело с нацеливающей группой LD78β эффективно доставляет антиген к APC мыши (A) и человека (B) для рестрицированного по MHC класса II представления CD4+ T-клеткам. (A) Различные количества очищенных вакцинотел, обладающих scFv³¹⁵ в качестве антигенной группы, смешивали с облученными (8 Гр) спленоцитами BALB/c, с последующим добавлением Id(λ2³¹⁵)-специфических Th2 T-клеток от трансгенных по TCR мышей. Затем 48-часовые культуры сенсибилизировали 3H-тимидином в течение 24 час. (B) Различные количества содержащих Cκ мыши супернатантов вакцинотел (выраженные как молярная концентрация (M) CκCκ) от временно трансфицированных клеток 293E смешивали с DR4*01 PBMC, которые затем облучали и смешивали со специфическими для CK мыши T18 T-клетками. Через 48 часов планшет сенсибилизировали 3H-тимидином в течение 24 часов.

Фигура 6. Иммунные ответы против Id³¹⁵ у мышей, иммунизированных ДНК вакцинотела LD78βFv³¹⁵. Мышей иммунизировали внутрикожным введением ДНК с немедленной последующей электропорацией участка инъекции. Указаны тип вакцинотел и контролей. Сыворотку, полученную через 3 недели, тестировали на антитела анти-Id IgG1 (A) или IgG2a (B), связывающие белок миеломы M315. Показано среднее вплоть от 7 мышей на группу, значения p относятся к LD78β по сравнению LD78β (C11S) (*), и к LD78β по сравнению с вакцинотелом (FvNIP)2 (**) на неделе 4.

Фигура 7. Индукция ответов специфических для гемагглютинина вируса гриппа CD4+ и CD8+ T-клеток посредством LD78β-вакцинотел. Мышей (n=3) иммунизировали внутрикожным введением ДНК с немедленной последующей электропорацией участка инъекции (Dermavax, Cytopulse, USA). Типы вакцинотел и контролей указаны. Мышей умерщвляли через 3 недели, и индивидуальные суспензии спленоцитов использовали в анализах ELISPOT с указанными рестрицированными по MHC класса II и класса I синтетическими пептидами HA или с не относящимся к делу пептидом. Оценивали ответы IFNγ, значения p относятся к LD78β по сравнению с LD78βC11S и LD78β по сравнению с 0,9% NaCl (*), и к LD78βC11S по сравнению с 0,9% NaCl (**).

Фигура 8. Вакцинотела LD78β связываются с CCR5 макака-резуса. Белки вакцинотела при 25 мкг/мл смешивали с HEK 293, стабильно трансфицированными CCR5 макака-резуса. Связанные белки вакцинотела детектировали посредством биотинилированного mAb Ab2.1-4, специфического для антигенной группы scFv³¹⁵, затем PE-стрептавидина. Жирной линией указаны вакцинотела (LD78βFv³¹⁵)2 в (A) и (LD78β-2Fv³¹⁵)2 в (B). Пунктирной линией в (A) указано вакцинотело (LD78β(C11S)Fv³¹⁵)2. Как в A, так и в B закрашенные гистограммы обозначают только биотинилированное mAb Ab2.1-4 и PE-стрептавидин.

Фигура 9. Защита против летального заражения гриппом. Мышей Balb/c иммунизировали один раз внутрикожно с помощью 25 мкг ДНК в сочетании с электропорацией (DermaVax), и заражали через l4 суток (n=6/группу) летальной дозой вируса гриппа PR8 (H1N1).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эффективность ДНК-вакцин необходимо увеличивать. Многообещающим способом для мышей является конструирование ДНК, кодирующей слитый белок, нацеливающий антиген на антигенпредставляющие клетки (APC) через рецепторы хемокинов. Является критическим расширение этого способа для улучшенных ДНК-вакцин для крупных животных и человека. По настоящему изобретению хемокины MIP-Ια человека можно сливать с различными антигенными группами. Слитые белки сохраняют функциональную активность и конформационную правильность нацеливающих и антигенных групп, соответственно. Слитые белки могут улучшать способность к ответу клональных CD4+ T-клеток человека. Более того, поскольку слитые белки LD78β связывают рецепторы хемокинов мышей, ДНК-вакцины для человека можно тестировать на мышах. Слитые вакцины ДНК LD78β по настоящему изобретению индуцируют улучшенные ответы T-клеток и антител у мышей после инъекции плазмиды и электропорации кожи. Ответы CD8+ T-клеток являются особенно усиленными, что указывает на эффективное перекрестное примирование. Авторы настоящего изобретения доказали, что укороченный на две аминокислоты с NH₂-конца вариант LD78β обладает превосходным связыванием с клетками мыши по сравнению с полноразмерным LD78β in vitro. Неожиданно, для полноразмерного варианта LD78β показали превосходный эффект в модели на мышах in vivo. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что белки LD78β-вакцины связывают CCR5 макака-резуса, предваряя направленную ДНК иммунизацию у не относящихся к человеку приматов.

Вакцинотела по настоящему изобретению могут представлять собой рекомбинантные гомодимерные вакцины на основе Ig, где каждая цепь состоит из нацеливающей группы, непосредственно присоединенной к шарниру Ig и CH3, комбинация которых индуцирует ковалентную гомодимеризацию (фиг. 1A).

В то время как CCL3 мыши представляет собой ген с одной копией, кодирующий зрелый хемокин из 69 а.к., гомолог человека дуплицирован и мутирован с образованием двух неаллельных вариантов, LD78α (CCL3) и LD78β (CCL3-L1), где оба обладают 74% гомологией с CCL3 мыши. Два варианта разделяют 96% гомологию, где различия представляют собой S или P в положении 2 и перемену местами G и S в положениях 39 и 47.

По настоящему изобретению варианты и различные антигенные группы CCL3 человека можно конструировать и экспрессировать как функциональные белки. В частности, настоящее изобретение относится к использованию LD78β и его природных изоформ в слитых вакцинах для нацеливания доставки антигена на антигенпредставляющие клетки.

Целью вакцинотел по настоящему изобретению является улучшение иммуногенности вакцин (иммуностимулирующих композиций). В объем настоящего изобретения включены ДНК-вакцины, кодирующие слитый белок, нацеливающие доставку антигена на рецепторы LD78β на профессиональных антигенпредставляющих клетках.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вакцинотела, содержащие LD78β или его NH₂-укороченные варианты, связывали клетки, экспрессирующие CCR1 и/или CCR5 (рецепторы для LD78β) мыши или макака-резуса, или человека in vitro и давали возможность усиленной доставки антигена in vitro, также как увеличенных гуморальных и клеточных иммунных ответов in vivo после инъекции ДНК и электропорации, по сравнению с контрольными, не нацеленными вакцинотелами.

Рекомбинантные белки по настоящему изобретению могут представлять собой подобные антителам человека молекулы, пригодные для лечения множества типов злокачественных опухолей или инфекционных заболеваний, включая множественную миелому. Эти молекулы, обозначаемые также как вакцинотела, связывают APC и являются способными запускать как T-клеточный, так и B-клеточный иммунный ответ. Более того, вакцинотела образуют двухвалентную связь с APC для стимуляции более эффективной индукции сильного иммунного ответа. Вакцинотела содержат димер из мономерных звеньев, состоящих из нацеливающей группы со специфичностью к молекуле поверхности APC, присоединенных через мотив для димеризации, такой как шарнирная область и домен Cy3, к антигенной группе, где последняя находится на COOH-конце или NH₂-конце. Настоящее изобретение также относится к последовательности ДНК, кодирующей этот рекомбинантный белок, к экспрессирующим векторам, содержащим эти последовательности ДНК, к линиям клеток, содержащим указанные экспрессирующие векторы, к лечению млекопитающих, предпочтительно посредством иммунизации ДНК вакцинотела, РНК вакцинотела или белком вакцинотелом, и, наконец, к лекарственным средствам и набору, содержащим указанные молекулы.

Мотив для димеризации в белках по настоящему изобретению можно конструировать с включением шарнирной области и иммуноглобулинового домена (например, домена Cy3), например, карбокси-концевого домена C (домена C_H3), или последовательности, которая является по существу гомологичной указанному домену C. Шарнирная область может происходить из Ig и вносить вклад в димеризацию посредством формирования межцепьевой ковалентной связи (связей), например, дисульфидного мостика (мостиков). Кроме того, она функционирует как гибкий спейсер между доменами, позволяющий двум нацеливающим группам одновременно связываться с двумя молекулами-мишенями на APC, экспрессированными на различных расстояниях. Домены иммуноглобулинов вносят вклад в гомодимеризацию посредством нековалентных взаимодействий, например, гидрофобных взаимодействий. В предпочтительном варианте осуществления домен C_H3 происходит из IgG. Эти мотивы для димеризации можно заменять другими группами для мультимеризации (например, из других изотипов/подклассов Ig). Предпочтительно, мотив для димеризации происходит из природных белков человека, таких как IgG человека.

Следует понимать, что мотив для димеризации может иметь любую ориентацию по отношению к антигенной группе и нацеливающей группе. В одном варианте осуществления антигенная группа находится на COOH-конце мотива для димеризации с нацеливающей группой на N-конце мотива для димеризации. В другом варианте осуществления антигенная группа находится на N-конце мотива для димеризации с нацеливающей группой на COOH-конце мотива для димеризации.

В международной заявке WO 2004/076489, содержание которой таким образом приведено в качестве ссылки, описаны последовательности нуклеиновой кислоты и векторов, которые можно использовать по настоящему изобретению.

Белки по настоящему изобретению могут является пригодными для индукции иммунного ответа против любого полипептида любого происхождения. Любую антигенную последовательность достаточной длины, содержащую специфический эпитоп, можно использовать в качестве антигенной группы в белках по изобретению. Минимальная длина такой антигенной группы может составлять приблизительно 9 аминокислот. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антигенная группа содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из 9 аминокислот, соответствующих по меньшей мере приблизительно 27 нуклеотидам в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей такую антигенную группу. Такая антигенная последовательность может происходить из белков злокачественных опухолей или инфекционных агентов. Примерами таких последовательностей злокачественных опухолей являются теломераза, более конкретно hTERT, тирозиназа, антиген меланомы TRP-1/TRP-2, специфический антиген предстательной железы и идиотипы. Инфекционные агенты могут иметь бактериальное происхождение, например, антигены туберкулеза и OMP31 бруцеллеза, или вирусное происхождение, более конкретно, происходящие из HIV последовательности, подобные, например, происходящим из gp120 последовательностям, гликопротеин D из HSV-2, и антигены вируса гриппа, подобные гемагглютинину, нуклеопротеину и M2. Вставка таких последовательностей в формате вакцинотела может также приводить к активации обеих ветвей иммунного ответа. Альтернативно, антигенная группа может представлять собой антитела или их фрагменты, такие как C-концевой scFv, происходящий из моноклональных Ig, продуцируемых клетками миеломы или лимфомы, называемых также M-компонент миеломы/лимфомы у пациентов с B-клеточной лимфомой или множественной миеломой. Такой scFv представляет идиотипический антиген.

В одном конкретном варианте осуществления, также используемом в примерах, описанных в настоящем документе, антигенная группа белка по настоящему изобретению представляет собой scFv белка миеломы M315, полученного из плазмацитомы MOPC315.4 BALB/c. Легкая цепь λ2³¹⁵ M315 несет три определенных соматических мутации в петле CDR3 и функционирует как модель идиотипического T-клеточного эпитопа в хорошо определенной системе (Bogen, Malissen et al. 1986; Bogen and Lambris 1989).

Иммунизация посредством белка вакцинотела, ДНК вакцинотела или РНК вакцинотела, где две последние выполняют, например, посредством внутримышечной или внутрикожной инъекции с последующей электропорацией или без нее, все являются целесообразными способами.

Нацеливающая группа белков по изобретению нацеливает белок на APC посредством связывания с рецепторами хемокинов.

Белки по настоящему изобретению можно собирать на уровне генов, и трансфицировать ДНК подходящую клетку-хозяина, такую как клетки NSO, клетки 293E, клетки CHO или клетки COS-7. Трансфектанты продуцируют и секретируют рекомбинантные белки.

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему вышеописанные белки, последовательности ДНК/РНК или экспрессирующие векторы на рекомбинантной основе по изобретению. Когда это целесообразно, это лекарственное средство, кроме того, содержит фармацевтически совместимый носитель. Пригодные носители и составление таких лекарственных средств известны специалисту в данной области. Пригодные носители представляют собой, например, общепринятые забуференные фосфатом растворы солей, воду, эмульсии, например, эмульсии масло/вода, увлажняющие средства, стерильные растворы и т.д. Лекарственные средства можно вводить перорально или парентерально. Способы парентерального введения включают местное, внутриартериальное, внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное введение. Пригодную дозу определяет лечащий врач, и она зависит от различных факторов, например, возраста, пола и массы пациента, вида введения и т.д.

Более того, настоящее изобретение относится к вакцинной композиции или иммуностимулирующим композициям против злокачественной опухоли или инфекционных заболеваний, содержащим иммунологически эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу по изобретению, или ее вырожденных вариантов, где указанная композиция является способной запускать как T-клеточный, так и B-клеточный иммунный ответ. Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему ДНК, РНК или белок вакцинотела для диагностических, медицинских или научных целей.

Кроме того, изобретение относится к способу получения рекомбинантной молекулы по изобретению, включающему трансфекцию популяции клеток вектором, содержащим молекулу по изобретению; культивирование популяции клеток; сбор рекомбинантного белка, экспрессированного из популяции клеток; и очистку экспрессированного белка.

Вышеописанные нуклеотидные последовательности можно предпочтительно вставлять в вектор, пригодный для генотерапии, например, под контролем специфического промотора, и вводить в клетки. В предпочтительном варианте осуществления вектор, содержащий указанную последовательность ДНК, представляет собой вирус, например, аденовирус, вирус осповакцины или аденоассоциированный вирус. Ретровирусы являются особенно предпочтительными. Примерами подходящих ретровирусов являются, например, MoMuLV или HaMuSV. С целью генотерапии последовательности ДНК/РНК по изобретению можно также транспортировать к клеткам-мишеням в форме коллоидных дисперсий. Они содержат, например, липосомы или липоплексы.

Настоящее изобретение относится также к использованию полипептидов или доменов или мотивов внутри полипептидов, обладающих какой-либо степенью идентичности последовательности или гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью (последовательностями), определенными в настоящем документе, или с полипептидом, обладающим специфическими свойствами, определенными в настоящем документе. Настоящее изобретение относится, в частности, к пептидам, обладающим какой-либо степенью идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или его гомологами. В настоящем документе термин «гомолог» обозначает молекулу, обладающую идентичностью последовательности с рассматриваемыми аминокислотными последовательностями или с рассматриваемыми нуклеотидными последовательностями, где рассматриваемая аминокислотная последовательность предпочтительно представляет собой SEQ ID NO: 1.

В одном аспекте гомологичная аминокислотная последовательность и/или нуклеотидная последовательность должна обеспечивать и/или кодировать полипептид, который сохраняет функциональную активность и/или улучшает активность полипептида из SEQ ID NO: 1.

В настоящем контексте гомологичную последовательность принимают как включающую в себя аминокислотную последовательность, которая может являться по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной рассматриваемой последовательности. Как правило, гомологи содержат такие же активные участки и т.д., как и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Хотя гомологию можно также рассматривать в отношении сходства (т.е. аминокислотных остатков, обладающих сходными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения она предпочтительно выражает гомологию в отношении идентичности последовательности.

Сравнения идентичности последовательностей можно проводить визуально или, более обычно, с помощью легко доступных программ сравнения последовательностей. В этих коммерчески доступных компьютерных программах используют комплексные алгоритмы сравнения для сравнения двух или более последовательностей, которые наилучшим образом отражают эволюционные события, которые могут приводить к различию (различиям) между двумя или более последовательностями. Таким образом, эти алгоритмы работают с системой балльной оценки с вознаграждением за выравнивание идентичных или сходных аминокислот и штрафом за вставку пропусков, расширения пропусков и выравнивание не сходных аминокислот. Система балльной оценки алгоритмов сравнения включает в себя:

i) присвоение штрафного балла каждый раз при вставке пропуска (балл штрафа за открытие),

ii) присвоение штрафного балла каждый раз при расширении существующего пропуска на дополнительное положение (балл штрафа за расширение),

iii) присвоение высоких баллов при выравнивании идентичных аминокислот, и

iv) присвоение различных баллов при выравнивании неидентичных аминокислот.

Большинство программ для выравнивания позволяют модификацию штрафов за пропуски. Однако является предпочтительным использование значений по умолчанию при использовании такого программного обеспечения для сравнений последовательностей.

Баллы, данные за выравнивание неидентичных аминокислот, присваивают согласно матрице баллов, называемой также матрицей замен. Баллы, представленные в таких матрицах замен, отражают то, что вероятность замены одной аминокислоты на другую в ходе эволюции варьирует и зависит от физической/химической природы аминокислоты, подлежащей замене. Например, вероятность замены полярной аминокислоты на другую полярную аминокислоту выше по сравнению с заменой на гидрофобную аминокислоту. Таким образом, матрица баллов приписывает наивысший балл для идентичных аминокислот, более низкий балл для не идентичных, но сходных аминокислот, и даже более низкий балл для не идентичных, не сходных аминокислот. Наиболее часто используемыми матрицами баллов являются матрицы PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), матрицы BLOSUM (Henikoff and Henikoff (1992)) и матрица Gonnet (Gonnet et al. (1992)).

Пригодные компьютерные программы для проведения такого выравнивания включают в себя, но без ограничения, Vector NTI (Invitrogen Corp.) и программы ClustalV, ClustalW и ClustalW2 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). Подборка различных инструментов для выравнивания доступна с сервера ExPASy Proteomics на www.expasy.org. Другим примером программного обеспечения, которое может проводить выравнивание последовательностей, является BLAST (Базовый инструментарий поиска локальных блоков), который является доступным с web-страницы Национального центра биотехнологической информации, которую в настоящее время можно найти на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, и который впервые был описан в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410.

После получения выравнивания от программного обеспечения можно рассчитать % сходства и % идентичности последовательности. Программное обеспечение, как правило, выполняет это как часть сравнения последовательностей и получает числовой результат.

В одном варианте осуществления является предпочтительным использование программного обеспечения ClustalW для проведения выравниваний последовательностей. Предпочтительно, выравнивание с помощью ClustalW проводят со следующими параметрами для попарного выравнивания:

Матрица замен:	Gonnet 250
Штраф за открытие пропуска:	20
Штраф за расширение пропуска:	0,2
Штраф за окончание пропуска:	Нет

ClustalW2, например, сделан доступным в интернет Европейским институтом биоинформатики на web-странице EMBL-EBI www.ebi.ac.uk под tools - sequence analysis - ClustalW2. В настоящее время точный адрес инструмента ClustalW2 представляет собой www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.

В другом варианте осуществления является предпочтительным использование программы Align X в Vector NTI (Invitrogen) для проведения выравнивания последовательностей. В одном варианте осуществления Exp10 можно использовать с параметрами по умолчанию:

Штраф за открытие пропуска: 10

Штраф за расширение пропуска: 0,05

Диапазон штрафа за расстояние между пропусками: 8

Матрица баллов: blosum62mt2

Таким образом, настоящее изобретение относится также к использованию вариантов, гомологов и производных любой аминокислотной последовательности белка, полипептида, мотива или домена, как определено в настоящем документе, в частности, вариантов, гомологов и производных SEQ ID NO: 1.

Последовательности, в частности, последовательности вариантов, гомологов и производных SEQ ID NO: 1, могут также обладать делециями, вставками или заменами аминокислотных остатков, которые образуют молчащую замену и приводят в результате к функционально эквивалентному веществу. Преднамеренные замены аминокислот можно осуществлять на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков, при условии, что сохраняется вторичная связывающая активность вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, обладающие сходными значениями гидрофильности, включают лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.

Настоящее изобретение относится также к консервативным заменам (как замещение, так и замену применяют в настоящем документе для обозначения обмена существующего аминокислотного остатка на альтернативный остаток), которые могут происходить, т.е. к замене подобного подобным, например, основного на основной, кислого на кислый, полярного на полярный и т.д. Может происходить также неконсервативная замена, т.е. одного класса остатков на другой или, альтернативно, включение вставки неприродных аминокислот, таких как орнитин (далее в настоящем документе обозначенный как Z), диаминомасляная кислота-орнитин (далее в настоящем документе обозначенный как B), норлейцин-орнитин (далее в настоящем документе обозначенный как O), пиридилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.

Консервативные замены, которые можно выполнять, находятся, например, в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), алифатических аминокислот (аланин, валин, лейцин, изолейцин), полярных аминокислот (глутамин, аспарагин, серин, треонин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин), гидроксиаминокислот (серин, треонин), больших аминокислот (фенилаланин и триптофан) и малых аминокислот (глицин, аланин).

Можно выполнять также замены на неприродные аминокислоты, включая альфа* и альфа-дизамещенные* аминокислоты, N-алкиламинокислоты*, молочную кислоту*, галогенидные производные природных аминокислот, такие как трифтортирозин*, p-Cl-фенилаланин*, p-Br-фенилаланин*, p-I-фенилаланин*, L-аллилглицин*, β-аланин*, L-α-аминомасляную кислоту*, L-γ-аминомасляную кислоту*, L-α-аминоизомасляную кислоту*, L-ε-аминокапроновую кислоту*, 7-аминогептановую кислоту*, L-метионинсульфон^#*, L-норлейцин*, L-норвалин*, п-нитро-L-фенилаланин*, L-гидроксипролин*, L-тиопролин*, метильные производные фенилаланина (Phe), такие как 4-метил-Phe*, пентаметил-Phe*, L-Phe(4-амино)^#, L-Tyr(метил)*, L-Phe(4-изопропил)*, L-Tic (l,2,3,4-тетрагидроизохинолин