Gp41-нейтрализующие антитела и их применение

Gp41-нейтрализующие антитела и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США No.61/702703, поданной 18 сентября 2012; предварительной заявки на патент США No.61/698480, поданной 7 сентября, 2012; предварительной заявки на патент США No.61/672708, поданной 17 июля 2012; и предварительной заявки на патент США No.61/556660, поданной 7 ноября 2011. Каждая из этих предварительных заявок вводится в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к идентификации моноклональных нейтрализующих антител, таких как, но не ограничивающихся ими, антитела, которые связываются с мембрано-проксимальной областью gp41 ВИЧ-1.

Предшествующий уровень техники

Для индукции нейтрализующих антител (NAb), которые блокируют проникновение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в клетки человека необходимо получить эффективную вакцину на основе ВИЧ-1. Эффективными антителами, индуцируемыми вакциной, являются такие антитела, которые будут обладать активностью против большинства штаммов ВИЧ-1 в кровотоке. К сожалению, существующие в настоящее время вакцины против ВИЧ-1 не способны индуцировать активные NAb широкого спектра. Главная проблема при разработке более эффективных вакцин заключается в том, что в настоящее время имеется лишь ограниченная информация о том, какая именно область оболочечных гликопротеинов ВИЧ-1, таких как gp120 и gp41, распознается нейтрализующими антителами (NAb). У ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов было выделено несколько нейтрализующих моноклональных антител (mAb), и эти mAb распознают специфические области (эпитопы) на вирусе, который является восприимчивым к действию NAb.

Хотя гликопротеины оболочки являются иммуногенными и индуцируют ряд антител, однако, такие индуцируемые нейтрализующие антитела являются штамм-специфическими, а большинство иммунных ответов переключается на не-нейтрализующие детерминанты (Weiss, R.A., et al., Nature, 1985. 316 (6023): p. 69-72; Wyatt, R. and J. Sodroski, Science, 1998. 280 (5371): p. 1884-8). Нейтрализующие антитела широкого спектра лишь в редких случаях были выделены от индивидуумов, инцифированных природным ВИЧ. Можно привести три примера нейтрализующих антител широкого спектра, которые связываются с gp41, а именно, антител 2F5, 4E10 и Z13E1. Эти gp41-нейтрализующие антитела распознают мембрано-проксимальную область (MPER) гликопротеина gp41 ВИЧ-1. К сожалению, эти антитела ограничены по своей перекрестной реактивности с различными штаммами или по своей активности, а поэтому, пока не существует практически осуществимой альтернативы для их применения в целях терапии. Таким образом, необходимо разработать способы получения моноклональных нейтрализующих антител широкого спектра, которые могли бы обеспечить защиту от действия инфекционного агента, такого как ВИЧ.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным нейтрализующим антителам человека, которые специфически связываются с gp41. В некоторых примерах была оптимизирована связывающая и/или нейтрализующая способность этих антител. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим описанные в настоящем документе антитела, которые специфически связываются с gp41; к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти антитела; к векторам экспрессии, содержащим нуклеиновые кислоты; и к выделенным клеткам-хозяевам, экспрессирующим такие нуклеиновые кислоты. Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающим фрагментам выделенных антител.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с gp41 и контактируют с L, WF, LW и R в аминокислотной последовательности LWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, остатки 14-28), являются нейтрализующими. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с gp41 и контактируют с NWF, T и R в аминокислотной последовательности NWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13, остатки 7-19), являются нейтрализующими. В своих ⋅дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение также относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислоты 26-33 (гипервариабельная область тяжелой цепи 1 (HCDR1)), 51-60 (HCDR2), или 99-120 (HCDR3) последовательности SEQ ID NO: 11, где X₁ представляет собой Q или R, X₂ представляет собой V или A, X₃ представляет собой S или Y, а X₄ представляет собой T или I. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с gp41 ВИЧ-1 и являются нейтрализующими. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую цепь, содержащую одну или более аминокислот 26-33 (HCDR1), 51-60 (HCDR2) и 99-120 (HCDR3) любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 147-149, 189-192 или 200-204. В некоторых варианта осуществления тяжелая цепь выделенного моноклонального антитела человека содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 147-149, 189-192 или 200-204. В других вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 147-149, 189-192 или 200-204.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержат легкую цепь, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления изобретения, легкая цепь содержит аминокислоты 26-31 (гипервариабельная область легкой цепи 1 (LCDR1)), 49-51 (LCDR2) и 88-99 (LCDR3) последовательности SEQ ID NO: 12, где Х₄ представляет собой Е или D, Х₅ представляет собой Y или Н, Х₆ представляет собой K или I, Х₇ представляет собой V или I, X₈ представляет собой S или Т, Х₉ представляет собой D или Е, Х₁₀ представляет собой Е или D, а Х₁₁ представляет собой Т или I. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, легкая цепь содержит аминокислоты 26-31 (LCDR1), 49-51 (LCDR2) или 88-99 (LCDR3) любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152 или 164-186. В некоторых вариантах осуществления изобретения, легкая цепь выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152 или 164-186. В одном из вариантов осуществления изобретения, легкая цепь выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152 или 164-186.

В некоторых своих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или к его антигенсвязывающему фрагменту, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Антитело специфически связывается с gp41 ВИЧ-1 и является нейтрализующим. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или к его антигенсвязывающему фрагменту, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 154, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152. Антитело специфически связывается с gp41 ВИЧ-1 и является нейтрализующим. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или к его антигенсвязывающему фрагменту, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152. Антитело специфически связывается с gp41 ВИЧ-1 и является нейтрализующим.

Описанные в настоящем документе антитела и композиции могут быть использованы в различных целях, например, для детекции присутствия ВИЧ-1 в биологическом образце или для диагностики СПИД'а. Эти способы могут включать приведение в контакт образца, взятого у индивидуума, с моноклональным антителом человека, которое специфически связывается с gp41, и детекцию связывания антитела с образцом. Повышение уровня связывания антитела с образцом, по сравнению с уровнем связывания антитела с контрольным образцом, позволяет выявить у индивидуума ВИЧ-1-инфекцию и/или СПИД. В некоторых неограничивающих примерах, повышение уровня связывания антитела с образцом, по сравнению с уровнем связывания антитела с контрольным образцом, указывает на присутствие ВИЧ-1.

Также описан способ лечения индивидуума с ВИЧ-инфекцией, такого как, но не ограничивающегося им, индивидуум со СПИД'ом. Способы содержат введение индивидууму терапевтически эффективного количества описанного выше моноклонального антитела.

Вышеуказанные и другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут более очевидны из нижеследующего подробного описания некоторых вариантов осуществления изобретения, которые приводятся со ссылками на прилагаемый графический материал.

Краткое описание графического материала

На фиг. 1A-1C приводится серия таблиц и диаграмм, где проиллюстрированы анализы последовательности антитела 10E8 и анализы на нейтрализацию. (A) Приводятся гены зародышевой линии, кодирующие вариабельные области антител 10E8, 7H6 и 7N16. (B) Проиллюстрирована нейтрализующая активность антител против белка оболочки (Env) изолята 181 панели псевдовирусов ВИЧ-1. На дендрограммах показана генетическая удаленность белка gp160 от первичного изолята Env ВИЧ-1. (C) В приведенных ниже данных дендрограммы указано число тестируемых вирусов, процент нейтрализованных вирусов и геометрическое среднее IC₅₀ для нейтрализованных вирусов с IC₅₀<50 мкг/мл. Средние титры были получены по всем тестируемым вирусам, включая титры с IC₅₀>50 мкг/мл, которые принимаются за 100.

На фиг. 2A и 2B проиллюстрирована специфичность связывания 10E8. (A) Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) на связывание mAb 10E8 или 4E10 с пептидом gp140, gp120, gp41 или с пептидом для 4E10. Величины ошибок означают одну стандартную ошибку среднего (ср. кв. откл.). (B) Ингибирование нейтрализации вируса C1 ВИЧ-2/ВИЧ-1 MPER антителами mAb 10E8 или 4E10 под действием аланин-сканирующих пептидов 4E10. Пептиды инкубировали с mAb 4E10 или 10E8 за один час до инфицирования клеток TZM-bl. На оси Y указаны проценты нейтрализации для каждого условия. Остатки W₆₇₂, F₆₇₃, T₆₇₆ и R₆₈₃ присутствуют в положениях, в которых мутантный по аланину пептид не блокирует нейтрализацию (R₆₈₃ только для антитела 10E8). Показаны остатки 16-28 SEQ ID NO: 26.

На фиг. 3A и 3B представлена серия графиков и серия цифровых изображений, на которых проиллюстрированы анализы на аутореактивность 10E8. (A) Анализ, проводимый методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) на связывание 10E8 с анионными фосфолипидами. 10E8 инъецировали поверх липосом PC-CLP или липосомы PC-PS, иммобилизованных на сенсорном чипе BIACORE® L1. 4E10 и 2F5 использовали в качестве положительного контроля, а 13H1, 17b и антитело против белка RSVF использовали в качестве отрицательного контроля. (B) Реактивность 10E8 с эпителиальными клетками HEP-2. Выше контроль с VRC01 добавлен как дополнительный отрицательный контроль. Концентрация антитела составляла 25 мкг/мл. Все фотографии были получены с увеличением 400x.

На фиг. 4A-4H представлена серия ленточных диаграмм, иллюстрирующих кристаллическую структуру антитела 10E8 в комплексе с его эпитопом MPER gp41. (A) 10E8 распознает высококонсервативную спираль gp41 и нейтрализует ВИЧ-1. Fab-фрагмент 10E8 показан на ленточной диаграмме (темно-серым показана тяжелая цепь, а светло-серым показана легкая цепь) в комплексе с пептидом gp41 (показан темно-серым), который охватывает MPER (Asn₆₅₆-Arg₆₈₃; NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO:26)). (B) Граница между 10E8 и gp41 с выбранными боковыми цепями 10E8 и боковыми цепями gp41 показана в виде прямых черточек. Если провести аналогию с рукой, то шарнирная область имеет такой вид, как будто она сжата большим пальцем (представлена CDR H2), C-концевая спираль как бы подвешена вдоль соответствующего удлиненного указательного пальца (представлена CDR H3), а остатки, с которых начинается С-концевая спираль, как бы захвачены большим и указательным пальцами (представлены стыком петель CDR). (C-D) Скрытые контактные поверхности и консервативность эпитопа. Оценка поверхности скрытого контакта на gp41 (серый; C) показала, что остатки эпитопа (помеченные, D), которые непосредственно контактируют с 10E8, являются в высокой степени консервативными во всех 2870 оцененных штаммах (проценты консервативности показаны в скобках; см. также фиг. 26-28). E-H. Аланиновый мутагенез паратопа и эпитопа. Остатки, находящиеся на конце петли CDR H3 10E8 и в гидрофобной щели, играют важную роль в распознавании gp41 и в нейтрализации вируса (фиг. 31-32), и эти остатки были картированы на скрытой 10E8-контактирующей поверхности (E, G). Эти результаты отражают эффекты аланин-сканирующего мутагенеза эпитопа для 10E8 (фиг. 18-19), картированного по поверхности скрытого gp41-контакта (F, H). Сравнение эффектов аланин-сканирующего мутагенеза паратопа и эпитопа показано, что остатки эпитопа, имеющие наиболее важное значение для распознавания антителом 10E8 и нейтрализации вируса, также являются в высокой степени консервативными (D).

На фиг. 5A и 5B представлены таблица, серия графиков и схематическая диаграмма, на которых проиллюстрирован сайт восприимчивости к gp41. (A) Влияние вариабельности последовательностей на нейтрализацию антителом 10E8. Также представлены предсказанные аминокислотные последовательности в эпитопе, связывающимся с 10E8, для трех 10E8-резистентных вирусов и вируса, выделенного у пациента. Связывающая область 10E8 и отличие последовательности от последовательности вируса JR2 показаны светло-серым. Величины IC₅₀ и IC₈₀, которые более чем в 20 раз превышают величины для псевдовируса JR2 дикого типа, выделены светло-серым. Величины ошибок означают одно ср. кв. откл. (B) Определение структуры высококонсервативной области gp41, распознаваемой нейтрализующими антителами. Атомы высококонсервативных остатков, которые непосредственно контактируют с 10E8, представлены серым цветом средней интенсивности и показаны в виде черточек; атомы, закрытые антителом 10E8, показаны темно-серым, а главные атомы, контактирующие с цепью, показаны светло-серым. Полупрозрачные поверхности MPER gp41 заштрихованы в соответствии с имеющимися там атомами. На правой панели показан вид связанного антитела 10Е8, перевернутый на 90°. CDR H3 10E8 взаимодействует с высококонсервативными гидрофобными остатками, а CDR H2 контактирует с главными атомами цепи в положении стыка между N- и C-концевыми спиралями. Многие несвязанные остатки MPER (серые) являются гидрофобными, а особенно в С-концевой спирали. В структуре позднего промежуточного гибрида (фиг. 16), эти остатки обращены к внешней стороне суперспирализованной структуры, а в предгибридной конформации вирусного шипа, эти остатки могут взаимодействовать с вирусной мембраной или с другими гидрофобными областями Env.

На фиг. 6A и 6B проиллюстрировано выравнивание последовательностей тяжелой и легкой цепей анти-gp41 антител 10E8 (SEQ ID NO: 1 и 2), 7H6 (SEQ ID NO: 3 и 4), 7N16 (SEQ ID NO: 5 и 6), IGHV3-15*05 (SEQ ID NO: 7) и последовательности зародышевой линии IGLV3-19*01 (SEQ ID NO: 8). Остатки, показанные светло-серым цветом, означают замены в последовательности зародышевой линии. Точки означают делеции остатков. Нумерация остатков приводится по Кэбату и IMGT, и такая нумерация была использована для идентификации специфических остатков в тяжелой и легкой цепях 10E8.

На фиг. 7 представлен график, иллюстрирующий корреляцию нейтрализующей активности сыворотки, взятой у донора N152, и антитела 10E8. Представлен график зависимости нейтрализующей ID50 сыворотки донора N152 от нейтрализующей ID50 антитела 10E8, протестированных на панели из 20 псевдовирусов. Для оценки корреляции между IC50 10E8 и ID50 N152 была применена непараметрическая корреляция Спирмана.

На фиг. 8A-8C представлены график и серия таблиц, на которых проиллюстрирована специфичность связывания с 10E8. (A) ELISA-анализ на связывание mAb с пептидами MPER, 2F5, Z13e1, 4E10 и 4E10.19. Также представлены аминокислотные последовательности этих пептидов (сверху вниз: SEQ ID NO: 26 с тремя лизинами у N- и C-конца; остатки 1-16 SEQ ID NO: 26, остатки 11-21 SEQ ID NO: 26 с тремя C-концевыми лизинами; остатки 16-24 SEQ ID NO: 26 с тремя C-концевыми лизинами и остатки 16-28 SEQ ID NO: 26 с N-концевым цистеином и с тремя С-концевыми лизинами). (B-C) Ингибирование mAb-нейтрализации MPER C1 химерного вируса ВИЧ-2/ВИЧ-1 путем добавления пептидов MPER, 2F5, Z13e1, 4E10 и 4E10.19. Эффект кратности вычисляли как отношение нейтрализующей IC50 при добавлении пептида-имитатора/IC50 (B) или отношение нейтрализующей IC80 при добавлении пептида-имитатора/IC80 (C) для пептида. Величины >5 выделены светло-серым.

На фиг. 9A и 9B проиллюстрирован анализ, проводимый методом поверхностного плазмонного резонанса, на связывание антитела 10E8, 2F5 и 4E10 с пептидом MPER gp41. (A) Биотинилированный пептид MPER, состоящий из остатков 656-683 gp41, иммобилизовали на чипе со стрептавидином SA (GE Healthcare), и антитело Fab наносили проточным методом поверх аналита при 2-кратном серийном увеличении концентрации в пределах 3,9-125 нМ (10E8), 0,49-31,25 нМ (2F5) и 0,25 нМ - 62,5 нМ (4E10). Были проведены фазы ассоциации и диссоциации в течение трех минут и пяти минут, соответственно, при скорости потока 30 мкл/минуту, где аналит в каждой концентрации использовали с тремя повторностями. (B) Перечисленные константы связывания получали путем построения сенсорограмм по лангмюровской модели 1:1. Представлена аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 26.

На фиг. 10 представлена секторная диаграмма, иллюстрирующая частоту встречаемости ВИЧ-1⁺-сыворотки с данной специфичностью. В этом анализе использовали сыворотку от 78 здоровых ВИЧ-1-инфицированных доноров. Частоту измеряли по способности сыворотки пациента нейтрализовать ВИЧ-2/ВИЧ-1-химеры, содержащие части MPER, и подтверждали путем блокирования пептида. Нейтрализующие ID50 сыворотки показаны на фиг. 21. Кратность изменения ID₅₀ после блокирования пептида проиллюстрирована на фиг. 22. Шесть пациентов с сывороткой, содержащей 10E8-подобные антитела, не отличались от остальных 72 пациентов с точки зрения вирусной нагрузки (6748 копий/мл с 10E8 и 5446 копий без 10E8; p>0,05), числа CD4 (437 клеток/мкл и 557 клеток/мкл; p>0,05), количества лет, прошедших со времени установления диагноза (20 лет и 13 лет; p>0,05), или среднего титра нейтрализации (302 и 156; p>0,05).

На фиг. 11A-11C проиллюстрирована доступность 10E8 к MPER. (A) Связывание 10E8, 4E10 и 2F5 с шипами полноразмерной оболочки ВИЧ_JR-FL, и связывание мутантного 4E10 (Phe673Ser) или мутантного 2F5 (Lys665Glu), экспрессируемых на поверхности клеток 293T, определяли с помощью проточной цитометрии. Серийно разведенное антитело инкубировали с клетками в течение одного часа. Антитела 2G12 и b12 использовали в качестве положительного контроля, а F105 использовали в качестве отрицательного контроля. VRC01 использовали в качестве дополнительного контроля на JR-FL-трансфицированных клетках. Относительный процент связывания вычисляли как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), деленную на максимальную MFI положительного контроля 2G12 X 100. (B) Доступность MPER определяли путем промывки смеси «антитело-вирион» перед инфицированием клеток TZM-b1. Псевдовирусы инкубировали с антителами при 37°C в течение 30 минут, и перед инфицированием клеток-мишеней, смесь «антитело-вирион» либо промывали, либо не промывали. (C) Влияние промывки на нейтрализацию антителом оценивали по площади под кривой (AUC) или по IC80. Для BaL и JRFl, IC80 не достигалась в условиях без промывки, а поэтому была использована наивысшая ингибирующая концентрация (IC60 и IC75, соответственно).

На фиг. 12A и 12B схематически представлены диаграммы, иллюстрирующие сравнение двух копий MPER gp41 в кристаллической асимметрической ячейке. (A) Пептиды gp41 от двух комплексов 10E8-gp41 в кристаллической асимметрической ячейке показаны палочками (комплекс 1, темно-серый; комплекс 2, серый средней интенсивности) в окружении электронов 2fo-fc с плотностью в пределах 1у (темно-серый). Даны изображения, перевернутые относительно друг друга на 180°, и эти изображения даны в такой же ориентации, как и на фиг. 4C и 4D. (B) Выравнивание пептидов в двух кристаллических комплексах. Изображение, перевернутое на 90°, представляет собой суперпозицию двух пептидов в асимметрической ячейке после выравнивания всех атомов остатков 671-683. При таком выравнивании, N-концевая спираль в комплексе 2 сдвинута на 45° относительно первой спирали в комплексе 1. Хотя отличающиеся ориентации N-концевой спирали в двух комплексах позволяют предположить о наличии определенной степени структурной пластичности, однако, было обнаружено, что остатки шарнирной области и С-концевой спирали в двух комплексах являются высококонсервативными и участвуют в наиболее важных взаимодействиях с антителом.

На фиг. 13A-13C представлена серия графиков, иллюстрирующих анализ аланиновых вариантов паратопа 10E8, проводимый методом поверхностного плазмонного резонанса. Показаны сенсорограммы связывания пептида MPER с 25 вариантами паратопа 10E8, а также с 10E8 дикого типа (wt). Варианты IgG иммобилизовали на поверхности биосенсорного чипа со связанным с ним антителом против IgG человека с плотностью 1000-2000 единиц отклика, а затем пептид MPER (указан) наносили впрыскиванием поверх аналита с двукратными серийными разведениями, начиная с 500 нМ (за исключением HCD 30A, W100bA, S100cA, P100fA, начальное серийное разведение которых составляло 250 нМ). Были проведены фазы ассоциации и диссоциации в течение трех минут и пяти минут, соответственно, при скорости потока 30 мкл/минуту. Сенсорограммы были построены по лангмюровской модели 1:1 с использованием компьютерной программы BIACORE® BIAEVALUATION® (GE Healthcare). Константы связывания указаны на фиг. 31. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 26 представлена на фиг. 13C.

На фиг. 14 представлен график, иллюстрирующий корреляцию между связыванием с вариантом 10E8 и нейтрализацией этим вариантом. K_D связывания аланиновых вариантов паратопа 10E8 представлены на графике в зависимости от средних IC50 и IC80 для нейтрализации. Для оценки взаимосвязи между связыванием и нейтрализацией была применена непараметрическая корреляция Спирмана. K_D и нейтрализующие IC50 и IC80 указаны на фиг. 31-32.

На фиг. 15A-15H проиллюстрировано распознавание структурно консервативной С-концевой спирали MPER антителами 10E8 и 4E10. Антитела 10E8 и 4E10 действуют, в основном, по различным механизмам распознавания посредством связывания со структурно консервативной спиралью у С-конца MPER gp41. (A) Конформация MPER и скрытая поверхность для нейтрализующих антител 10E8, 2F5 (данные банка белков Protein DataBank (PDB) ID No. 1TJI вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012), Z13e1 (данные PDB ID No. 3FN0 вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012), и 4E10 (данные PDB ID No. 2FX7 вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012). Приводится ленточное Cα-представление MPER gp41, связанного с каждым из антител, вместе с гистограммами, где указана площадь скрытой поверхности на остаток. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 26 представлена ниже под каждой гистограммой. Последовательность кристаллизованного эпитопа показана прописными буквами. (B) Суперпозиция С-концевой спирали MPER в 10E8-связанной (темно-серый) и 4E10-связанной (светло-серый) конформации показана в ориентации, перевернутой на 90°. Приводится ленточное Cα-представление, где боковые цепи показаны в виде черточек. (C-F) Сравнение распознавания С-концевой спирали MPER антителами 10E8 и 4E10, где молекулы даны в виде Cα-ленточного представления. (C) Вариабельные домены 10E8 в комплексе с MPER заштрихованы, как показано на фиг. 4A. (D) Вариабельные домены 4E10 в комплексе с MPER (данные PDB ID No. 2FX7 вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012) даны в ориентации, созданной исходя из выравнивания С-концевых спиралей gp41, описанных в (B) (левая панель). gp41 окрашен не совсем белым цветом, тяжелая цепь 4E10 окрашена темно-серым, а легкая цепь 4E10 окрашена серым средней интенсивности. (E-F) Перевернутые на 90° виды (C) и (D), если смотреть от C-конца до N-конца консервативной С-концевой спирали MPER. (G,H) Спирально-кольцевые представления 10E8- и 4E10-связанных С-концевых спиралей MPER, отражающие ориентацию, представленную в (B) (правая панель). Показаны контактирующие с антителом поверхности, построенные на основе наблюдаемых прямых контактов между антителами и gp41, как описано на фиг. 35.

На фиг. 16 представлена ленточная диаграмма, иллюстрирующая gp41-сайт восприимчивости, картированный на gp41 в «поздней промежуточной» конформации. gp41-сайт восприимчивости, определенный по футпринту в месте контакта антитела 10E8 на gp41, картировали на 10E8-связанной пептидной структуре MPER (слева, ориентация аналогична показанной на фиг. 6B) и на gp41 в поздней промежуточной 6-спиральной пучковой конформации (данные PDB ID No. 2XR7 (справа) вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012). Атомы, распознаваемые антителом 10E8, закрашены темно-серым и показаны черточками. Атом или остаток, контактирующие исключительно с антителами 2F5, Z13e1 и 4E10, показаны черточками светло-сером цветом или серым цветом средней интенсивности. Определенный с помощью 10E8 сайт восприимчивости обращен наружу от центральной оси пучка, и, вероятно, является наиболее доступным в этой конформации. Потенциальный сайт N-связанного гликозилирования в положении 674 не должен быть совместимым с поздней промежуточной конформацией, поскольку боковая цепь остатка 674 обращена вовнутрь 6-спирального пучка.

На фиг. 17A-17F представлен набор таблиц, иллюстрирующих нейтрализующие свойства 10E8. (A) Способность антител 10E8 и 7H6 нейтрализовать минипанель из 5 изолятов Env псевдовируса. Величины IC50, составляющие менее, чем 1 мкг/мл, показаны серым. (B) Профиль нейтрализации сывороткой пациента N152 и моноклональными антителами. ^aДанные для сыворотки пациента N152 представляют собой ID50 (доза вируса, необходимая для 50% инфицирования) для каждого вируса. ID50>1000 выделены темно-серым, 500<ID50<1000 выделены серым средней интенсивности, а 100<ID50<500 выделены светло-серым. Данные для моноклональных антител представлены как IC50. IC50<1 мкг/мл показана серым средней интенсивности; IC50=1-10 мкг/мл показана светло-серым, а IC50=10-50 мкг/мл показана темно-серым. (C-F) Данные по нейтрализации 181 Env-псевдовируса ВИЧ-1 антителами. IC50<1 мкг/мл показана серым средней интенсивности; IC50=1-10 мкг/мл показана светло-серым, а IC50=10-50 мкг/мл показана темно-серым.

На фиг. 18 представлена таблица, иллюстрирующая связывание 10E8 и 4E10 с аланин-сканированными пептидами MPER gp41, оцененное с помощью ELISA. Кратность изменения вычисляли как отношение IC50 в присутствии пептида/IC50 в присутствии пептида-имитатора. Величина кратности изменения >10 показана светло-серым.

На фиг. 19 представлена таблица, в которой приводятся данные по нейтрализации аланиновых мутантов MPER псевдотипированного ВИЧ-1_JR2 антителом 10Е8. Концентрация дана в мкг/мл. Величины IC50 и IC90, которые в >20 раз превышают величины для нейтрализации JR2 дикого типа антителом 10E8 или в >100 раз для нейтрализации антителом 4E10, показаны светло-серым.

На фиг. 20 представлена таблица, в которой приводится список последовательностей химер ВИЧ-2/ВИЧ-1, используемых в анализах на нейтрализацию. Представлены последовательности 7312A, C1, C1C, C3, C7, C6, C4, C4GW и C8 (SEQ ID NO: 15-22, соответственно). Фрагменты последовательности MPER, которые соответствуют последовательности MPER ВИЧ-1, подчеркнуты.

На фиг. 21 представлена таблица, в которой проиллюстрировано картирование нейтрализующих анти-MPER антител/сывороток с химерами ВИЧ-2/ВИЧ-1. ^aПредставлены IC50 (мкг/мл). ^bПредставлены величины ID50. Цифры выделены жирным и светло-серым, если ID50 для химеры ВИЧ-2/ВИЧ-1 в 3 раза превышают ID50 для контрольного ВИЧ-2 дикого типа и составляют >100. «-» означает отсутствие нейтрализации. «ND» означает, что классификация сыворотки не была определена.

На фиг. 22 представлена таблица, в которой проиллюстрировано блокирование нейтрализации ВИЧ-2/ВИЧ-1-химеры С1, опосредуемой mAb- и сывороткой, с использованием мутантных пептидов MPER. Последовательность блокирующих пептидов представлена на фиг. 8A. ^bКратность изменения IC50 означает отношение IC50 в присутствии пептида/IC50 в присутствии пептида-имитатора. ^cКратность изменения ID50 означает отношение ID50 в присутствии пептида-имитатора/ID50 в присутствии пептида. Серым цветом показано 3-кратное изменение отношения IC50/ID50 по сравнению с контрольным пептидом.

На фиг. 23 представлена таблица, в которой проиллюстрирована реактивность 10E8 с аутоантигенами. Реактивность 10E8 с аутоантигенами детектировали с помощью анализа Luminex. Моноклональное анти-RSV антитело Synagis (Medlmmune, Gaithersburg, MD) использовали в качестве отрицательного контроля. Для сравнения также тестировали антитела 4E10, 2F5, VRC01 и 17b. SSA означает антиген A, вызывающий синдром Сьегрена; SSB означает антиген B, вызывающий синдром Сьегрена; Sm означает антиген Смита; RNP означает рибонуклеопротеин; Sc1 70 означает склеродермию 70; Jo1 означает антиген; CentrB означает центромер B.

На фиг. 24 представлена таблица, в которой указаны собранные данные и статистические данные по уточнению кристаллической структуры 10E8, полученные в проведенных исследованиях. Данные для самого высокого разрешения указаны в скобках. Набор данных был собран для одного кристалла.

На фиг. 25 представлена таблица, в которой указаны углы фи-пси для пептидов gp41, связанных с антителом. ^aДля комплекса 4E10:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 2FX7 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). ^bДля комплекса Z13e1:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 3FN0 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012).

На фиг. 26 представлена таблица, в которой указана общая площадь скрытой поверхности на 10E8 и gp41. Все взаимодействия осуществляли с использованием PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). ^§BSA означает площадь скрытой поверхности, Ų.

На фиг. 27 представлена таблица, в которой указаны площади скрытой поверхности на границе между тяжелой цепью 10E8 и gp41, по остатку. Все взаимодействия осуществляли с использованием PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). ^£Процент идентичности этих остатков в анализе 2870 штаммов ВИЧ, депонированных в базе данных последовательностей ВИЧ в Лос-Аламосе (12/2011). ‡ASA означает площадь доступной поверхности, Ų. ^§BSA означает площадь скрытой поверхности, Ų. ^§§Черточками обозначен процент площади скрытой поверхности, одна черточка на 10%. ДⁱG означает эффект энергии сольватации, ккал/моль.

На фиг. 28 представлена таблица, в которой указаны площади скрытой поверхности на границе между легкой цепью 10E8 и gp41 по остатку. Все взаимодействия осуществляли с использованием PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). ^ЈПроцент идентичности этих остатков в анализе 2870 штаммов ВИЧ, депонированных в базе данных последовательностей ВИЧ в Лос-Аламосе (12/2011). ASA означает площадь доступной поверхности, Ų. BSA означает площадь скрытой поверхности, Ų. Черточками обозначен процент площади скрытой поверхности, одна черточка на 10%. ДⁱG означает эффект энергии сольватации, ккал/моль.

На фиг. 29 представлена таблица, в которой указаны водородные связи и солевые мостики, образованные между 10E8 и gp41. Водородные связи определяли с использованием программы Ligp1ot (McDonald et al., J. Mol. Biol. 238, 777-793, 1994). Цепь H означает комплекс тяжелой цепи 1; цепь В означает комплекс тяжелой цепи 2; цепь P означает комплекс пептида gp41 1; цепь F означает комплекс пептида gp41 2.

На фиг. 30 представлена таблица, в которой указаны ван-дер-ваальсовы взаимодействия между 10E8 и gp41. Ван-дер-ваальсовы взаимодействия определяли с помощью программы Ligp1ot (McDonald et al., J. Mol. Biol. 238, 777-793, 1994). Цепь H и цепь L означают комплекс тяжелой и легкой цепей 1, соответственно; цепь P означает комплекс пептида gp41 1; Цепь В и цепь D означают комплекс тяжелой и легкой цепей 2, соответственно; цепь F означает комплекс пептида gp41 2.

На фиг. 31 представлена таблица, в которой указаны аффинности связывания аланиновых вариантов 10E8 с растворимым пептидом MPER. SE означает стандартную ошибку; nb означает слабое или недетектируемое связывание в используемом интервале концентраций. ^{^}Кратность определена как кратное изменение по сравнению с отдельным 10E8 дикого типа, осуществляемое одновременно с использованием вариантов. ^$Среднее для трех отдельных экспериментов, проводимых с использованием 10E8 дикого типа. ^# Только те мутации, которые дают в 10 раз больший эффект, картировали на скрытой поверхности 10E8, как показано на фиг. 4E (серый средней интенсивности, >100x; светло-серый, 50x<100x; темно-серый, 10x<50x). Остатки тяжелой цепи Y99A_HС и G100hA_HС почти не связывались с растворимым пептидом, тогда как мутации дополнительных остатков CDR H3 (F100aA_HC, G100dA_HC, P100fA_HC, P100gA_HC, E100iA_НС и E100jA_HС) снижали аффинность в 50-120 раз (для идентификации специфических остатков в тяжелой и легкой цепях 10E8 использовалась нумерация по Кэбату). Петля CDR H1 и каркасная область 2 с мутациями W33A_HС и R50A_HС, соответственно, которые присутствуют в гидрофобной щели, также не связывались с пептидом MPER, а мутация E53A_HС в CDR H2, присутствующая в щели, снижала аффинность связывания с пептидом MPER в 60 раз. Остаток легкой цепи R91LC, локализованный в основании гидрофобной щели и обеспечивающий прямые взаимодействия с остатками CDR H3, не связывался в том случае, если он был заменен на аланин, что, вероятно, обусловлено дестабилизацией самой щели.

На фиг. 32 представлена таблица, в которой указаны нейтрализующие IC50 и IC80 аланин-сканированных вариантов 10Е8. В тех случаях, когда нейтрализующие IC50 и IC80 не достигались при наивысшей концентрации антитела, то при вычислении среднего использовали наивысшую концентрацию. ^{^}Среднюю кратность изменения активности определяли как среднее кратности изменения наблюдаемой активности против каждого вирусного штамма. ^&Все мутации Y99A_HС, F100aA_HС, W100bA_HС и G100hA_НС оказывали негативное воздействие на нейтрализацию, что снижало активность более чем в 1000 раз. Другие мутации также оказывали большое влияние на нейтрализацию, включая мутации P100gA_HС и E100iA_HС CDR H3, и W33A_HС и R50A_HС в гидрофобной щели. Мутация в легкой цепи R91A_LC, аналогично ее влиянию на связывание с пептидом, также снижала нейтрализующую активность более чем в 1000 раз.

На фиг. 33 представлена таблица, в которой указаны среднеквадратические отклонения (RMSD) в определении структур gp41, связанных с антителом. Выравнивание осуществляли с использованием программы LSQKAB (Winn, M. D. et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 67, 235-242, 2011). Для комплекса 4E10:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 2FX7 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Для комплекса Z13e1:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 3FN0 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Для комплекса 2F5:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. ITJI.

На фиг. 34 представлена таблица, в которой проиллюстрировано сравнение скрытых поверхностей MPER-специфического антитела на gp41. Исследования по взаимодействию осуществляли с помощью программы PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). Величины в скобках относятся к комплексу 2. Для комплекса 4E10:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 2FX7 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Для комплекса Z13e1:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 3F