Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики злокачественной опухоли

Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики злокачественной опухоли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в лекарственном средстве, таком как терапевтическое и/или профилактическое средство, против злокачественной опухоли.

Уровень техники

Злокачественная опухоль является основной причиной смерти. Это заболевание в настоящее время лечат в основном путем хирургического вмешательства в комбинации с лучевой терапией и/или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов или открытие новых средств против злокачественной опухоли в последнее время, исход существующих способов лечения злокачественных опухолей улучшился в недостаточной мере, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате последних достижений в молекулярной биологии или иммунологии злокачественных опухолей были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, гены, кодирующие такие антигены злокачественных опухолей, и тому подобное, что увеличило ожидания в отношении специфической терапии злокачественной опухоли, нацеленной на антигены злокачественных опухолей (непатентный документ 1).

Для уменьшения неблагоприятных явлений терапии злокачественной опухоли желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, редко встречались в нормальных клетках, но исключительно существовали в злокачественных клетках. В 1991 году Boon et al (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-положительными Т-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реактивные в отношении злокачественных опухолей (непатентный документ 2). В дальнейшем был описан способ SEREX (серологическая идентификация антигенов путем рекомбинантного клонирования на основе экспрессии), который основан на подходе клонирования генов на основе экспрессии, для идентификации опухолевых антигенов, распознаваемых антителами, продуцированными в ответ на аутологичную злокачественную опухоль in vivo у пациента со злокачественной опухолью (непатентный документ 3 и патентный документ 1). С помощью этого способа были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые редко экспрессируются в нормальных клетках, но исключительно экспрессируются в злокачественных клетках (непатентные документы 4-9). Кроме того, клеточная терапия с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, или иммунотерапия, специфичная в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин или т.п., содержащих антигены злокачественных опухолей, являются объектом клинических испытаний, направленных на некоторые выделенные антигены злокачественных опухолей.

В последние годы во всем мире были выпущены различные лекарственные средства на основе антител для лечения злокачественных опухолей, которые нацелены на антигенные белки на злокачественных клетках. Эти лекарственные средства привлекли внимание вследствие их определенной эффективности в качестве терапевтических средств, специфичных к злокачественной опухоли. Однако большинство антигенных белков, на которые нацелены лекарственные средства, также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антител повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, что является отрицательным результатом и приводит к неблагоприятным явлениям. Следовательно, можно ожидать, что если бы можно было идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественных клеток, и использовать антитела, нацеленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, то эти лекарственные средства на основе антител обеспечивали бы лечение, вызывая меньше неблагоприятных явлений.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен как внутриклеточный белок, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся клеток и образует внутриклеточные стрессовые гранулы с РНК в клетках для участия в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфически экспрессируется на поверхности злокачественных клеток и, таким образом, его исследуют в качестве мишени для лекарственных средств на основе антител для лечения злокачественных опухолей (патентный документ 2).

Список литературы

Патентная литература

Патентный документ 1: патент США №5698396

Патентный документ 2: WO 2010/016526

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 551-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan)

Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

Непатентный документ 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998)

Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998)

Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999)

Непатентный документ 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996)

Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genet., 6: 33-39, 1997

Сущность изобретения

Техническая проблема

Задачей настоящего изобретения является получение антитела, которое нацелено на CAPRIN-1, специфически экспрессируемый на поверхности злокачественных клеток, и которое имеет улучшенную противоопухолевую активность по сравнению с общепринятыми антителами, и обеспечение использования антитела в качестве

терапевтического и/или профилактического средства против злокачественной опухоли.

Решение проблемы

Настоящее изобретение имеет следующие аспекты:

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, которые обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:9, 10 и 11, и к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей их в качестве активного ингредиента.

В одном варианте настоящего изобретения злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

В альтернативном варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело).

Настоящее описание включает содержание заявки на патент Японии № 2011-171332, на основе которой испрашивается приоритет настоящей заявки.

Преимущественные эффекты изобретения

Антитело против CAPRIN-1, используемое в соответствии с настоящим изобретением, повреждает злокачественные клетки. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 применимо при лечении и/или профилактике злокачественной опухоли.

Описание вариантов осуществления

Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело и предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любой тип антитела, который может проявлять противоопухолевую активность и включает, например, рекомбинантные антитела, например, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), антитела человека и фрагменты этих антител, например, Fab, F(ab’)₂ и Fv. Эти антитела и их фрагменты можно получать способами, обычно известными специалистам в данной области. В случае, когда индивидуумом является человек, желательным является антитело человека или гуманизированное антитело для предотвращения или подавления отторжения.

В этом контексте выражение "специфическое связывание с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфически связывается с белком CAPRIN-1, по существу не связываясь с другими белками.

Антитело против полипептида CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением можно исследовать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования роста опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования ex vivo присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, которую проявляет антитело против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Индивидуумом, которому проводят лечение и/или профилактику злокачественной опухоли в соответствии с настоящим изобретением, является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, скот или спортивное животное, предпочтительно человек.

Далее настоящее изобретение описано более подробно.

Получение антигена для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением, не ограничиваются видом животного, служащего их источником, включая, например, людей, собак, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс или кур. Однако белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительными являются белки, происходящие от млекопитающих. В частности, предпочтительными являются белки, происходящие от человека. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, то можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их частичные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов доступны, например, путем доступа в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5 873-5877,1993; and Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

В соответствии с настоящим изобретением, со ссылкой на нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2 или 4) CAPRIN-1 человека, мишенью в виде CAPRIN-1 являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно на 80%-100%, более предпочтительно на 90%-100%, еще более предпочтительно на 95%-100%, например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части эталонной последовательности. В этом контексте термин "% идентичность последовательностей" означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или нуклеотидных оснований), от общего числа аминокислот (или нуклеотидных оснований), когда две последовательности выравнивают так, чтобы могла достигаться максимальная степень сходства (или идентичность), с внесением или без внесения пропусков.

В качестве фрагментов каждого белка CAPRIN-1 можно использовать фрагменты, содержащие эпитоп (или антигенную детерминанту), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, и имеющие длину в диапазоне от длины аминокислотной последовательности эпитопа до менее чем полноразмерного белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, имеющему антигенность или иммуногенность у млекопитающих, предпочтительно у человека. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот.

Полипептидные фрагменты, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, Например, способы с использованием Fmoc (флуоренилметилоксикарбонила) и tBoc (трет-бутилоксикарбонила) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также эти полипептиды могут быть синтезированы общепринятыми способами с использованием целого ряда коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов. Альтернативно можно получать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, с использованием генно-инженерных подходов, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.), и встраивать их в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева так, чтобы в клетках-хозяевах продуцировались полипептиды. Таким образом, можно получать представляющие интерес белки CAPRIN-1 человека или их полипептидные фрагменты.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, легко могут быть получены с помощью генно-инженерных подходов, известных в данной области, или общепринятых способов с использованием коммерчески доступных устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность гена CAPRIN-1 человека, можно получать с помощью ПЦР, используя хромосомную ДНК или библиотеку кДНК человека в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. Условия реакции для этой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, но не ограничиваются ими, 30 циклов, каждый из которых включает стадии реакции, состоящие из 94°C в течение 30 секунд (денатурация); 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимераза, Pfu-полимераза или т.п.) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Подход ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в публикации Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также можно получать соответствующие зонды или праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях гена CAPRIN-1 и аминокислотных последовательностях белков CAPRIN-1 и использовать при скрининге, например, библиотеки кДНК человека, для выделения желаемой ДНК. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белки CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников или из злокачественных опухолей, или из таких опухолей, как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких, рак поджелудочной железы и рак ободочной и прямой кишки. Эти действия, включающие получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области, и они могут быть выполнены в соответствии со способами, описанными, например, в публикациях Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausubel et al. (ibid.). Из ДНК, полученных таким образом, можно получать ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека и их частичные пептиды.

Клетки-хозяева, в которые вводят экспрессирующие векторы, могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваясь ими: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичников китайского хомячка CHO; линию клеток эмбриональной почки человека HEK293; линию клеток эмбриональной кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как почкующиеся дрожжи и клетки делящихся дрожжей; клетки тутового шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus.

В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев, используемые экспрессирующие векторы могут иметь ориджин, который позволяет репликацию в прокариотических клетках, промотор, участок связывания с рибосомой, участок множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ген ауксотрофной комплементарности и т.д. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, экспрессирующие системы pET и экспрессируюище системы pGEX. ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептиды, кодируемые этими ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом, полипептиды могут быть экспрессированы в виде белков, слитых с другими белками.

В случае использования эукариотических клеток в качестве клеток-хозяев, в качестве экспрессирующих векторов могут быть использованы экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, участок добавления поли(А) и т.д. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогично тому, как описано выше, ДНК, кодирующие указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы в эукариотических клетках-хозяевах экспрессировались полипептиды, кодируемые этими ДНК. В случае использования экспрессирующих векторов, таких как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептиды могут быть экспрессированы в виде различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP или т.п.

Экспрессирующие векторы можно вводить в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, инфицирование вирусом, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Представляющий интерес полипептид может быть выделен из клеток-хозяев и очищен с помощью комбинации способов разделения, известных в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, обработку денатурирующим веществом (например, мочевиной) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращено-фазовую хроматографию.

Для получения антитела в соответствии с настоящим изобретением антигены, полученные таким образом, можно использовать в качестве сенсибилизирующих антигенов, как описано ниже.

Структура антитела

Антитела (иммуноглобулины) обычно представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, каждый из которых содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Иммуноглобулины, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером приблизительно 150 кДа, каждый из которых содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном конце, за которым следует несколько последовательно расположенных константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи соответствует первой константной области тяжелой цепи, в то же время вариабельный домен легкой цепи соответствует вариабельному домену тяжелой цепи. Конкретные области вариабельного домена антитела, которые называются "определяющими комплементарность областями (CDR)", проявляют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Относительно консервативные участки в вариабельных областях называются "каркасными областями (FR)". Каждый полный вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи содержит четыре FR, соединенные друг с другом посредством трех CDR. Эти три CDR обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, в указанном порядке от N-конца тяжелой цепи. Аналогично, в легкой цепи CDR обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 является наиболее важной для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются рядом друг с другом FR областями, и они вносят вклад в образование антигенсвязывающего центра в антителе вместе с CDR на другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитела с антигеном, однако они проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечение в антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредуемый связыванием с Fcγ-рецептором, период полужизни/скорость выведения через неонатальный Fc рецептор (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC) через компонент C1q в каскаде реакций системы комплемента.

Получение антитела

Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полноразмерного белка CAPRIN-1 или его фрагмента.

В этом контексте "иммунологическая реактивность" означает свойство связывания антитела с антигеном CAPRIN-1 (полноразмерный белок CAPRIN-1 или его частичный полипептид) in vivo. Посредством такого связывания антитела по настоящему изобретению с CAPRIN-1 антитело проявляет функцию повреждения (например, гибель, подавление или регрессию) опухолевых клеток. Антитело по настоящему изобретению может повреждать опухоли, такие как рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфома, фибросаркома, мастоцитома или меланома, в результате связывания с белком CAPRIN-1.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению конкретно не ограничено, при условии, что антитело представляет собой моноклональное антитело, и его примеры включают синтетические антитела, полиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Также антитело представляет собой любой класс молекулы иммуноглобулина, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любой подкласс, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Кроме того, антитело может быть модифицировано путем ацетилирования, формилирования, амидирования, фосфорилирования, пегилирования или т.п., а также гликозилирования.

Далее представлены примеры получения различных моноклональных антител.

Например, клеточные линии рака молочной железы SK-BR-3, экспрессирующие CAPRIN-1, вводят каждой мыши для иммунизации. У этих мышей извлекают селезенку. После выделения клеток селезенки клетки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Из полученных слитых клеток (гибридом) отбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток, выделяют и культивируют. Антитело по настоящему изобретению можно получать путем очистки из культурального супернатанта в соответствии с общим способом аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, можно получать, например, следующим образом. Сначала животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном способом, известным в данной области. Этот способ иммунизации обычно включает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разбавляют PBS или суспендируют в PBS (фосфатно-буферный солевой раствор), физиологическом растворе или т.п. до получения в результате подходящего количества, а затем смешивают, если желательно, с соответствующим количеством общепринятого адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования их вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые от 4 до 21 суток. Альтернативно, для иммунизации сенсибилизирующими антигенами можно использовать подходящий носитель.

После подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке млекопитающего, иммунизированного таким образом, иммуноциты собирают от млекопитающего и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

В качестве родительских клеток-партнеров, подлежащих слиянию с иммуноцитами, используют клетки миеломы млекопитающих. В качестве клеток миеломы предпочтительно используют различные клеточные линии, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3×63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3×63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы можно проводить в основном в соответствии со способом, известным в данной области, например, способом Kohler и Milstein (Kohler, G. and Milstein, С. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток проводят, например, в присутствии промотора слияния клеток в общепринятой питательной среде. Например, в качестве промотора слияния используют полиэтиленгликоль (PEG) или японский гемагглютинирующий вирус (HVJ). При желании, для повышения эффективности слияния можно дополнительно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.

Соотношение между иммуноцитами и используемыми клетками миеломы может быть выбрано произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно выбирают так, чтобы оно превышало количество клеток миеломы в 1-10 раз. Примеры среды, которую можно использовать для слияния клеток, включают среду RPMI1640 и среду MEM, которые подходят для роста линий клеток миеломы, а также другие общепринятые среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Кроме того, в комбинации с этими средами можно использовать добавку на основе сыворотки, такую как эмбриональная сыворотка теленка (FCS).

Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы хорошо перемешивают в заранее определенном количестве среды. Обычно к смеси добавляют раствор PEG (средняя молекулярная масса приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретый приблизительно до 37°C, в концентрации от 30% до 60% (мас./об.), и перемешивают с ним для образования представляющих интерес гибридом. После этого предпочтительно осуществляют повторяющиеся действия, состоящие в последовательном добавлении соответствующей среды и удалении супернатанта центрифугированием для удаления агентов слияния клеток или т.п., которые не являются благоприятными для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют в общепринятой селективной среде, например, среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин), для селекции. Культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (как правило, от нескольких суток до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Далее, проводят скрининг гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело, и клонирование в качестве единичных клонов общепринятым способом лимитирующих разведений.

В дополнение к такому получению гибридом путем иммунизации не являющихся человеком животных антигенами, гибридомы, продуцирующие антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, активностью ингибирования роста клеток), можно получать путем сенсибилизации лимфоцитов человека, например, инфицированных вирусом EB лимфоцитов человека, белками, экспрессирующими белок клетками или их лизатами in vitro, и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с происходящими от человека клетками миеломы, способными постоянно делиться, например, U266 (номер доступа TIB196).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные таким образом, можно субкультивировать в общепринятой среде и также можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

В частности, желаемые антигены или клетки, экспрессирующие желаемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов при иммунизации в соответствии с общепринятым способом иммунизации. Полученные иммуноциты подвергают слиянию с родительскими клетками, известными в данной области, в соответствии с общепринятым способом слияния клеток. Клетки (гибридомы), продуцирующие моноклональное антитело, можно подвергать скринингу общепринятым способом скрининга с получением гибридом, продуцирующих представляющие интерес моноклональные антитела.

В этом контексте, например, мыши KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) и мыши Xeno (Amgen Inc.) известны в качестве мышей, продуцирующих антитела человека (например, международные публикации №№ WO02/43478 и WO02/092812). Из крови таких мышей, иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, можно получить полные поликлональные антитела человека. Альтернативно, у мышей, иммунизированных таким образом, можно выделять клетки селезенки и подвергать слиянию с клетками миеломы. Таким образом, можно получать моноклональные антитела человека.

Антигены можно получать, например, способом с использованием клеток животных (публикация патента Японии (Kohyo) № 2007-530068 A (2007)) или способом с использованием бакуловируса (например, международная публикация № WO98/46777). Антигены, обладающие низкой иммуногенностью, могут быть связаны с иммуногенными макромолекулами, такими как альбумин, для иммунизации. Антигены можно вводить с адъювантами для иммунизации.

Альтернативно, антитела по настоящему изобретению можно получать в виде рекомбинантных антител, которые получают с использованием технологии генной инженерии, которая включает: клонирование генов антител из гибридом; встраивание генов антител в соответствующие векторы; и введение векторов в хозяев (см., например, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области (V-области) антитела синтезируют из мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующих представляющие интерес V-области, ДНК лигируют с ДНК, кодирующими желаемые константные области антитела (C-области). Полученные в результате продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы. Альтернативно, ДНК, кодирующие V-область антитела, можно встраивать в экспрессирующие векторы, содержащие ДНК С-области антитела. Эти ДНК встраивают в экспрессирующие векторы таким образом, чтобы они экспрессировались под контролем областей контроля экспрессии, например, энхансера и промотора. Далее, клетки-хозяева можно трансформировать полученными экспрессирующими векторами и давать им возможность экспрессировать антитела.

Антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело. Моноклональное антитело включает моноклональные антитела человека, моноклональные антитела не являющихся человеком животных (например, моноклональные антитела мыши, крысы, кролика и курицы), химерные моноклональные антитела и т.п. Моноклональное антитело может быть получено путем культивирования гибридом, полученных слиянием между клетками селезенки от не являющихся человеком животных (например, мышей или мышей, продуцирующих антитела человека, кур и кроликов), иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, и клетками миеломы. Химерное антитело представляет собой антитело, полученное из комбинации последовательностей, происходящих от различных животных, и представляет собой, например, антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела мыши и константных областей тяжелой и легкой цепи антитела человека. Химерное антитело можно получать с использованием способа, известного в данной области, который включает, например: лигирование ДНК, кодирующих V-области антитела, с ДНК, кодирующими C-области антитела человека; включение полученных продуктов лигирования в экспрессирующие векторы; и введение векторов в хозяев так, чтобы продуцировались антитела.

Химерные моноклональные антитела человека-мыши, обладающие противоопухолевым эффектом, получают способом, описанным ниже в разделе "Примеры". Эти моноклональные антитела содержат, например, вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12. В этих моноклональных антителах VH-область может содержать CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, и VL-область может содержать CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11.

Гуманизированное антитело, также называемое реконструированным антителом человека, представляет собой антитело, полученное способами инженерии. Гуманизированное антитело конструируют путем пересадки CDR антитела, происходящего от иммунизированного животного, в определяющие комплементарность области антитела человека. Общий подход рекомбинации генов для этого также известен.

В частности, например, последовательность ДНК, сконструированную таким образом, чтобы связать CDR антител мыши и курицы с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют с помощью ПЦР, используя несколько олигонуклеотидов, полученных таким образом, чтобы они имели концевые части, перекрывающиеся друг с другом. Полученные ДНК лигируют с ДНК, кодирующими константные области антител человека. Затем полученные продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продукции антител с целью получения представляющего интерес антитела (см. публикацию европейской патентной заявки № EP239400 и международную публикацию № WO96/02576). FR антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы определяющие комплементарность области полученного реконструированного антитела человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, эти каркасные области могут быть заменены каркасными областями, происходящими от различных антител человека (см. международную публикацию № WO99/51743).

Каркасные области антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы определяющие комплементарность области полученного реконструированного антитела человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Аминокислоты в вариабельных областях (например, FR) или константных областях химерного антитела или гуманизированного антитела, полученного таким образом, можно заменять, например, на другие аминокислоты.

Аминокислотная замена представляет собой замену, например, менее 15, менее 10, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 ил