Конъюгаты "антитело-лекарственное средство"

Конъюгаты "антитело-лекарственное средство"

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

В целом, настоящее изобретение относится к конъюгатам «антитело против 5Т4-лекарственное средство» для лечения рака.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Конъюгаты «антитело-лекарственное средство» (ADC) сочетают специфичность связывания моноклональных антител с активностью химиотерапевтических агентов. Технологии, связанные с разработкой моноклональных антител к опухоль-ассоциированным молекулам-мишеням, применением более эффективных цитотоксических агентов и разработкой химических линкеров для ковалентного связывания этих компонентов, быстро развивались в последние годы (Ducry L., et al. Bioconjugate Chemistry, 21:5-13, 2010).

Перспективные ADC, такие как SGN-75 (US 2009/148942) и трастузумаб-DM1 (US 2009/0226465) в настоящее время проходят клинические испытания. Тем не менее, в связи с рассмотрением других опухоль-ассоциированных антигенов в качестве мишеней сохраняется множество проблем. Необходимо по отдельности описывать каждое моноклональное антитело, разрабатывать подходящий линкер и определять подходящий цитотоксический агент, сохраняющий свою активность при доставке в опухолевые клетки. Необходимо принимать во внимание плотность антигена на раковой мишени и то, экспрессируют ли нормальные ткани антиген-мишень. Другие факторы, которые следует иметь в виду, включают следующее: происходит ли полная интернализация ADC при связывании с мишенью; какое лекарственное средство, цитостатическое или цитотоксическое, является предпочтительным с учетом возможного воздействия на нормальные ткани, и/или тип и стадию рака, по поводу которого проводят лечение; и какую связь, расщепляемую или нерасщепляемую, обеспечивает линкер, соединяющий антитело с лекарственным средством. Кроме того, соотношение антитела и группировки лекарственного средства при конъюгации должно быть достаточным без снижения связывающей активности антитела и/или активности лекарственного средства. Очевидно, что ADC являются сложными биологическими агентами и проблемы разработки эффективного ADC сохраняют свою значимость.

Опухоль-ассоциированный человеческий антиген 5Т4 представляет собой антиген-мишень по настоящему изобретению. Недавно были показаны высокие уровни экспрессии антигена 5Т4 на определенных высокоонкогенных клетках, также называемых опухоль-инициирующими клетками (WO 2010/111659). Опухоль-инициирующие клетки демонстрируют устойчивость к стандартной терапии, и полагают, что они приводят к рецидивированию и метастазированию и поэтому являются еще одним препятствием развитию ADC.

Новые ADC против 5Т4 по настоящему изобретению позволяют решить проблемы, связанные с ADC-технологиями, и обеспечивают высокоспецифичные и активные ADC, связывающиеся с опухолевыми клетками, экспрессирующими антиген 5Т4, и доставляющие достаточное количество цитотоксического лекарственного средства в клетки, обеспечивая посредством этого инновационное и эффективное лечение рака.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном воплощении конъюгат «антитело-лекарственное средство» по настоящему изобретению имеет формулу Ab-(LU-D)p или представляет собой ее фармацевтически приемлемую соль, где Ab представляет собой антитело против 5Т4 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую область VH CDR1 (определяющую комплементарность область 1 вариабельной области тяжелой цепи), как показано в SEQ ID NO: 5, область VH CDR2, как показано в SEQ ID NO: 6, и область VH CDR3, как показано в SEQ ID NO: 7; LU представляет собой линкерную единицу, выбранную из группы, состоящей из малеимидокапроила и малеимидокапроил-Val-Cit-PABA; p представляет собой целое число от приблизительно 1 до приблизительно 8; и D представляет собой структурную единицу лекарственного средства, выбранную из группы, состоящей из MMAE (монометилауристатин E), MMAF (монометилауристатин F) и MMAD (монометилауристатин D).

Согласно настоящему изобретению также предложены конъюгаты «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где указанные антитело против 5Т4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую (а) область VH CDR1, как показано в SEQ ID NO: 5, (б) область VH CDR2, как показано в SEQ ID NO: 6, и (в) область VH CDR3, как показано в SEQ ID NO: 7.

Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где указанные антитело против 5Т4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, имеющую (а) область VL CDR1 (вариабельной области легкой цепи), как показано в SEQ ID NO: 8, (б) область VL CDR2, как показано в SEQ ID NO: 9, и (в) область VL CDR3, как показано в SEQ ID NO: 10.

Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где указанные антитело против 5Т4 или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую: (а) область VH CDR1, как показано в SEQ ID NO: 5, (б) область VH CDR2, как показано в SEQ ID NO: 6, и (в) область VH CDR3, как показано в SEQ ID NO: 7; и вариабельную область легкой цепи, имеющую (а) область VL CDR1, как показано в SEQ ID NO: 8, (б) область VL CDR2, как показано в SEQ ID NO: 9, и (в) область VL CDR3, как показано в SEQ ID NO: 10.

Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где указанные антитело против 5Т4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат область VH по SEQ ID NO: 3 и область VL по SEQ ID NO: 4.

Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где указанное антитело против 5Т4 состоит из тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 1, и легкой цепи, имеющей SEQ ID NO: 2.

Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где:

(а) указанное антитело против 5Т4 состоит из тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 1, и легкой цепи, имеющей SEQ ID NO: 2, (б) указанная LU представляет собой малеимидокапроил, (в) указанное лекарственное средство представляет собой MMAF, и (г) p представляет собой целое число, составляющее приблизительно 4.

Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где:

(а) указанное антитело против 5Т4 состоит из тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 1, и легкой цепи, имеющей SEQ ID NO: 2, (б) указанная LU представляет собой малеимидокапроил-Val-Cit-PABA, (в) указанное лекарственное средство представляет собой ММАЕ, и (г) p представляет собой целое число, составляющее приблизительно 4.

Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где:

(а) указанное антитело против 5Т4 состоит из тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 1, и легкой цепи, имеющей SEQ ID NO: 2, (б) указанная LU представляет собой малеимидокапроил-Val-Cit-PABA, (в) указанное лекарственное средство представляет собой MMAD, и (г) p представляет собой целое число от приблизительно 1 до приблизительно 8.

Согласно настоящему изобретению также предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где: (а) указанное антитело против 5Т4 состоит из тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 15, и легкой цепи, имеющей SEQ ID NO: 2, (б) указанная LU представляет собой малеимидокапроил-Val-Cit-PABA, (в) указанное лекарственное средство представляет собой ММАЕ, и (г) p представляет собой целое число от приблизительно 1 до приблизительно 8.

Согласно настоящему изобретению предложен конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство», где указанное антитело распознает эпитоп человеческого антигена 5Т4, содержащий аминокислотные остатки 173-258 и 282-361 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.

Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат «антитело-лекарственное средство», указанный выше, и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения 5Т4-положительного рака у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту конъюгата «антитело-лекарственное средство», указанного выше.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения 5Т4-положительного рака, где указанный рак выбран из группы, состоящей из раковых заболеваний мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, эндометрия, почек, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, печени, кожи, желудка и яичек.

Более предпочтительно, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения 5Т4-положительного рака, где указанный рак выбран из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и немелкоклеточных карцином легкого.

Согласно изобретению также предложен конъюгат «антитело-лекарственное средство», указанный выше, для применения в терапии.

Согласно изобретению также предложено применение конъюгата «антитело-лекарственное средство», указанного выше, для изготовления лекарственного средства.

Согласно изобретению также предложено применение, указанное выше, для лечения 5Т4-положительного рака, где указанный рак выбран из группы, состоящей из раковых заболеваний мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, эндометрия, почек, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, кожи, желудка и яичек.

Более предпочтительно, согласно изобретению также предложено применение, указанное выше, для лечения 5Т4-положительного рака, где указанный рак выбран из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и немелкоклеточных карцином легкого.

Согласно изобретению также предложены нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против 5Т4, вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, и клетка-хозяин, содержащая указанный вектор.

Согласно изобретению также предложен способ получения антитела против 5Т4, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей указанный выше вектор, и выделение антитела из клеточной культуры.

Согласно изобретению также предложен способ получения конъюгата «антитело против 5Т4-лекарственное средство», включающий: (а) получение антитела, выделенного из клеточной культуры, (б) химическое связывание указанного антитела, через линкерную единицу, выбранную из группы, состоящей из малеимидокапроила и малеимидокапроил-Val-Cit, со структурной единицей лекарственного средства, выбранной из группы, состоящей из ММАЕ, MMAD или MMAF; и (в) очистку конъюгата «антитело-лекарственное средство».

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены конъюгаты «антитело против 5Т4-лекарственное средство» для лечения рака. Для лучшего понимания настоящего изобретения сначала приведено определение некоторых терминов.

Все сокращения аминокислот, использованные в данном описании, представляют собой сокращения, принятые Управлением по патентам и товарным знакам США, как изложено в § 1.822 (B)(1) раздела 37 Свода федеральных постановлений США.

5Т4 относится к онкофетальному антигену 5Т4, 72 кДа высокогликозилированному трансмембранному гликопротеину, содержащему 42 кДа негликозилированное ядро (см. US 5869053). Человеческий 5Т4 экспрессирован во множестве типов раковых заболеваний, включая раковые заболевания мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, эндометрия, почек, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, печени, кожи, желудка и яичек. Показаны высокие уровни экспрессии 5Т4 на высокоонкогенных клетках, также называемых раковыми стволовыми клетками или опухоль-инициирующими клетками (WO 2010/111659). Антитела против 5Т4 по изобретению включают антитела, специфично связывающиеся с человеческим антигеном 5Т4 (см. US 2007/0231333).

«Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфично связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и так далее, через по меньшей мере один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. При использовании здесь термин «антитело» включает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также любой антигенсвязывающий фрагмент (то есть «антигенсвязывающую часть») или его отдельную цепь, слитые белки, содержащие антитело, или любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, включая, например, без ограничения, Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и VH, Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, выделенную область, определяющую комплементарность (CDR), scFv, однодоменные антитела, (например, антитела акулы и представителей семейства Верблюдовых), макситела, минитела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv.

Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или их подкласса), и нет необходимости в том, чтобы антитело представляло собой антитело какого-либо определенного класса. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела, иммуноглобулинам могут быть присвоены различные классы. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть разделены далее на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называют альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, самим по себе или в комбинации. Как известно в данной области техники, каждая вариабельная область тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области, участвующими в образовании антигенсвязывающего сайта антител. Если желательны варианты рассматриваемой вариабельной области, особенно с заменой аминокислотных остатков вне CDR-области (то есть в каркасной области), подходящая аминокислотная замена, предпочтительно консервативная аминокислотная замена, может быть определена сравнением рассматриваемой вариабельной области с вариабельными областями других антител, содержащих последовательности CDR1 и CDR2 того же канонического класса, что и рассматриваемая вариабельная область (Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987). При выборе FR для фланкирования CDR, например, при гуманизации или оптимизации антитела, предпочтительны FR антител, содержащих последовательности CDR1 и CDR2 того же канонического класса.

«CDR» вариабельного домена представляют собой аминокислотные остатки вариабельной области, определенные в соответствии со способами определения Kabat, Chothia, сочетанием способов Kabat и Chothia, способом AbM, контактным и/или конформационным способами определения или любым способом определения CDR, хорошо известным в данной области техники. CDR антитела могут быть определены как гипервариабельные области, изначально определенные Kabat et al. См., например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington, D.C. Положения CDR могут также быть определены как петлевые структуры, изначально описанные Chothia et al. См., например, Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883. Другие способы определения CDR включают «способ определения AbM», представляющий собой сочетание способов Kabat и Chothia и разработанный с применением программного обеспечения для моделирования антител AbM от Oxford Molecular (в настоящее время Accelrys®), или «контактный способ определения» CDR, основанный на наблюдаемых контактах с антигенами, изложенный в MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. В другом способе, названном здесь «конформационным способом определения» CDR, положения CDR могут быть определены как остатки, влияющие на энтальпию связывания с антигеном. См., например, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. В других способах определения границ CDR может не быть строгого соответствия одному из указанных способов, но, тем не менее, они могут перекрываться по меньшей мере с частью CDR по Kabat, хотя их длина может быть уменьшена или увеличена в свете прогнозов или экспериментальных данных об отсутствии существенного влияния определенных остатков, или групп остатков, или даже целых CDR на связывание с антигеном. При использовании здесь CDR может относится к CDR, определенным любым способом, известным в данной области техники, включая комбинированные способы. В способах, примененных здесь, могут быть использованы CDR, определенные любым из этих способов. Для любого заданного воплощения, включающего более одной CDR, CDR могут быть определены любым из способов определения Kabat, Chothia, расширенного способа определения, способа определения AbM, контактного и/или конформационного способа определения.

Термин «моноклональное антитело» (mAb) относится к антителу, имеющему происхождение от одной копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, и не к способу, которым оно получено. Предпочтительно, моноклональное антитело по изобретению представлено в однородной или практически однородной популяции.

«Гуманизированное» антитело относится к формам антител, не являющимся человеческими (например, мышиным), представляющим собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие последовательности антител), содержащим минимальную последовательность, имеющую происхождение от иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Предпочтительно, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), где остатки области, определяющей комплементарность, (CDR) реципиента заменены остатками CDR вида, не являющегося человеком (антитела-донора), такого как мышь, крыса или кролик, имеющему желаемую специфичность, аффинность и активность.

Термин «химерное антитело» предназначен для обозначения антител, в которых последовательности вариабельных областей имеют происхождение от одного вида и последовательности константных областей имеют происхождение от другого вида, таких как антитело, где последовательности вариабельных областей имеют происхождение от мышиного антитела и последовательности константных областей имеют происхождение от человеческого антитела.

Антитела по изобретению могут быть получены с применением методик, хорошо известных в данной области техники, например, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, технологий синтеза или комбинаций таких технологий или по другим технологиям, хорошо известным в данной области техники (см., например, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999) and Fellouse, FA, et al, J. Mol. Biol., 373(4): 924-40 (2007)).

В Таблицах 1 и 2 ниже показаны предпочтительные CDR для антител по настоящему изобретению.

Таблица 1
Антитело	CDR1 легкой цепи (LCDR1)	CDR2 легкой цепи (LCDR2)	CDR3 легкой цепи (LCDR3)
A1	KASQSVSNDVA SEQ ID NO: 8	FATNRYT SEQ ID NO: 9	QQDYSSPWT SEQ ID NO: 10
A3	KASQ DVDTAVA SEQ ID NO: 17	WASTRLT SEQ ID NO: 18	QQYSSYPYT SEQ ID NO: 19
Таблица 2
Антитело	CDR1 тяжелой цепи (HCDR1)	CDR2 тяжелой цепи (HCDR2)	CDR3 тяжелой цепи (HCDR3)
A1	NFGMN SEQ ID NO: 5	WINTNTGEPRYAEEFKG SEQ ID NO: 6	DWDGAYFFDY SEQ ID NO: 7
A1-IgG4	GYTFTNFGMN SEQ ID NO: 14	WINTNTGEPRYAEEFKG SEQ ID NO: 6	DWDGAYFFDY SEQ ID NO: 7
A3	TYAMN SEQ ID NO: 22	RIRSKSNNYATYYADSVKD SEQ ID NO: 23	QWDYDVRAMNY SEQ ID NO: 24

Настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:

а) вариабельную область легкой цепи, содержащую:

1) LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 и 17;

2) LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9 и 18; и

3) LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10 и 19; и

б) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:

1) HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и 22;

2) HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и 23; и

3) LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 и 24.

Предпочтительные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат:

а) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую: LCDR1 по SEQ ID NO: 8, LCDR2 по SEQ ID NO: 9 и LCDR3 по SEQ ID NO: 10; и

б) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую: a HCDR1 по SEQ ID NO: 5, HCDR2 по SEQ ID NO: 6 и HCDR3 по SEQ ID NO: 7.

Предпочтительные моноклональные антитела по изобретению названы здесь A1 (гуманизированное антитело IgG1 против 5Т4); A1-IgG4 (гуманизированное антитело IgG4 против 5Т4); A3 (мышиное/человеческое химерное антитело); и A3hu (гуманизированное антитело IgG1 против 5Т4). SEQ ID NO: аминокислотных последовательностей, кодирующих моноклональные антитела A1, A1-IgG4 и A3, представлены в Таблице 3 ниже.

Таблица 3
Mab	LC	НС	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3
A1	2	1	4	8	9	10	3	5	6	7
A1-IgG4	2	12	4	8	9	10	13	5	6	7
A3	2	15	21	22	23	24	16	17	18	19
A3hu	30	25	31	32	33	34	26	27	28	29

Фразы «антитело, распознающее антиген» и «антитело, специфичное в отношении антигена», использованы здесь взаимозаменяемо с термином «антитело, специфично связывающееся с антигеном».

Конъюгат «антитело против 5Т4-лекарственное средство» относится к антителу против 5Т4 или его антигенсвязывающему фрагменту, как описано здесь, связанным с группировкой цитотоксического лекарственного средства (D) через молекулу линкерной единицы (LU).

Линкерная единица (LU): LU описывает прямую или непрямую связь антитела с лекарственным средством. Присоединение линкера к моноклональному антителу (mAb) может быть проведено множеством способов, как например, через поверхностные лизины, восстановительным сочетанием с окисленными углеводами и через цистеиновые остатки, освобожденные восстановлением межцепочечных дисульфидных связей. В данной области техники известно множество систем связывания ADC, включая связи на основе гидразонов, дисульфидов и пептидов.

Лекарственное средство (D): лекарственное средство представляет собой любое вещество, обладающее биологической или выявляемой активностью, например, терапевтические агенты, выявляемые метки, связывающие агенты, и так далее, и пролекарства, метаболизируемые с образованием активного агента in vivo. Термины «лекарственное средство» и «полезная нагрузка» использованы взаимозаменяемо. В некоторых воплощениях лекарственное средство представляет собой ауристатин, такой как ауристатин E (также известный в данной области техники как производное доластатина-10) или его производное. Ауристатин может представлять собой, например, эфир, образованный ауристатином E и кетокислотой. Например, ауристатин E может быть подвергнут взаимодействию с параацетилбензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой с получением AEB и AEVB, соответственно. Другие типичные ауристатины включают AFP (ауристатин F фенилендиамин), MMAF и MMAE. Синтез и структура типичных ауристатинов описаны в патентах США №№6884869, 7098308, 7256257, 7423116, 7498298 и 7745394, каждый из которых полностью включен сюда посредством ссылки в любых целях.

Показано, что ауристатины нарушают динамику микротрубочек и деление ядер и клеток и обладают противораковой активностью. Ауристатины по настоящему изобретению связываются с тубулином и могут оказывать цитотоксический или цитостатический эффект на клетку или клеточную линию, экспрессирующую 5Т4. Существует несколько различных анализов, известных в данной области техники, которые могут быть применены для определения того, какой эффект, цитостатический или цитотоксический, оказывает ауристатин или полученный конъюгат «антитело-лекарственное средство» на желаемую клетку или клеточную линию. Способы определения связывания соединения с тубулином известны в данной области техники. См., например, Muller et al., Anal. Chem 2006, 78, 4390-4397; Hamel et al., Molecular Pharmacology, 1995 47: 965-976; и Hamel et al., The Journal of Biological Chemistry, 1990 265:28, 17141-17149.

Примеры лекарственных средств или полезных нагрузок выбраны из группы, состоящей из DM1 (майтансина, N2'-дезацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)- или N2'-дезацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансина), mc-MMAD (6-малеимидокапроил-монометилауристатин D или N-метил-L-валил-N-[(1S,2R)-2-метокси-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-[[(1S)-2-фенил-1-(2-тиазолил)этил]амино]пропил]-1-пирролидинил]-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил]-N-метил-(9Cl)-L-валинамида), mc-MMAF (малеимидокапроил-монометилауристатин F или N-[6-(2,5-дигидро-2,5-диоксо-1H-пиррол-1-ил)-1-оксогексил]-N-метил-L-валил-L-валил-(3R,4S,5S)-3-метокси-5-метил-4-(метиламино)гептаноил-(αR,βR,2S)-β-метокси-α-метил-2-пирролидинпропаноил-L-фенилаланина) и mc-Val-Cit-PABA-MMAE (6-малеимидокапроил-ValcCit-(п-аминобензилоксикарбонил)-монометилауристатин E или N-[[[4-[[N-[6-(2,5-дигидро-2,5-диоксо-1H-пиррол-1-ил)-1-оксогексил]-1-валил-N5-(аминокарбонил)-1-орнитил]амино]фенил]метокси]карбонил]-N-метил-L-валил-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-гидрокси-1-метил-2-фенилэтил]амино]-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]-1-пирролидинил]-2-метокси-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил]-N-метил-L-валинамид). DM1 является производным ингибитора тубулина майтансина, в то время как MMAD, ММАЕ и MMAF являются производными ауристатинов. Предпочтительные лекарственные средства по настоящему изобретению выбраны из группы, состоящей из mc-MMAF и mc-Val-Cit-PABA-ММАЕ.

Термин «эпитоп» относится к той части молекулы, которая может быть распознана и связана антителом в одной или более антигенсвязывающих областях антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и имеют определенные трехмерные структурные характеристики, а также определенные зарядные характеристики. При использовании здесь термин «антигенный эпитоп» определяют как часть полипептида, с которой может специфично связываться антитело, как определено любым способом, хорошо известным в данной области техники, например, стандартными иммунологическими анализами. «Нелинейный эпитоп» или «конформационный эпитоп» содержит несмежные полипептиды (или аминокислоты) антигенного белка, с которыми связывается антитело, специфичное в отношении эпитопа.

При использовании здесь термин «аффинность связывания (K_D)» предназначен для обозначения скорости диссоциации взаимодействия определенного антигена с антителом. K_D представляет собой отношение скорости диссоциации, также называемой «k_off», к скорости ассоциации или «k_on». Таким образом, K_D равна k_off/k_on, и ее выражают как молярную концентрацию (M). Следовательно, чем меньше K_D, тем выше аффинность связывания. Поэтому K_D 1 мкМ указывает на низкую аффинность связывания, по сравнению с K_D 1 нМ. Значения K_D антител могут быть определены с применением способов, хорошо известных в данной области техники. Одним способом определения K_D антитела является применение поверхностного плазмонного резонанса (SPR), обычно с использованием биосенсорной системы, такой как система Biacore®.

Термин «специфичное связывание» при использовании здесь в отношении связывания антитела с антигеном 5Т4 означает, что антитело связывается с антигеном 5Т4 с K_D менее чем приблизительно 30 нМ, как определено посредством SPR при 25°C.

При использовании здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям молекулы или макромолекулы.

Термин «активность» является мерой биологической активности и может быть обозначен как IC₅₀ или эффективная концентрация антитела, необходимая для 50%-го ингибирования роста 5Т4-положительной клеточной линии, как описано в Примере 3. Альтернативно, активность может относиться к противоопухолевой активности, определенной в ксенотрансплантационной модели опухоли in vivo, как показано в Примере 4.

При использовании здесь термины «полинуклеотид» или «молекула нуклеиновой кислоты» предназначены для включения молекул ДНК и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.

Полинуклеотиды, кодирующие антитела по настоящему изобретению, могут содержать следующее: только кодирующую последовательность для варианта; кодирующую последовательность для варианта и дополнительные кодирующие последовательности, например, для функционального полипептида или сигнальной или секреторной последовательности, или последовательности пробелка; кодирующую последовательность для антитела и некодирующую последовательность, такую как интроны или некодирующая последовательность, расположенная в 5'- и/или 3'-направлении от последовательности, кодирующей антитело. Термин «полинуклеотид, кодирующий антитело», включает полинуклеотид, содержащий дополнительную кодирующую последовательность для варианта, а также полинуклеотид, содержащий дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность. В данной области техники известно, что полинуклеотидная последовательность, оптимизированная для определенной клетки-хозяина/системы экспрессии, может легко быть получена, исходя из аминокислотной последовательности желаемого белка (см. GENEART^® AG, Regensburg, Germany).

Полинуклеотиды, кодирующие антитела по настоящему изобретению, будут обычно содержать полинуклеотидную последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с последовательностями, кодирующими антитела, включая природные или гетерологичные промоторные области, известные в данной области техники. Предпочтительно, последовательности контроля экспрессии будут представлять собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотических клеток-хозяев, но также могут быть использованы контрольные последовательности для прокариотических хозяев. После введения вектора в подходящую линию клеток-хозяев проводят культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидных последовательностей и, если желательно, для сбора и очистки антител. Предпочтительные эукариотические клеточные линии включают клеточные линии CHO, различные клеточные линии COS, клетки HeLa, миеломные клеточные линии, трансформированные В-клетки или линии клеток почки человеческого эмбриона. Наиболее предпочтительной клеткой-хозяином является клеточная линия CHO.

Настоящее изобретение включает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, связывающиеся с определенным эпитопом антигена 5Т4. Определенный эпитоп представляет собой нелинейный или конформационный эпитоп, содержащий первую контактную область человеческого антигена 5Т4 (SEQ ID NO: 11) между аминокислотными остатками 173 и 252 и содержащий вторую контактную область между аминокислотными остатками 276 и 355 (см. Пример 7). Таким образом, CDR и вариабельные области тяжелой и легкой цепи, описанные здесь, используют для получения полноразмерных антител, а также функциональных фрагментов и аналогов, сохраняющих аффинность связывания белка, в котором использованы CDR, специфичные в отношении указанного выше эпитопа антигена 5Т4.

Аффинность связывания антител по настоящему изобретению определяют с применением SPR (Пример 6). В этих экспериментах антигены 5Т4 иммобилизуют в низких плотностях на чипе BIAcore^® и пропускают рядом с ними антитела. Измеряют увеличение массы на поверхности чипа. Данный способ анализа позволяет в реальном времени определять как скорость ассоциации, так и скорость диссоциации с получением аффинности (K_D) связывания. Гуманизированные антитела по настоящему изобретению имеют K_D от приблизительно 0,30 до приблизительно 30 нМ; от приблизительно 0.30 до приблизительно 20 нМ; от приблизительно 0,30 до приблизительно 10 нМ; от приблизительно 0,5 до приблизительно 7 нМ; от приблизительно 1,0 до приблизительно 5 нМ; и от приблизительно 1,0 до приблизительно 3 нМ.

Конъюгация лекарственных средств с антителом

Лекарственное средство имеет группу, взаимодействующую с конъюгационной точкой антитела, или модифицировано, чтобы содержать такую группу. Например, лекарственное средство может быть присоединено алкилированием (например, по лизинам с эпсилон-аминогруппами или N-концу антител), восстановительным аминированием окисленного углевода, трансэстерификацией между гидроксильными и карбоксильными группами, амидированием по аминогруппам или карбоксильным группам и конъюгацией с тиолами. В некоторых воплощениях число группировок лекарственного средства p, конъюгированных с молекулой антитела, составляет в среднем от 1 до 8; от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2. В некоторых воплощениях p составляет в среднем от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, 2 to 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В некоторых воплощениях p составляет в среднем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. В некоторых воплощениях p составляет в среднем от приблизительно 1 до приблизительно 8; от приблизительно 1 до приблизительно 7, от приблизительно 1 до приблизительно 6, от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 1 до приблизительно 4, от приблизительно 1 до приблизительно 3 или от приблизительно 1 до приблизительно 2. В некоторых воплощениях p составляет от приблизительно 2 до приблизительно 8, от приблизительно 2 до приблизительно 7, от приблизительно 2 до приблизительно 6, от приблизительно 2 до приблизительно 5, от приблизительно 2 до приблизительно 4 или от приблизительно 2 до приблизительно 3. Примеры химических способов, которые могут быть применены для конъюгации, приведены, например, в Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), Chapter 15 (Chemical Modifications of Proteins) (содержание которой полностью включено сюда посредством ссылки).

Например, когда химическая активация белка приводит к образованию свободных тиоловых групп, белок можно конъюгировать с сульфгидрильным реакционноспособным агентом. В одном аспекте агент по существу специфичен в отношении свободных тиоловых групп. Такие агенты включают, например, малеимид, галогенацетамиды (например, йод-, бром- или хлорацетамиды), галогенэфиры (например, йод-, бром- или хлорэфиры), галогенметилкетоны (например, йод-, бром- или хлорметилкетоны), бензиловые галогениды (например, йодид, бромид или хлорид), винилсульфон и пиридилтио.

Линкеры

Лекарственное средство может быть связано с антителом посредством линкера. Подходящие линкеры включают, например, расщепляемые и нерасщепляемые линкеры. Расщепляемый линкер обычно подвержен расщеплению во внутриклеточных условиях. Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, такой как липосомальная протеаза или эндосомальная протеаза. В типичных воплощениях линкер может представлять собой дипептидный линкер, такой как валин-цитруллиновый (va