Белки, связывающиеся с гепсидином

Белки, связывающиеся с гепсидином

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым, специфично связывающимся терапевтическим и/или диагностическим белкам, направленным против гепсидина, предпочтительно представляющим собой мутеины белка липокалина. Изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие белки, и к способам получения и применения таких белков и молекул нуклеиновых кислот. Соответственно, изобретение также направлено на фармацевтические и/или диагностические композиции, содержащие такие липокалиновые белки, включая применения этих белков.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гепсидин, пептидный гормон, обычно существующий в двух формах, состоящих из 20 или 25 аминокислот, экспрессируемый и секретируемый рядом клеток в ответ на повышенный уровень железа и воспаление. Гепсидин образуют преимущественно гепатоциты печени, он играет центральную роль в регуляции гомеостаза железа, действует как антимикробный пептид и непосредственно или косвенно вовлечен в развитие большинства железодефицитных синдромов/синдромов перегрузки железом. Основное действие гепсидина заключается в интернализации и деградации экспортера железа ферропортина, экспрессируемого на всех железо-экспортирующих клетках. Гепсидин непосредственно связывается с ферропортином. Таким образом, высокий уровень гепсидина приводит к подавлению всасывания железа в кишечнике и высвобождения железа из макрофагов и гепатоцитов, в то время как низкая концентрация гепсидина приводит к ускорению высвобождения железа из этих клеток.

Также полагают, что гепсидин играет роль в патогенезе анемии воспалительных заболеваний и железодефицитной анемии. Анемия воспалительных заболеваний, также известная как анемия хронических заболеваний (ACD) или анемия хронических расстройств, в настоящее время является наиболее распространенной анемией у госпитализированных пациентов и частым синдромом, осложняющим многие инфекционные, неинфекционные, воспалительные и опухолевые расстройства. ACD представляет собой нормоцитарную, нормохромную анемию, характеризующуюся сниженным уровнем железа и сниженной железосвязывающей способностью (трансферрином), повышенным уровнем ферритина и присутствием железа в макрофагах костного мозга, что указывает на нарушение мобилизации железа из его депо. В то время как при анемии воспалительных заболеваний уровни гепсидина повышены, при железодефицитной анемии определяют низкие уровни гепсидина. Таким образом, гепсидин можно использовать в качестве маркера для различения этих заболеваний. Гепсидин может также быть полезным маркером для скрининга, прогнозирования и мониторинга наследственного гемохроматоза и анемий при высоком уровне железа. Уровни гепсидина могут также быть полезны при мониторинге лечения эритропоэтином (ЕРО) и прогнозировании ответа на ЕРО.

Способы выделения, анализа и определения количества гепсидина, а также агенты для лечения заболеваний и состояний, связанных с гепсидином, описаны в международных заявках на патенты WO 2008/011158, WO 2008/097461, WO 2009/094551A1, WO 2009/139822, WO 2009/058797 и WO 2010/017070. Тем не менее, белки, связывающиеся с гепсидином, обладающие свойствами белков, предложенных согласно настоящему изобретению, ранее описаны не были.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одно воплощение настоящего изобретения относится к мутеину липокалина, способному связываться с гепсидином с аффинностью, определенной по константе диссоциации (K_D), приблизительно 10 нМ или менее. Более предпочтительно, липокалины могут иметь аффинность, определенную по K_D, приблизительно 1 нМ или менее. В другом воплощении мутеин липокалина способен нейтрализовать биологическую активность человеческого гепсидина-25, предпочтительно со значением средней ингибирующей концентрации (IC50) приблизительно 80 нМ или менее, как определено клеточным анализом индуцированной гепсидином интернализации и деградации ферропортина.

В определенных воплощениях мутеин липокалина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-14. В другом воплощении мутеин по меньшей мере на 75% идентичен последовательности человеческого липокалина дикого типа, включая человеческий липокалин-2.

В другом воплощении мутеин по настоящему изобретению конъюгирован с соединением, выбранным из группы, состоящей из органической молекулы, ферментной метки, радиоактивной метки, окрашенной метки, флуоресцентной метки, хромогенной метки, люминесцентной метки, гаптена, дигоксигенина, биотина, цитостатического агента, токсинов, металлического комплекса, металла и коллоидного золота. Мутеин может быть слит на его N-конце и/или его С-конце с партнером слияния, представляющим собой белок, белковый домен или пептид.

В другом воплощении мутеин конъюгирован с соединением, увеличивающим период полувыведения мутеина из сыворотки. Более предпочтительно, мутеин конъюгирован с соединением, выбранным из группы, состоящей из молекулы полиалкиленгликоля, гидроэтилкрахмала, Fc-части иммуноглобулина, C_H3-домена иммуноглобулина, C_H4-домена иммуноглобулина, альбуминсвязывающего пептида и альбуминсвязывающего белка.

В другом воплощении мутеин по настоящему изобретению представляет собой антагонист гепсидина. Гепсидин может представлять собой зрелый человеческий гепсидин.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую мутеин по настоящему изобретению.

В другом воплощении мутеин липокалина по настоящему изобретению выбран из группы, состоящей из мутеинов ретинолсвязывающего белка (RBP), билинсвязывающего белка (ВВР), аполипопротеина D (АРО D), липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), липокалина слезы (TLPC), α2-микроглобулин-родственного белка (A2m), 24р3/угерокалина (24р3), белка желез Эбнера-1 (VEGP 1), белка желез Эбнера-2 (VEGP 2) и предшественника главного аллергена Can f1 (ALL-1). В родственных воплощениях мутеин липокалина выбран из группы, состоящей из человеческого липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (hNGAL), человеческого липокалина слезы (hTLPC), человеческого аполипопротеина D (АРО D) и билинсвязывающего белка Pien’s brassicae.

В другом воплощении изобретение относится к мутеину липокалина, предотвращающему индуцированное человеческим гепсидином-25 снижение уровней железа в сыворотке субъекта.

Изобретение также включает способ лечения заболевания или расстройства, связанного с измененным уровнем гепсидина, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей мутеин, как описано здесь, субъекту, нуждающемуся в этом. В родственных воплощениях заболевание или расстройство включает расстройство гомеостаза железа или воспалительное состояние, связанное с повышенным уровнем гепсидина.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 показан способ сборки с применением полимеразной цепной реакции (PCR, PCR-сборки) для одновременного случайного мутагенеза 20 аминокислотных положений 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 (подчеркнутых и пронумерованных) аминокислотной последовательности зрелого Lcn 2 (липокалина-2). Эти 20 положений были разделены на четыре подгруппы в последовательности. Для рандомизации аминокислот каждой подгруппы синтезировали олигодезоксинуклеотид (SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19), в мутированных кодонах которого использовали NNK-смеси нуклеотидов. N обозначает смесь всех четырех оснований А, С, G и Т, в то время как К обозначает смесь только двух оснований G и Т; поэтому такой триплет кодирует все 20 природных аминокислот, а также амбер-стоп-кодон TAG, транслируемый как глутамин в supE-штаммах E. coli XLI-blue (Bullock et al., BioTechniques 5 (1987), 376-378) или TG1 (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press), которые использовали для получения фагмид и экспрессии генов. В реакции сборки также использовали четыре дополнительных олигодезоксинуклеотида (SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23) с постоянными нуклеотидными последовательностями, соответствующими некодирующей цепи (указанными под последовательностью двойной цепи ДНК в 3’-5’-направлении), и заполнение промежутков между указанными выше олигодезоксинуклеотидами. Два более коротких фланкирующих олигодезоксинуклеотида (SEQ ID NO:24 и SEQ ID NO:25), добавляемых в избытке и несущих биотиновые группы, служили в качестве праймеров для PCR-амплификации собранного, полностью синтетического фрагмента гена. Каждый из двух фланкирующих праймеров включал сайт рестрикции BstXI (CCANNNNNNTGG), приводя к образованию несовместимых друг с другом липких концов при ферментативном расщеплении. Такое специальное расположение сайтов рестрикции обеспечивало особенно эффективное лигирование и клонирование синтетического гена. Для введения первого сайта BstXI была необходима замена аминокислоты GIn28 на His относительно исходной последовательности Lcn2, в то время как второй сайт присутствует в кДНК (комплементарной ДНК) Lcn2 естественным образом. Кроме того, при сборке гена неспаренный остаток Cys87 заменяли на Ser. После первой PCR полученный фрагмент гена вводили в вектор, обеспечивавший недостающие части структурного гена Lcn2. На данном графическом материале также показаны два коротких праймера (SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:33), ближе к 3’- и 5’-концу, соответственно, относительно кассеты, фланкированной двумя сайтами рестрикции BstXI, используемыми для секвенирования двухцепочечной ДНК.

На Фиг.2 показана нуклеотидная последовательность библиотеки синтетических генов Lcn2 (показана только центральная кассета, фланкированная двумя сайтами рестрикции BstXI, как на Фиг.1). Этот фрагмент гена был получен Sloning BioTechnology GmbH. По сравнению с ДНК-библиотекой, показанной на Фиг.1, присутствуют два отличия. Во-первых, по возможности в немутированных аминокислотных положениях использовали кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli. Во-вторых, использовали смесь 19 разных триплетов (GAC, ТТС, CTG, САС, ААТ, AGC, АСС, GCA, ATG, ССТ, GTT, TGG, GAG, САА, АТС, GGA, CGT, GCA, TAC), кодирующих разные аминокислоты, за исключением Cys, в 20 рандомизированных положениях, идентичных показанным на Фиг.1. Нумерация аминокислот в данном случае соответствует внутренней схеме, использованной Sloning BioTechnology GmbH, в соответствии с которой Gly №1 является первым аминокислотным кодоном сразу после расположенного ближе к 3’-концу сайта рестрикции BsfXI.

На Фиг.3А показано выравнивание определенных аминокислотных последовательностей мутеинов липокалина на основе NGAL, специфичных в отношении человеческого гепсидина, в сравнении с полипептидной последовательностью липокалина NGAL дикого типа. Имеющие происхождение от NGAL мутеины, связывающиеся с гепсидином, содержат остатки 1-178, и это означает, что их длина равна длине зрелых белков дикого типа. Остатки 179-186 представляют собой последовательность метки, связывающейся со стрептавидином, Strep-tag™, использованной при выделении полученных мутеинов.

На Фиг.3Б показано выравнивание определенных аминокислотных последовательностей мутеинов липокалина на основе NGAL, специфичных в отношении человеческого гепсидина, в сравнении с полипептидной последовательностью липокалина NGAL дикого типа. Имеющие происхождение от NGAL мутеины, связывающиеся с гепсидином, содержат остатки 1-178, и это означает, что их длина равна длине зрелых белков дикого типа. Остатки 179-186 представляют собой последовательность метки, связывающейся со стрептавидином, Strep-tag™, использованной при выделении полученных мутеинов.

На Фиг.4А показана аминокислотная последовательность мутеина липокалина SEQ ID NO:1, слитая через линкер (показанный серым полужирным курсивом) с альбуминсвязывающим доменом (ABD) (показанным полужирным шрифтом) и меткой, связывающейся со стрептавидином, Strep-tag™ (показанной курсивом) (SEQ ID NO:15).

На Фиг.4Б показана аминокислотная последовательность липокалина hNGAL, кодируемая вектором phNGAL 98, слитая с меткой, связывающейся со стрептавидином, Strep-tag™ (показанной курсивом), и N-концевой Т7-меткой (показанной полужирным курсивом) (SEQ ID NO:34). Данный полипептид кодируется phNGAL 101.

На Фиг.5 показаны результаты прямого ELISA выбранных мутеинов Lcn2.

На Фиг.6 показаны результаты конкурентно-связывающего анализа выбранных мутеинов Lcn2.

На Фиг.7 приведены показатели аффинности выбранных мутеинов в отношении человеческого гепсидина-25 и гепсидина-25 яванского макака, определенные поверхностным плазменным резонансом (SPR).

На Фиг.8 показана нейтрализующая активность мутеинов липокалина против гепсидина-25 in vitro.

На Фиг.9 показано, что мутеин липокалина, направленный против гепсидина, нейтрализует человеческий гепсидин, вводимый мышам. SD -стандартное отклонение.

На Фиг.10 показаны фармакокинетические параметры SEQ ID NO:14-PEG и SEQ ID NO:1-ABD (равноценной SEQ ID NO:15). T¹/₂ - период полувыведения; в/в - внутривенно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение относится к новым, специфично связывающимся белкам, направленным против или специфичным в отношении гепсидина. Белки по изобретению могут быть использованы в терапевтических и/или диагностических целях. При использовании здесь белок по изобретению «специфично связывается» с мишенью (здесь, с гепсидином), если он способен отличать эту мишень от одной или более контрольных мишеней, поскольку специфичность связывания является не абсолютным, а относительным свойством. «Специфичное связывание» можно определить, например, вестерн-блоттингом, твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), радиоиммунным анализом (RIA), электрохемилюминесцентным анализом (ECL), иммунорадиометрическим анализом (IRMA), сортировкой клеток с возбуждением флуоресценции (FACS), иммуногистохимическим исследованием (IHC) и пептидным сканированием.

Белки по изобретению, направленные против или специфичные в отношении гепсидина, включают любое количество специфично связывающихся мутеинов белков на основе определенного белкового каркаса. При использовании здесь «мутеин», «мутированная» группировка (белок или нуклеиновая кислота) или «мутант» относятся к замене, делеции или вставке одного или более нуклеотидов или аминокислот, соответственно, по сравнению с встречающимся в природе нуклеотидным или белковым «эталонным» каркасом (каркасом дикого типа).

Белок по изобретению может представлять собой мутеин липокалина, предпочтительно липокалина, выбранного из группы, состоящей из ретинолсвязывающего белка (RBP), билинсвязывающего белка (ВВР), аполипопротеина D (АРО D), липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), липокалина слезы (TLPC), α2-микроглобулин-родственного белка (A2m), 24р3/угерокалина (24р3), белка желез Эбнера-1 (VEGP 1), белка желез Эбнера-2 (VEGP 2) и предшественника главного аллергена Can f1 (ALL-1). При использовании здесь «липокалин» определяют как мономерный белок массой приблизительно 18-20 кДа, имеющий цилиндрическую β-складчатую область супервторичной структуры, содержащую множество β-цепей (предпочтительно восемь), соединенных попарно множеством петель (предпочтительно четырьмя) на одном конце с образованием посредством этого связывающего кармана. Именно разнообразие петель в остальном ригидном каркасе липокалинов приводит к множеству различных вариантов связывания у представителей семейства липокалинов, способных связываться с мишенями различного размера, формы и с разными химическими свойствами (обзор, например, в Flower, D.R. (1996), см. выше; Flower, D.R. et al. (2000), см. выше, или Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350). Действительно, белковое семейство липокалинов естественным образом эволюционировало с развитием связывания с широким спектром лигандов при необычно низких уровнях общей консервативности последовательности (часто при идентичности последовательности менее 20%), сохраняя, однако, высококонсервативную общую пространственную структуру. Соответствие положений различных липокалинов хорошо известно специалисту в данной области техники. См., например, патент США №7250297.

В предпочтительном воплощении белок по изобретению представляет собой мутеин липокалина-2 (Lcn2; также известного как человеческий липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов, hNGAL, или как сидерокалин). При использовании здесь термин «человеческий липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов», или «hNGAL», или «липокалин-2», или «Lcn2» относится к зрелому hNGAL с регистрационным номером в базе данных SWISS-PROT/UniProt P80188 или зрелому hNGAL, показанному в SEQ ID NO:35. Зрелая форма данного белка имеет аминокислоты 21-198 полной последовательности ввиду отщепления сигнального пептида из аминокислот 1-20. Данный белок также имеет дисульфидную связь, образованную между аминокислотными остатками в положениях 76 и 175 зрелого белка.

В более предпочтительном воплощении изобретение относится к мутеину липокалина, имеющему цилиндрическую β-складчатую область супервторичной структуры, содержащую восемь β-цепей, соединенных попарно четырьмя петлями на одном конце с образованием посредством этого связывающего кармана, где по меньшей мере одна аминокислота каждой из по меньшей мере трех из указанных четырех петель мутирована и где указанный липокалин эффективно связывается с гепсидином в качестве данной искусственной мишени с поддающейся определению аффинностью. Предпочтительно, указанный мутеин липокалина имеет одну или более, как, например, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных замен в положении, соответствующем положению 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и/или 134 линейной полипептидной последовательности NGAL.

В данном контексте авторы изобретения идентифицировали определенную группу мутеинов липокалина-2 с мутациями в определенных положениях, демонстрирующих поддающуюся определению аффинность, а также специфичность в отношении гепсидина. Подходящие аминокислотные положения для мутаций включают положения 96, 100 и 106 линейной полипептидной последовательности человеческого липокалина-2. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти белки.

Другие белковые каркасы, которые могут быть сконструированы согласно настоящему изобретению для получения мутеинов белков, связывающихся с гепсидином, с поддающейся определению аффинностью, включают: домен, подобный эпидермальному фактору роста (EGF-подобный домен), домен «двойная петля», фибронектиновый домен I типа, фибронектиновый домен II типа, фибронектиновый домен III типа, домен PAN, домен G1a, домен SRCR, домен Кунитца/домен-ингибитор трипсина поджелудочной железы крупного рогатого скота, тендамистат, домен-ингибитор сериновых протеаз типа Казал (Kazal), домен-трилистник (Trefoil-домен Р-типа), домен фактора фон Виллебранда типа С, анафилатоксиноподобный домен, домен CUB, тиреоглобулиновый повтор I типа, домен рецептора липопротеинов низкой плотности (LDL) класса А, домен Sushi, домен Link, тромбоспондиновый домен I типа, домен иммуноглобулина или иммуноглобулиноподобный домен (например, однодоменные антитела или верблюжьи антитела из тяжелых цепей), пектиновый домен С-типа, домен МАМ, домен фактора фон Виллебранда типа А, домен соматомедина В, домен WAP-типа с четырьмя дисульфидными связями в сердцевине (WAP-type four disulfide core domain), домен F5/8 типа С, гемопексиновый домен, домен SH2, домен SH3, EGF-подобный домен ламининового типа, домен С2, «каппатела» ("Kappabodies") (III. et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng 10:949-57 (1997)), «минитела» ("Minibodies") (Martin et al. "The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6" EMBO J 13:5303-9 (1994)), «диатела» ("Diabodies") (Holliger et al. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)), «янусины» ("Janusins") (Traunecker et al. "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells" EMBO J 10:3655-3659 (1991) и Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer SuppI 7:51-52 (1992)), нанотело (nanobody), аднектин, тетранектин, микротело, аффилин, аффитело, анкирин, кристаллин, ноттин, убиквитин, белок типа «цинковый палец», автофлуоресцентный белок, анкирин или белок с анкириновыми повторами, или белок с повторами, богатыми лейцином, авимер (Silverman, Lu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP 2005, Nat Biotech, Dec;23(12): 1556-61, E-Publication in Nat Biotech. 2005 Nov 20 edition); а также мультивалентные авимерные белки, эволюционировавшие перетасовкой экзонов в семействе человеческих рецепторных доменов (также описанные в Silverman J, Lu Q, Bakker А, То W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP, Nat Biotech, Dec;23(12):1556-61, E-Publication in Nat. Biotechnology. 2005 Nov 20 edition).

Белок по изобретению может содержать аминокислотную последовательность «исходного» белкового каркаса (такого как липокалин) дикого типа (природную последовательность) вне мутированных положений аминокислотной последовательности; альтернативно, мутеин липокалина может также содержать аминокислотные мутации вне положений последовательности, подвергнутых мутагенезу, не нарушающие связывающую активность и пространственную структуру мутеина. Такие мутации могут быть проведены на уровне ДНК с применением известных стандартных способов (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Возможные изменения аминокислотной последовательности представляют собой вставки или делеции, а также аминокислотные замены.

Такие замены могут быть консервативными, то есть аминокислотный остаток заменяют на химически сходный аминокислотный остаток. Примерами консервативных замен являются замены среди представителей следующих групп: (1) аланин, серин и треонин; (2) аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; (3) аспарагин и глутамин; (4) аргинин и лизин; (5) изолейцин, лейцин, метионин и валин; и (6) фенилаланин, тирозин и триптофан. С другой стороны, также возможно проведение неконсервативных изменений аминокислотной последовательности. Кроме того, вместо замены отдельных аминокислотных остатков также возможны вставка или делеция одной или более смежных аминокислот первичной структуры исходного белкового каркаса, где эти делеции или вставки приводят к образованию стабильного свернутого/функционального мутеина, который может быть легко исследован специалистом в данной области техники.

Специалисту в данной области техники будут ясны способы, полезные для получения мутеинов белков, предполагаемых согласно настоящему изобретению, но белковые или нуклеотидные последовательности которых не раскрыты здесь в прямой форме. В общих чертах, такие модификации аминокислотной последовательности включают, например, направленный мутагенез отдельных аминокислотных положений для упрощения субклонирования мутированного гена липокалина или его частей включением сайтов расщепления для определенных рестриктаз. Кроме того, эти мутации могут также быть включены для дополнительного улучшения аффинности мутеина липокалина в отношении данной мишени. Более того, при необходимости могут быть введены мутации для изменения определенных свойств мутеина, как, например, для улучшения стабильности пространственной структуры, стабильности в сыворотке, устойчивости белка или растворимости в воде или для снижения склонности к агрегации. Например, природные остатки цистеина могут быть заменены на другие аминокислоты для предотвращения образования дисульфидных связей.

Соответственно, изобретение также включает функциональные варианты белков, раскрытых здесь, имеющие пороговую идентичность последовательности или гомологию последовательности относительно эталонного белка. Под «идентичностью» или «идентичностью последовательности» понимают свойство последовательностей, характеризующее их сходство или родство. При использовании в настоящем изобретении термин «идентичность последовательности» или «идентичность» обозначает процент попарно идентичных остатков, после (гомологичного) выравнивания последовательности полипептида по изобретению и рассматриваемой последовательности, относительно числа остатков в более длинной из этих двух последовательностей. Процент идентичности определяют делением числа идентичных остатков на общее число остатков и умножением полученного числа на 100. Термин «гомология» использован здесь в его обычном значении, и включает идентичные аминокислоты, а также аминокислоты, рассматриваемые как консервативные замены (например, замену остатка глутамата на остаток аспартата) в эквивалентных положениях линейной аминокислотной последовательности двух белков. Наиболее предпочтительно, аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:35, является предпочтительной «эталонной последовательностью». В SEQ ID NO:35 показан зрелый hNGAL. Термины «эталонная последовательность» и «последовательность дикого типа» (NGAL) использованы здесь взаимозаменяемо. Альтернативно, в качестве эталонной последовательности может быть использована аминокислотная последовательность с регистрационным номером в базе данных SWISS-PROT/UniProt P80188.

Процент гомологии последовательности или идентичности последовательности может, например, быть определен здесь с использованием программы BLASTP, версии blastp 2.2.5 (16 ноября 2002 г.; cf. Altschul, S.F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402). В данном воплощении процент гомологии основан на выравнивании полноразмерных полипептидных последовательностей (матрица: BLOSUM 62; значения разрыва: 11,1; установленное значение отсечения 10^-3), включая пропептидные последовательности, предпочтительно с использованием белкового каркаса дикого типа в качестве эталона при попарном сравнении. Его вычисляют как процент числа «положительных результатов» (гомологичных аминокислот), указанных как результат в программе BLASTP, разделенного на общее число аминокислотных остатков, выбранных программой для выравнивания.

Также возможна преднамеренная замена других положений аминокислотной последовательности на цистеин для введения новых реакционно-способных групп, например, для конъюгации с другими соединениями, такими как полиэтиленгликоль (PEG), гидроксиэтилкрахмал (HES), биотин, пептиды или белки, или для образования искусственных дисульфидных связей. Относительно мутеина человеческого липокалина-2, примерами таких возможных мутаций с введением остатка цистеина в аминокислотную последовательность липокалина, включая мутеин человеческого липокалина-2, является введение остатка цистеина (Cys) по меньшей мере в одно из положений последовательности, соответствующих положениям 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 или 158 последовательности hNGAL дикого типа. В некоторых воплощениях, где мутеин человеческого липокалина-2 по изобретению имеет последовательность, в которой, по сравнению с последовательностью с регистрационным номером в базе данных SWISS-PROT/UniProt P80188, цистеин был заменен на другой аминокислотный остаток, соответствующий цистеин может быть повторно введен в последовательность. В качестве иллюстративного примера, в таком случае возможно введение остатка цистеина в аминокислотном положении 87 с возвращением цистеина, исходно присутствовавшего в последовательности с регистрационным номером в SWISS-PROT P80188. Полученная тиоловая группировка в боковой цепи любого из аминокислотных положений 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 и/или 158 может быть использована для пегилирования мутеина или его связывания с HES, например, с целью увеличения периода полувыведения соответствующего мутеина человеческого липокалина-2 из сыворотки.

При использовании согласно изобретению термин «положение» обозначает положение аминокислоты в аминокислотной последовательности, показанной здесь, или положение нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, показанной здесь. При использовании здесь термин «соответствующий» также включает, что положение определено не только числом предшествующих нуклеотидов/аминокислот. Соответственно, положение данной аминокислоты согласно изобретению, которая может быть заменена, может варьировать из-за делеции или добавления аминокислот в другой части липокалина (мутантного или дикого типа). Сходным образом, положение данного нуклеотида согласно настоящему изобретению, который может быть заменен, может варьировать из-за делеций или дополнительных нуклеотидов в другой части 5’-нетранслируемой области (UTR) мутеина или липокалина дикого типа, включая промоторные и/или любые другие регуляторные последовательности гена (включая экзоны и интроны).

Таким образом, под «соответствующим положением» согласно изобретению предпочтительно понимают, что нуклеотиды/аминокислоты могут отличаться по указанному числу, но все еще могут иметь сходные соседние нуклеотиды/аминокислоты. Указанные нуклеотиды/аминокислоты, которые могут быть заменены, удалены или добавлены также включают в термин «соответствующее положение». При использовании здесь «в положении, соответствующем положению», означает, что положение в «запрашиваемой» аминокислотной (или нуклеотидной) последовательности соответствует положению в «данной» аминокислотной (или нуклеотидной) последовательности.

Конкретно, для определения того, соответствует ли нуклеотидный остаток или аминокислотный остаток аминокислотной последовательности липокалина, отличного от мутеина липокалина NGAL по изобретению, определенному положению в нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности описанного мутеина липокалина NGAL, в частности любой из SEQ ID NO:1-14 или последовательности, имеющей одну или более аминокислотных замен, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 замен, в положении 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и/или 134 линейной полипептидной последовательности NGAL, специалист в данной области техники может применять средства и способы, хорошо известные в данной области техники, например, выравнивания, ручные или с использованием компьютерных программ, таких как BLAST2.0, что расшифровывается как Basic Local Alignment Search Tool, или ClustalW, или любой другой подходящей программы, подходящей для проведения выравнивания последовательностей. Соответственно, мутеин липокалина по любой из SEQ ID NO:1-14 или мутеин липокалина, имеющий одну или более аминокислотных замен, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 замен, в положении 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и/или 134 или любом другом положении, описанном здесь, линейной полипептидной последовательности NGAL, может служить в качестве «данной последовательности», в то время как аминокислотная последовательность липокалина, отличного от NGAL, служит в качестве «запрашиваемой последовательности».

С учетом описанного выше, специалист в данной области техники может, таким образом, легко определить, какое аминокислотное положение, мутированное в Lcn2, как описано здесь, соответствует аминокислоте каркаса, отличного от Lcn2, предпочтительно такого, как один из описанных здесь. Конкретно, специалист в данной области техники может провести выравнивание аминокислотной последовательности мутеина, описанного здесь, в частности мутеина NGAL (или антикалина) по изобретению, с аминокислотной последовательностью другого липокалина для определения того, какая(ие) аминокислота(ы) указанного мутеина соответствует(ют) соответствующей(им) аминокислоте(ам) аминокислотной последовательности указанного другого липокалина. Конкретнее, специалист в данной области техники может таким образом определить, какая аминокислота аминокислотной последовательности указанного другого липокалина соответствует аминокислоте в положении(ях) 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и/или 134 или аминокислоте в любом другом положении линейной полипептидной последовательности NGAL, как описано здесь.

Белки по изобретению, направленные против или специфичные в отношении гепсидина, включают любое количество специфично связывающихся мутеинов белков на основе определенного белкового каркаса. Предпочтительно, каркас представляет собой hNGAL. При использовании здесь «мутеин», «мутированная» группировка (белок или нуклеиновая кислота) или «мутант» относятся к замене, делеции или вставке одного или более нуклеотидов или аминокислот, соответственно, по сравнению с встречающимся в природе нуклеотидным или белковым «эталонным» каркасом (каркасом дикого типа). Предпочтительно, количество замененных, удаленных или вставленных нуклеотидов или аминокислот, соответственно, составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более, как, например, 25, 30, 35, 40, 45 или 50. Тем не менее, предпочтительно, что мутеин по изобретению все еще способен связываться с гепсидином.

В некоторых воплощениях белок по изобретению связывается с гепсидином с K_D 100 мкМ или менее, включая 5 мкМ или менее, приблизительно 500 нМ, приблизительно 200 нМ или менее, 100 нМ или менее, 1 нМ или менее или 0,1 нМ или менее. Белок по изобретению может специфично связываться с одним или более чем одним непрерывным, прерывистым или конформационным эпитопом зрелой, свернутой, биологически активной формы гепсидина.

Белок по изобретению способен связываться с гепсидином с поддающейся определению аффинностью, то есть с константой диссоциации по меньшей мере 200 нМ, то есть K_D приблизительно 200 нМ или менее. В некоторых воплощениях белок по изобретению связывается с гепсидином с константой диссоциации по меньшей мере приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 25 нМ, приблизительно 15 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 0,5 нМ, приблизительно 0,25 нМ, приблизительно 0,1 нМ, приблизительно 0,05 нМ или еще меньше. Белок по изобретению предпочтительно связывается с молекулой зрелого человеческого гепсидина с аффинностью, определенной по K_D, приблизительно 10 нМ или сильнее. Авторы изобретения часто определяли аффинности связывания по K_D менее приблизительно 1 нМ и, в некоторых случаях, приблизительно 0,1 нМ и менее.

Аффинность связывания белка по изобретению (например, мутеина липокалина) в отношении выбранной мишени (в данном случае, гепсидина) может быть измерена (и, таким образом, значения K_D комплекса мутеин-лигнад могут быть определены) множеством способов, известных специалистам в данной области техники. Такие способы включают, без ограничения, флуоресцентное титрование, конкурентный ELISA, калориметрические способы, такие как изотермическая титрационная калориметрия (ITC), и поверхностный плазменный резонанс (BIAcore). Такие способы хорошо известны в данной области техники, и их примеры также подробно описаны ниже.

Аминокислотная последовательность белка по изобретению может иметь высокую идентичность последовательности в отношении зрелого человеческого липокалина-2 или других липокалинов. В данном контексте белок по изобретению может быть по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 90%, включая по меньшей мере 95%, идентичен белку, выбранному из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-14. Предпочтительно, что структурный гомолог все еще имеет аминокислотную замену в одном или более, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 положениях, соответствующих положению 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и/или 134 линейной полипептидной последовательности NGAL.

Изобретение также включает структурные гомологи белков, выбранных из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-14, имеющие гомологию аминокислотной последовательности или идентичность последовательности более приблизительно 60%, предпочтительно более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 92% и наиболее предпочтительно более 95%, по сравнению с указанными последовательностями. Предпочтительно, что структурный гомолог все еще имеет аминокислотную замену в одном или более, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 положениях, соответствующих положению 36. 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и/или 134 линейной полипептидной последовательности NGAL.

Термин «гепсидин» относится к белку, также называемому экспрессируемым в печени антимикробным пептидом-1 (liver-expressed antimicrobial peptide 1) или предполагаемым регрессором опухолей печени (putative liver tumor regressor), человеческая форма которого имеет регистрационный номер в UniProtKB/Swiss-Prot P81172. Обычно термин «гепсидин» относится к любой форме белка гепсидина, о которой известно, что она присутствует у видов позвоночных, включая млекопитающих. Длина человеческого непроцессированного белка составляет 84 аминокислоты, и он кодируется ге