Способ диагностики/скрининга колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов g, а и м в крови человека на биологическом микрочипе

Способ диагностики/скрининга колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов g, а и м в крови человека на биологическом микрочипе

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

(Technical Field)

Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности, к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу и касается способа диагностики колоректального рака, основанного на одновременном количественном определении концентрации онкомаркеров белковой природы, уровней антител к онкоассоциированным гликанам, уровней иммуноглобулинов G, А, M в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе. Биологический микрочип на основе гидрогелей содержит иммобилизованные антитела к белковым онкомаркерам, иммобилизованные гликаны (в том числе онкоассоциированные), иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов человека G, А, М. Предлагаемое изобретение может найти применение в аналитической биохимии, иммунологии и медицине, в частности при диагностике колоректального рака.

Уровень техники

(Background Art)

Колоректальный рак (КРР) стоит на третьем месте по распространенности среди населения индустриальных стран (Claudia Allemani, Hannah К Weir, Helena Carreira, Rhea Harewood, Devon Spika, Xiao-Si Wang, Finían Bannon, Jane V Ahn, Christopher J Johnson, Audrey Bonaventure, Rafael Marcos-Gragera, Charles Stiller, Guiñar Azevedo e Silva, Wan-Qing Chen, Olufemi J Ogun MPC, Group* and the CW. Global surveillance of cancer survival 1995-2009: analysis of individual data for 25 676 887 patients from 279 population-based registries in 67 countries (CONCORD-2). Lancet 2014;(November 26). doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(14)62038-9). Статистика развитых стран мира свидетельствует о неуклонном росте впервые выявленных случаев рака толстой и прямой кишки по сравнению со злокачественными опухолями любой другой локализации, кроме рака легкого. Смертность от КРР также очень высока, например, в США 10% всех онкологических смертей приходится на КРР, для Японии эта цифра 13%.

Россия относится к странам с высоким уровнем заболеваемости КРР и смертности от него. В 2010 г. в нашей стране зарегистрировано более 58 тыс.новых случаев КРР; в структуре онкологической заболеваемости в 2008 г. рак ободочной кишки находился на 4-м месте (6,5% случаев), рак прямой кишки - на 5-м месте (4,9%). Соответственно увеличивается и смертность. Так, в структуре общей смертности доля рака толстой кишки в 2008 г. составила 7,0% (3-е место), а доля рака прямой кишки - 5,8% (4-е место) (Чиссов В.И. и др. Злокачественные новообразования в России в 2010 году: заболеваемость и смертность // ФГБУ МНИОИ им П.А. Грецена. - 2012; 1: 17-136). Главными факторами риска для развития КРР являются генетическая предрасположенность, воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона, язвенный колит, дивертикулит.На ранних этапах, КРР развивается с минимальными клиническими симптомами. В то же время, считается, что смертность от КРР можно снизить с помощью ранней диагностики.

Аденомы считаются наиболее важным предшественником спорадического КРР. Однако было доказано, что у 50% людей с течением жизни будет развиваться колоректальная аденома, но только у 6% она трансформируется в КРР (Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer Statistics, 2012. CA Cancer J Clin 2012;62:10-29). Зубчатые полипы (т.е. зубчатые аденомы и большие гиперпластические полипы) все чаще признаются источником вероятных предраковых поражений. По оценкам 20% - 30% КРР возникают из зубчатых полипов, а не из аденом (Noffsinger АЕ. Serrated polyps and colorectal cancer: new pathway to malignancy. Annu. Rev. Pathol. 2009; 4:343-364).

Зубчатые полипы, как правило, расположены с правой стороны, более распространены среди пожилых людей, и менее заметны эндоскопически, чем аденомы (Groff RJ, Nash R, Ahnen DJ. Significance of serrated polyps of the colon. Curr. Gastroenterol. Rep.2008; 10(5):490-498.). Они растут быстрее, чем аденомы и могут прогрессировать быстрее в КРР (Noffsinger А.Е. Serrated polyps and colorectal cancer: new pathway to malignancy. Annu. Rev. Pathol. 2009; 4:343-364). Развитие зубчатых полипов связывают с BRAF мутациями, которые редко присутствуют при аденомах. До сих пор нет единого критерия, который должен быть использован для идентификации высокого риска развития КРР из зубчатого полипа, кроме, пожалуй, одного критерия - размер полипа свыше 1 см.

Сегодня для обнаружения колоректального рака применяют следующие инвазивные методы - колоноскопию, гибкую сигмоидоскопию, ирригоскопию с двойным контрастированием, компьютерно - томографическую колонографию («виртуальную колоноскопию»).

Гибкая сигмоидоскопия позволяет обследовать внутреннюю поверхность толстой кишки на расстоянии 60 см от анального отверстия. С помощью этого метода можно выявить колоректальные полипы и опухоли. Однако очевидным недостатком этого метода является возможность обследования только левой части толстой кишки, а правая ее часть остается необследованной. В то время как специфичность гибкой сигмоидоскопии очень высока (98-100%), чувствительность в отношении выявления КРР низка от 35% до 70% из-за наличия большого количества правосторонних аденом.

Колоноскопия позволяет выявить и удалить полипы, провести биопсию опухоли, расположенной в толстой кишке. Специфичность и чувствительность выявления полипов и КРР высоки. Пока нет перспективных рандомизированных исследований, в которых бы оценивалось влияние колоноскопии на заболеваемость и уровень смертности. Однако, по данным математического моделирования отдаленные результаты полиэктомии (United States National Polyp Study) показывают почти 90% снижение случаев заболеваемости КРР и смертельных исходов от него (Regula J., Rupinski M., Kraszewska Ε., Polkowski Μ. and other. Colonoscopy in colorectal cancer screening for detection of advanced neoplasia. N. Engl. J. Med. 2006; 355: 1863-1872).

Колоноскопия является «золотым стандартом» выявления КРР, все пациенты с положительным результатом других скрининговых исследований должны быть в последующем направлены на колоноскопию.

Ирригоскопия с двойным контрастированием (ИДК) позволяет исследовать всю толстую кишку, ее чувствительность и специфичность ниже диагностических показателей, получаемых при проведении колоноскопии. Даже при наличии больших полипов и опухолей ИДК обладает существенно более низкой чувствительностью (48%), чем колоноскопия. Кроме того, ИДК дает больше, чем колоноскопия, ложно - положительных результатов (артефакты, определяемые как полипы) (Winawer S.J., Stewart Е.Т., Zauber A.G., Bond J.H., and other. A comparison of colonoscopy and double- contrast barium enema for surveillance after polypectomy. National Polyp Study Work Group.N. Engl. J. Med. 2000; 342: 1766-1772). Пациентам, у которых при ИДК была выявлена патология, в последующем необходимо провести колоноскопию. Несмотря на эти недостатки ИДК широко распространена и тот факт, что с ее помощью можно выявить до 50% больших полипов, обуславливает ее применение при отсутствии возможности проведения более точных исследований.

Компьютерно-томографическая колонография (КТК). Послойной спиральное компьютерно-томографическое сканирование брюшной полости и таза с последующей цифровой обработкой и анализом изображений может создать как дву -, так и трехмерную реконструкцию просвета толстой кишки («виртуальная колоноскопия»). Проведение этого исследования требует инсуфляции воздуха для раздувания кишки до возможного объема, который может перенести пациент.Мета - анализ исследований, в которых КТК использовали для выявления колоректальных полипов и рака, показал высокую чувствительность (93%) и высокую специфичность (97%) при наличии полипов размером в 10 мм или более. Однако, при комбинации полипов больших и средних размеров (свыше 6 мм) чувствительность метода снижалась до 86% и специфичность также до 86%. При исследовании полипов разных размеров разброс показателей чувствительности (от 45% до 97%) и специфичности (от 26% до 97%) становился слишком большим. Серьезным препятствием использования КТК для раннего определения КРР является то, что полипы размерами 6 мм-9 мм и плоские образования в кишке могут быть пропущены (Kim D.H., Pickhardt P.J., Taylor A.J., Leung W.K. and other. CT colonography versus colonoscopy for the detection of advanced neoplasia. The New England journal of medicine. 2007; 357: 1403-1412). Большим недостатком КТК является и то, что для его повторного проведения пациента необходимо подвергнуть повторному воздействию ионизирующего излучения.

Вышеописанные инвазивные методы не подходят для ранней диагностики КРР, т.к. ни одно из перечисленных выше исследований не может охватить полной картины развития и распространения КРР.

Для молекулярной диагностики КРР необходимо контролировать высвобождение опухолевых маркеров на различных стадиях роста опухоли и в различных биологических средах (Ahlquist DA, Harrington JJ, Burgart LJ, Roche PC. Morphometry analysis of the "mucocellular layer" overlying colorectal cancer and normal mucosa: relevance to exfoliation and stool screening. Hum. Pathol. 2000; 31(1):51-57).

К широко распространенным неинвазивным методам определения КРР, используемым в клинике, относятся анализ кала на скрытую кровь, иммунохимическое определение гемоглобина в стуле пациента, определение ДНК маркеров в стуле пациента, определение белковых онкомаркеров в сыворотке крови пациента.

Анализ кала на скрытую кровь основан на определении гемоглобина в стуле пациента (Allison JE, Sakoda LC, Levin TR et al. Screening for colorectal neoplasms with new fecal occult blood tests: update on performance characteristics. J Natl Cancer Inst 2007; 99:1462-1470). Наиболее распространенными являются тесты Hemoccult II (Smith Kline Diagnostics) и Hemoccult II Sensa (Smith Kline Diagnostics). При наличии крови в кале гваяковый тест показывает синее окрашивание. Изменение цвета связано в пероксидазо-подобной активностью гемоглобина в стуле. Для гваякового теста характерна большая доля ложноположительных реакций, низкая специфичность выявления КРР. Ложно-позитивные сигналы могут возникать из-за нарушения диеты при подготовке к анализу, например употребление красного мяса, растительных пероксидаз (некоторые фрукты и овощи), употребление высоких доз витамина С.Наличие геморроя и ангиодисплазий, также могут вызывать ложные положительные результаты. Современные рекомендации по Hemoccult тестированию включают в себя пищевые ограничения (Ransohoff D.F., Lang С.А., Part I: Suggested technique for fecal occult blood testing and interpretation in colorectal cancer screening. Ann Intern Med 1997 126:808).

Из-за низкого уровня диагностической чувствительности, этот тест не позволял выявлять ранние стадии рака (Heresbach D, Manfredi S, D'Halluin Ρ Ν, Bretagne JF, Branger В. Review in depth and meta-analysis of controlled trials on colorectal cancer screening by fecal occult blood test. Eur J Gastroenterol Hepatol 2006; 18(4):427-433).

В основе иммунохимического выявления гемоглобина в стуле пациента лежит взаимодействие гемоглобина со специфическими антителами, с последующей регистрацией сигнала иммунохимическим методом (ИФА). Эти тесты не реагируют с нечеловеческим гемоглобином или пероксидазами растений, что позволяет не соблюдать диетические ограничения (Cole SR, Young GP. Effect of dietary restriction on participation in fecal occult blood test screening for colorectal cancer. Med J Aust 2001; 175(4):195-198). Примерами таких тестов являются HemeSelect (SmithKline Diagnostics, США) и InSure (Enterix Inc., США).

Количественное определение гемоглобина в стуле пациента лежит в основе теста FOB Gold (Sentinel Diagnostics, Италия). Тест FOB Gold позволяет точно определить количественное содержание гемоглобина в стуле без предварительного соблюдения пациентами строгой диеты. Метод основан на реакции агглютинации антиген-антитело между гемоглобином человека и анти-гемоглобин-антителом на латексных частицах. Агглютинация измеряется по абсорбции при 570 нм, увеличение единиц абсорбции пропорционально количеству гемоглобина человека в образце. Данный тест является полностью автоматическим. Специальная пробирка для сбора образцов разработана как контейнер для сбора стула и помещается прямо в биохимический анализатор. К недостаткам метода относится низкая чувствительность выявления КРР.

Метод обнаружения ДНК маркеров в стуле пациента стремительно развивается с начала 2000 г. (Ahlquist DA. Colorectal cancer screening by detection of altered human DNA in stool: Feasibility of a multitarget assay panel. Gastroenterology 2000; 119(5):1219-1227). Целесообразность тестирования стула на наличие ДНК для выявления КРР была впервые продемонстрирована, когда в 1992 г. впервые была обнаружена связь КРР и единственного маркера - мутантного гена KRAS (Sidransky D, Tokino Τ, Hamilton SR, et al. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science 1992; 256(5053): 102-105). ДНК-тест позволяет обнаруживать до 52% инвазивных опухолей КРР по сравнению с 13%, обнаруживаемыми с помощью обычного гваякового теста (Р=0,003), с сопоставимым уровнем специфичности. В другом исследовании (Ahlquist DA, Sargent DJ, Loprinzi CL, et al. Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Ann. Intern. Med. 2008; 149(7):441-450), одновременное использование трех маркеров ДНК позволило выявить 46% случаев аденом, в то время как гваяковый тест обнаружил только 10% (Р<0,001), причем специфичность ДНК теста была на 17% выше.

Тем не менее, тест ДНК имеет более низкий уровень чувствительности по сравнению с анализом кала на скрытую кровь (Ahlquist DA, Sargent DJ, Loprinzi CL, et al. Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Ann. Intern. Med. 2008; 149(7):441-450.).

Несмотря на большое разнообразие молекулярных подходов к скринингу колоректального рака, описанных выше, в настоящее время все еще существует необходимость в методе, обладающим высоким диагностическим потенциалом для повышения эффективности скрининга/диагностики КРР и предоставляющим персоналу возможность работать с сывороткой крови пациента.

В клинической практике для диагностики КРР принято определять концентрацию двух белковых онкомаркеров: карциноэмбрионального антигена (РЭА) и карбогидратного антигена СА 19-9 в сыворотке крови пациента методом ИФА (Gold Ρ, Freedman SO. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. J. Exp.Med. 1965; 122(3):467-481. Locker GY, Hamilton S, Harris J, et al. ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumor markers in gastrointestinal cancer. J. Clin. Oncol. 2006; 24(33):5313-5327), однако чувствительность метода не высока. Традиционно концентрации онкомаркеров в сыворотке крови пациентов определяют методом твердофазного иммуноанализа ИФА. Наиболее распространенные коммерческие тест-системы, основанные на твердофазном ИФА (Fujirebio Diagnostics - CanAg, Швеция, NovaTec, Германия, Abazyme, Needham, США, Biosourse Diagnostics, Бельгия, Alpha Diagnostic Intl., Texas, США; Вектор-Бест, Иммунотех, Амеркард и Хема-Медика, Москва, Россия, Алкор-Био, Санкт-Петербург, Россия), позволяют определять содержание только одного маркера в образце.

Основными направлениями дальнейшего развития и совершенствования методов in vitro диагностики КРР являются их миниатюризация, повышение чувствительностии и возможность проведения одновременного многопараметрического анализа. Множество компании выпускают автоматические анализаторы, которые могут одновременно определеять несколько белковых онкомаркеров в сыворотке крови пациента. Концентрации онкомаркеров автоматически количественно рассчитываются по калибровочным кривым, полученным в ходе проведения иммуноанализа исследуемых растворов и контрольных образцов. Многопараметрическое тестирование образца в данной системе достигается путем одновременного проведения большого количества индивидуальных анализов на каждый онкомаркер.

Например, для определения содержания нескольких онкомаркеров используются автоматические анализаторы, например, фирмы Awareness Technology Inc., США, действующие на основе принципа ИФА, и представляющие собой открытую систему для любых методик и реактивов. Анализатор ChemWell использует стандартные микропланшеты для всех типов реакций и способен проводить несколько параллельных исследований, в том числе иммуноферментный анализ опухолевых маркеров: АФП, РЭА, ПСА, СА125, СА15-3, СА19-9, СА242, ферритина, ХГЧ, НСЕ, тканевого полипептидного антигена, бета 2-микроглобулина в 4-х лунках. Полностью автоматизированный микропланшетный ИФА-анализатор Stat Fax 3200 обеспечивает построение калибровочных кривых, процедуру обсчета результатов, вычитание фона и др., позволяет проводить до 12-и параллельных тестов одновременно. Иммунохемилюминесцентный стриповый анализатор Lumi Stat - CLIA используют для определения 11-и опухолевых маркеров РЭА, ПСАобщ, ПСАсвоб, CAI25, АФП, простатической кислой фосфатазы, CAI 9-9, CAI 5-3, NMP22 (ядерные матриксные белки), бета-2-микроглобулина, цитокератина 18. Прибор Biomerieux mini VIDAS, Франция, представляет собой мультипараметрический автоматический иммуноанализатор, основанный на технологии энзим-связанного иммунофлюоресцентного анализа и предназначен для выполнения "одиночных" тестов. Определение аналитов происходит с высокой чувствительностью (превышающей на несколько порядков чувствительность ИФА), что позволяет значительно снизить время проведения анализа (до 30 мин.). Приборы этого класса представляют собой механическое соединение нескольких анализов, но не одновременный многопараметрический анализ нескольких аналитов в одном образце.

Описано одновременное определение нескольких белковых онкомаркеров с помощью полностью автоматизированных систем Elecsys компании Roche Diagnostics, США/Швейцария, Luminex, США/Нидерланды, и AxSYM компании Abbott, США. Система Elecsys использует принцип гетерогенного иммунохимического анализа на основе электрохемилюминесцентной диагностики - аналитические полоски или микроколонки для аффинной хроматографии. Анализатор Luminex (США) основан на принципе проточной флуориметрии микросфер с иммобилизованными на поверхности лигандами (с использованием различных типов взаимодействия: комплементарное взаимодействие нуклеиновые кислот и оснований, взаимодействие лиганд-рецептор, образование иммунокомплексов, ферментативные реакции), что позволяет проводить одновременный анализ до 100 различных аналитов. Автоматизированные системы AxSYM основаны на иммуноферментном анализе на микрочастицах и/или флюоресцентном поляризационном иммуноферментном анализе. Они обеспечивают быстрое время получения результата (8-30 мин) и высокую производительность (от 80 до 120 тестов в час). Недостатком анализаторов Roche Diagnostics, Luminex и Abbott является то, что они представляют собой «закрытые» системы, состоящие из прибора-анализатора и набора реагентов к нему (используются пробирки, микроколонки, полоски и прочие реагенты только данной фирмы, предназначенные для данной системы или данного конкретного прибора), а также их высокая стоимость (от нескольких десятков до сотен тысяч долларов США), высокие требования к квалификации персонала, что не позволяет их внедрить в широкую клиническую практику. К недостаткам всех анализаторов относится большой объем сыворотки крови, забираемой на анализ (свыше 100 мкл на один онкомаркер).

Диагностика онкозаболеваний по наличию в сыворотке крови человека антител к онкоассоциированным гликанам - перспективная область онкодиагностики, активно развивается с 2010 г. Антитела к онкоассоциированным гликанам (AGA) оказались перспективными маркерами ряда заболеваний, например, рак яичников (Jacob, Francis et al. 2012. "Serum Antiglycan Antibody Detection of Nonmucinous Ovarian Cancers by Using a Printed Glycan Array." International Journal of Cancer 130(1): 138-46).

Учитывая тот факт, что большинство белковых маркеров не являются специфичными по отношению к локализации и типу опухоли, необходимо их объединить в группы в конкретных сочетаниях - так называемые диагностические и прогностические сигнатуры (комбинации белковых онкомаркеров и антител к гликанам), способные решить проблему специфичности, ранней и более точной диагностики КРР.

Поиск и отбор специфичных антител к гликановым структурам при КРР имеет высокую клиническую значимость и открывает новые возможности диагностического сопровождения процесса онкотерапии, определяет стратегию и тактику лечения, ход и возможный исход болезни. Это связано с тем, что антитела к гликанам обнаруживаются в сыворотке крови на ранних стадиях рака (Chapman С, Murray A, Chakrabarti J, et al. Autoantibodies in breast cancer: Their use as an aid to early diagnosis. Ann. Oncol. 2007;18(5):868-873. Chapman CJ, Murray A, McElveen JE, et al. Autoantibodies in lung cancer: possibilities for early detection and subsequent cure. Thorax. 2008; 63(3):228-233).

В настоящее время для проведения масштабных исследований связывания антител AGA с гликанами наиболее часто используется твердофазный иммуноанализ на плашке (Shilova NV, Galanina ОЕ, Pochechueva TV, et al. High molecular weight neoglycoconjugates for solid phase assays. Glycoconj. J. 2005; 22:43-51).

Как и в случае анализа белковых онкомаркеров, для определения антител AGA существует потребность в быстром и автоматическом анализе сыворотки крови пациента. Например, компания SCIEX (США) выпустила автоматический анализатор определения антител AGA с использованием магнитных частиц. К недостаткам этого метода относится возможность определения только AGA к N- гликанам.

В настоящее время задача проведения многопараметрического анализа при минимальном объеме тестируемого образца решается при использовании биологических микрочипов - массивов элементов, содержащих иммобилизованные биологические зонды (ДНК, белки, олигосахариды, олигонуклеотиды и т.д.). Создание биочипов позволило осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат микрочипа и проводить одновременный количественный анализ биологического образца для определения концентраций нескольких анализируемых веществ, что заменяет несколько индивидуальных иммунохимических тестов. Использование технологии микрочипов для проведения лабораторных исследований позволяет миниатюризовать и упростить процедуру анализа, в частности, для анализа белковых онкомаркеров и антител к онкоассоциированным гликанам в сыворотке крови, по сравнению с другими in vitro тестами. Разработка микрочипов для диагностики/скрининга КРР тесно связана с развитием технологии биочипов, позволяющих проводить мультиплексное исследование аналита как на наличие белковых онкомаркеров, так и на наличие антител к гликанам.

Иммунохимический принцип лежит в основе мультиплексного анализа анти-гликановых антител на биочипах, ячейки которых содержат иммобилизованные гликаны. Активность в данной области резко возросла благодаря развитию методологии, которая позволяет наносить на микрочип (размером 25х 75 мм) несколько сот различных гликанов (Blixt, Ola et al. 2004. "Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(49):17033-38. Jacob, Francis et al. 2012. "Serum Antiglycan Antibody Detection of Nonmucinous Ovarian Cancers by Using a Printed Glycan Array." International Journal of Cancer 130(1):138-46. Pochechueva, Tatiana, Francis Jacob, Andre Fedier, and Viola Heinzelmann-Schwarz. 2012. "Tumor-Associated Glycans and Their Role in Gynecological Cancers: Accelerating Translational Research by Novel High-Throughput Approaches." Metabolites 2(4):913-39. Galanina, О.E., M. Mecklenburg, N.E. Nifantiev, G. V Pazynina, and Ν. V Bovin. 2003. "GlycoChip: Multiarray for the Study of Carbohydrate-Binding Proteins." Lab on a chip 3(4):260-65).

В большинстве работ, посвященных анализу антигликановых антител, иммунохимическое определение антител проводят в сыворотках здоровых доноров, микрочипы являются двумерными, т.е. иммобилизованные гликаны находятся на поверхности носителя (стекла, пластика); при этом гликаны могут быть либо адсорбированы, либо ковалентно связаны с подложкой. Для иммобилизации гликанов используется два основных метода: химическая иммобилизация на твердой поверхности и иммобилизация гликана через спейсер (линкер). В настоящее время существует несколько платформ, которые используют для печати гликановых микрочипов.

Косорциум функциональной гликомики (www. functionalglycomic.org), например, использует NHS-активированные стеклянные слайды для печати гликанов, содержащих аминогруппу. Другие научные группы используют эпоксиактивированные слайды (Роhl NL. Fluorous tags catching on microarrays. Angew Chem Int Ed Engl. 2008; 47:3868-3870.), фторидные слайды (Ko KS, Jaipuri FA, Pohl NL. Fluorous-based carbohydrate microarrays. J Am Chem Soc. 2005;127:13162-13163; Feizi T, Chai W. Oligosaccharide microarrays to decipher the glyco code. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5:582-588.), слайды, покрытые нитроцеллюлозой (Feizi Τ, Fazio F, Chai W, et al. Carbohydrate microarrays - a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Curr Opin Struct Biol. 2003;13:637-645; Fukui S, Feizi T, Galustian C, et al. Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat Biotechnol. 2002;20:1011-1017; Padler-Karavani V, Song X, Yu H, et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 2012; 287:22593-22608.). Причем, для разных условий определения AGA требуются разные платформы для иммобилизации гликанов. Биочипы напечатанные на разных платформах из одинаковых библиотек гликанов часто показывают разные сигналы для гликан связывающих белков, разную специфичность и чувствительность проводимого анализа (Liu Y, Childs RA, Palma AS, et al. Neoglycolipid-based oligosaccharide microarray system: preparation of NGLs and their noncovalent immobilization on nitrocellulose-coated glass slides for microarray analyses. Methods Mol Biol. 2012; 808:117-136.), прямое сравнение сигналов от двух разных платформ часто вводит в заблуждение. Для печати гликанов на нитроцеллюлозной (Edwards HD, Nagappayya SK, Pohl NLB. Probing the limitations of the fluorous content for tag-mediated microarray formation. Chem Commun. 2012; 48:510-512.) и фторидной платформах (Blixt, О., Head, S., Mondala, T., Scanlan, С., Huflejt, M.E., Alvarez, R., Bryan, M.C., Fazio, F., Calarese, D., Stevens, J., Razi, N., Stevens, D.J., Skehel, J.J., van Die, I.,Burton, D.R., Wilson, I.A., Cummings, R., Bovin, N.,Wong, C.H., and Paulson, J.C. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101:17033-17038.) необходима липидная компонента, чтобы гликан мог связываться с GBPs. К преимуществам гликочипов на нитроцеллюлозной мембране можно отнести трехмерное расположение иммобилизованного гликана, но это утверждение спорно, т.к. необходимо следить за влажностью камеры, где хранится гликочип. Пересыхание микрочипа ведет к ложным результатам последующего иммуноанализа GBPs.

В международной патентной заявке Vuskovic M., M. Huflejt (US 2014/0087957 A1) описан способ диагностики и мониторинга нескольких десятков онкологических заболеваний по изменению уровня антигликановых антител nAbs к более чем 500 гликановым структурам в различных биологических жидкостях человека, причем гликаны с любыми спейсерными группами могут быть иммобилизованы на плашке, биочипах или магнитных частицах. Определение уровня антител к гликанам в сыворотке крови проводят методом твердофазного иммуноанализа. В этой патентной заявке не описаны случаи выявления КРР, к недостаткам также относится отсутствие одновременного количественного определения содержания белковых онкомаркеров, уровней иммуноглобулинов G, А, M и антител к гликанам в сыворотке крови пациента.

В международном патенте Blixt О., Head S. (US 2007/0059769 A1) описан биологический микрочип с иммобилизованными гликанами для одновременного анализа антител nAbs к более чем 1000 гликановым структурам и способы иммуноанализа, в которых биочип используется. Описанный в патенте биочип нельзя использовать для количественного анализа антител к гликанам, одновременного проведения количественного анализа белковых онкомаркеров, уровней иммуноглобулинов G, А, М, т.е. для диагностики КРР.

К недостаткам двумерных чипов относятся денатурация биологических образцов на поверхности носителя и на границе раздела фаз, приводящая к потере функциональной активности биологических образцов, недостаточная концентрация активных гликанов в ячейках микрочипа и, вследствие этого, невысокая чувствительность анализа. Более того, к недостаткам технологии двумерных гликочипов следует отнести невозможность одновременной иммобилизации гликанов и белков на одной подложке.

Коммерческие биочиповые тест-систем для определения антигликановых антител на рынке не представлены.

Альтернативой двумерным чипам для определения белковых онкомаркеров и антител к гликанам являются микрочипы на основе гидрогелей.

Технология разрабатывается в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов. При этом молекулярные зонды равномерно распределены по всему объему ячейки. За счет развитой поверхности гидрогеля молекулярные зонды иммобилизованы с достаточной плотностью иммобилизации, однако, на значительном удалении друг от друга для нивелирования стерических эффектов. Структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает нативное водное окружение биологических молекул. Очевидно, что подобный метод иммобилизации замечательно подходит для работы с молекулярными зондами белковой и гликановой природы и по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации (Rubina, a Yu et al. Hydrogel-Based Protein Microchips: Manufacturing, Properties, and Applications. BioTechniques. 2003; 34(5):1008-1014; Dyukova V.I., Dementieva E.I., Zubtsov D.A., Galanina O.E., Bovin N.V., Rubina A.Y. Hydrogel glycan microarrays. Anal. Biochem. 2005;347 (1): 94-105).

После завершения процедуры полимеризации молекулярные зонды с достаточной эффективностью ковалентно закреплены в гелевой сетке и распределены по ней равномерно (Зубцова Ж.И., Цыбульская М.В., Савватеева Е.Н., Бутвиловская В.И. и др. Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом Биочипе. Биоорганическая Химия. 2013; 39(6):693-704).

Недостатки способов диагностики колоректального рака, а так же недостатки микрочипов для анализа белковых онкомаркеров и антигликановых антител, известные из уровня техники, преодолены настоящим изобретением, обеспечивающим способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе.

Раскрытие изобретения

(Disclosure of Invention)

Первым аспектом изобретения является способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение уровня анализируемых маркеров по сравнению с уровнем маркеров в сыворотке крови здоровых доноров, свидетельствует о колоректальном раке.

В одном из воплощений способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, осуществляется в формате сэндвич-иммуноанализа и включает проведение нескольких стадий:

а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, для образования иммунных комплексов с иммобилизованными на микрочипе лигандами;

б) детекцию образовавшегося комплекса;

в) количественное определение анализируемого соединения.

В случае сэндвич-иммуноанализа белковых онкомаркеров биологический микрочип содержит иммобилизованные антитела, каждое из которых специфически взаимодействует с тем или иным определяемым аналитом, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, на данной стадии происходит образование специфического комплекса антиген - иммобилизованное антитело. При необходимости эту стадию проводят в условиях перемешивания, что значительно ускоряет проведение иммуноанализа.

После образования комплекса на стадии б) микрочип проявляют мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого соединения. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.

В случае сэндвич-иммуноанализа антител к гликанам, биологический микрочип содержит иммобилизованные гликаны против анализируемого соединения, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, и происходит образование специфического комплекса антитело - иммобилизованный гликан. После образования комплекса микрочип проявляют мечеными антивидовыми антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антитела. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.

Для количественного определения анализируемых соединений на стадии в) стадии а)-б) проводят со стандартными (эталонными) образцами, содержащими известные концентрации анализируемого соединения и строят калибровочную зависимость регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого соединения (калибровочную кривую), по которой определяют содержание анализируемого соединения в образце.

Детекцию результатов иммуноанализа осуществляют флуориметрически. Антитела и другие соединения, используемые для детекции, могут содержать флуоресцентные метки, биотин или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хеми- или биолюминесценции).

Чувствительность предлагаемого множественного параллельного иммуноанализа соединений на биологическом микрочипе не уступает чувствительности стандартного варианта иммуноанализа, например, в формате микротитровального планшета (Таблица 1)·

Таким образом, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, позволяет проводить диагностику колоректального рака, основанную на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение концентрации анализируемых маркеров по сравнению с контрольным образцом, полученным от здорового человека, свидетельствует о колоректальном раке.

Вторым аспектом изобретения является биологический микрочип для диагностики колоректального рака. Биологический микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, расположенных на подложке из стекла, пластика металла. Трехмерные гидрогелевые элементы микрочипа ковалентно закреплены на поверхности подложки и отделены друг от друга гидрофобной поверхностью подложки, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано индивидуальное соединение. В каждом гелевом элементе содержится иммобилизованный лиганд белковой или небелковой природы, который при инкубации микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, образует специфический иммунный комплекс типа «антиген-антитело». На этой стадии происходит разделение анализируемых соединений из смеси по их способности к специфическому связыванию с иммобилизованными лигандами, что позволяет проводить одновременный, параллельный анализ нескольких объектов на одном микрочипе.

Трехмерные гелевые элементы обладают значительно большей емкостью по сравнению с элементами двумерных микрочипов, что увеличивает чувствительность анализа. Гидрофильное окружение иммобилизованных в структуре гидрогеля лигандов стабилизирует их структуру, что позволяет им полностью сохранять свою биологическую активность.

Лиганды, иммобилизованные в гидрогелевых ячейках биологического микрочипа, выбирают из группы, включающей антитела любого типа и антигены различной природы.

В качестве исследуемых объектов для количественного иммунологического анализа колоректального рака согласно изобретению предпочтительно предлагаются:

- опухолеассоциированные антигены (РЭА, СА 19-9, СА 125, SCCA1 (SPB 3), SCCA2 (SPB 4), ПСА общ., ПСА своб., ХГЧ, АФП, СА 242), являющиеся маркерами онкозаболеваний;

- иммуноглобулины человека классов G, А, М;

- антитела к различным гликанам (SiaT_n, TF, T_n, Le^C, Le^Y, SiaLe^A, Manβ1-4GlcNAc, Galal-4Galβ1-4GlcNAcβ).

Для иммуноанализа опухолеассоциированных антигенов - маркеров колоректального рака в качестве иммобилизованных лигандов используют антитела к указанным опухолеассоциированным антигенам и/или сами опухолеассоциированные антигены. Для иммунологического определения иммуноглобулинов человека классов G, А, М, например, при определении иммунного статуса организма, в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа используют антитела против иммуноглобулинов G, А, М, человека и/или иммуноглобулины G, А, М, человека. Для иммуноанализа антител к различным гликанам, иммобилизованными лигандами биологического микрочипа являются гликаны.

Биологический микрочип допускает одновременное и параллельное проведение иммунохимических реакций таких, как одновременное взаимодействие иммобилизованного антитела с белковым онкомаркером, присутствующим в сыворотке крови, взаимодействие иммобилизованного гликана с антителом, присутствующим в том же образце сыворотки крови, одновременное взаимодействие иммобилизованного антитела к иммуноглобулину человека, например, класса G с иммуноглобулином данного класса, находящимся в том же образце сыворотки крови.

В другом воплощении предусмотрено последовательное проведение иммунохимических реакций, например, иммобилизованного антитела с белковым онкомаркером, присутствующим в сыворотке крови на одном кластере биочипа и взаимодействие иммобилизованного гликана с антителом, присутствующим в сыворотке крови, одновременно с взаимодействием иммобилизованного антитела к иммуноглобулину человека, например, класса G с иммуноглобулином, находящимся в же образце сыворотки крови.

Далее изобретение будет раскрыто