Мутантные полимеразы вируса гепатита в

Мутантные полимеразы вируса гепатита в

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к мутантным полипептидам полимеразы вируса гепатита В, имеющим в своем составе мутантный домен полимеразы, у которого подавлена функциональная активность полимеразы, и гибридным белкам, имеющим в своем составе такой мутантный полипептид полимеразы. Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты и экспрессирующему вектору для экспрессии указанного мутантного полипептида полимеразы, а также к композиции, которая может применяться для индукции иммунного ответа на вирус гепатита В с целью обеспечения защитного или терапевтического эффекта, направленного против инфекции, вызванной ВГВ. Изобретение представляет особый интерес в области иммунотерапии, и в частности, при лечении пациентов, инфицированных вирусом гепатита В, особенно хронически инфицированных.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гепатит В представляет собой серьезную проблему здоровья населения, в мире более 350 миллионов человек имеют хроническую инфекцию, из них от 20 до 40% имеют риск развития хронических заболеваний печени, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Несмотря на существование эффективной вакцинопрофилактики, инфекция, вызванная вирусом гепатита В (ВГВ) по-прежнему значительно распространена во многих странах, даже развитых, предполагаемое количество новых случаев инфицирования в мире ежегодно составляет около 4,5 миллионов. Несмотря на рекомендации ВОЗ о проведении всеобщей вакцинации, полный курс профилактической вакцинации проходят от 25% населения в Азии до 75-90% в Европе. В настоящее время гепатит В находится 10 месте среди причин смертности (приблизительно 1 миллион смертей в год), а карцинома печени, вызванная ВГВ, стоит на 5 месте среди самых распространенных форм рака. Географическое распределение инфекции ВГВ неоднородно, в западных странах распространенность составляет менее 1%, а в юго-восточных странах, большей части Африки и экваториальной Южной Америки - более 10%.

Вирус гепатита В является представителем гепаднавирусов и прежде всего поражает печень, реплицируясь в гепатоцитах. Вирусные частицы, способные заражать клетки, так называемые частицы Дейна размером 42-45 нм, имеют внешнюю липопротеиновую оболочку, содержащую поверхностные белки (HBs) трех различных типов, и внутренний нуклеокапсид, основным структурным белком которого является коровый белок (НВс-антиген, НВсАд). Внутри нуклеокапсида находится единственная копия генома ВГВ, связанная с вирусным белком полимеразой (Р). Кроме вирионов размером 42-45 нм, в крови пациентов, инфицированных ВГВ, содержатся сферические частицы размером 20 нм, состоящие из HBsAg и липидов организма-хозяина, высвобождающихся из инфицированых клеток. Количество этих сферических частиц превосходит количество вирионов в 10⁴-10⁶ раз.

После проникновения вирионов в гепатоциты, опосредуемого неизвестным на данный момент рецептором, нуклеокапсиды с геномной ДНК ВГВ транспортируются к ядру, где релаксированная кольцевая ДНК превращается в ковалентно замкнутую кольцевую ДНК (cccDNA). cccDNA выполняет функцию матрицы при транскрипции четырех вирусных РНК, которые поступают в цитоплазму и используются в качестве мРНК для трансляции белков ВГВ. РНК наибольшего размера (прегеномная) также выполняет функцию матрицы при репликации ВГВ, которая происходит в нуклеокапсидах в цитоплазме. Некоторые из капсидов, содержащих ДНК ВГВ и полимеразу, затем транспортируются обратно в ядро, где они высвобождают вновь образованную открытую кольцевую ДНК, из которой формируется новые порции cccDNA. cccDNA отвечает за персистенцию ВГВ, поскольку время ее полужизни больше, чем у гепатоцитов, она. Другие капсиды заключаются в оболочку путем почкования через мембраны эндоплазматического ретикулума и секретируются после прохождения через комплекс Гольджи.

Структурную и функциональную организацию генома ВГВ исследовали на протяжении более 30 лет. Геном ВГВ представлен открытой кольцевой частично двухнитевой ДНК размером приблизительно 3200 нуклеотидов, состоящей из полной минус-цепи и более короткой плюс-цепи. Она содержит 4 перекрывающихся открытых рамки считывания (ORF), С, S, Ρ и X. Открытая рамка считывания С кодирует коровый белок (или НВсАд), белок из 183 аминокислот, составляющий нуклеокапсид, и второй белок, обнаруживаеый в сыворотке пациентов при репликации вируса и известный как HBeAg, который содержит имеет часть прекорового белка на N-конце и часть HBcAg. С-конец корового белка обладает выраженными основными свойствами и содержит 4 богатых аргинином домена, которые предположительно связывают нуклеиновые кислоты и имеют множество сайтов фосфорилирования. Открытая рамка считывания S кодирует три поверхностных белка, все они имеют одинаковый С-конец, но различные N-концы из-за наличия внутри рамки считывания трех стартовых кодонов ATG, делящих открытую рамку считывания S на три участка, S (226 аминокислот), pre-S2 (55 аминокислот) и pre-S1 (108 аминокислот), соответственно. Большой поверхностный белок (белок оболочки) (L) образуется при инициации трансляции первым стартовым кодоном ATG и содержит 389 аминокислотных остатков (preS1-preS2-S). Средний поверхностный белок (М) образуется в результате трансляции участков S и pre-S2 при инициации трансляции вторым ATG, тогда как малый поверхностный белок, состоящий из 226 аминокислот (S, также обозначаемый HBsAg), образуется в результате трансляции S участка, инициируемой третьим стартовым кодоном ATG. Поверхностные белки ВГВ представляют собой гликопротеины с боковыми углеводными цепочками (гликанами), присоединенными посредством N-гликозидных связей. Открытая рамка считывания Ρ кодирует вирусную полимеразу, а открытая рамка считывания X кодирует белок, известный как белок X, который предположительно выполняет роль активатора транскрипции.

Вирусная полимераза состоит примерно из 832-845 аминокислотных остатков, в зависимости от генотипа ВГВ, и кодируется длинной открытой рамкой считывания ("Р"), которая перекрывается с З'концом гена корового белка и всех генов поверхностных белков. Вирусная полимераза является многофункциональным белком, состоящим из четырех доменов, включающих три функциональных домена, соответственно домены концевого белка, полимеразы и РНКазы Н, катализирующих основные этапы репликации ВГВ (инициация, синтез ДНК и удаление матриц РНК), а также вспомогательного спейсерного домена, находящегося между доменом концевого белка и полимеразы (см., например, Radziwill et al., 1990, J. Virol. 64:613; Bartenschlager et al., 1990, J. Virol. 64, 5324). Были охарактеризованы каталитические сайты, отвечающие за ферментативную активность. Было показано, что четыре остатка, образующих консервативный мотив YMDD (остатки с 538 по 541, нумерация указана для полимеразы размером 832 остатка), имеют принципиальное значение для ДНК- и РНК-зависимой активности ДНК-полимеразы, тогда как активность РНКазы H опосредована мотивом DEDD, включающим четыре аминокислотных остатка, не расположенных последовательно, а именно Asp (D) в положении 689, Glu (Ε) в положении 718, Asp (D) в положении 737 и Asp (D) в положении 777, а также несколько других аминокислотных остатков, включая Val (V) в положении 769 и Thr (Τ) в положении 776. Описаны различные мутации, подавляющие активность ОТ-полимеразы и РНКазы Η (Chang et al., 1990, J. Virol. 64: 5553; Bartenschlager et al., 1990, J. Virol. 64, 5324, Radziwill et al., 1990, J. Virol. 64:613 and Chen et al., 1996, J. Virol. 70:6151). Нескольким группам удалось экспрессировать белок полимеразы ВГВ в различных системах-хозяевах, но эта экспрессия оказывалась токсичной для экспрессирующих клеток и требовала использования индуцибельных промоторов (Choi et al., 2002, Antiviral Res. 55:279; Karimi et al., 2002, J. Virol. 76:8609).

Ряд доклинических и клинических испытаний доказали важность CD4+ и CD8+ Т-клеточных иммунных ответов для эффективного противовирусного ответа. Действительно, было обнаружено, что пациенты естественным образом излечившиеся от гепатита В, имели повышенный мультиспецифический и продолжительный иммунный ответ, опосредованный Т-хелперными (T_H) и цитотоксическими Τ (CTL) лимфоцитами, которые легко обнаруживаются в периферической крови. Появление антител к НВе и HBs указывает на благоприятный исход заболевания. Антитела, специфические к HbsAg, являются нейтрализующими, опосредуют защитный иммунитет и персистируют в течение жизни после клинического выздоровления.

Однако, хроническая инфекция, вызванная ВГВ, только в редких случаях побеждается иммунной системой. Преобладающее большинство пациентов с хронической инфекцией демонстрируют слабый и непродолжительный CD4 и CD8 Т-клеточный иммунный ответ, который рестриктирован по определенным антигенам и является недостаточно эффективным для элиминации вирусной инфекции. Причина такого нарушения эффекторных механизмов клеточного иммунного ответа при хроническом гепатите В в настоящее время недостаточно ясна, даже притом, что у пациентов с хронической инфекцией ВГВ наблюдалось повышение различных ингибиторных молекул, таких как PD-1, CTLA4. Следовательно, существует потребность в иммуномодулирующих подходах, которые бы позволили индуцировать эффективный Т-клеточный ответ.

Стандартная терапия при хроническом гепатите В включает пегилированный интерферон альфа (ИФНа) и аналоги нуклеозидов/нуклеотидов (NUCs), такие как ламивудин, и в последнее время энтекавир, телбивудин, адефовир и тенофовир. ИФНа является молекулой, которая обладает выраженным противовирусным действием, тем самым ингибирует репликацию вируса, но при этом вызывает серьезные побочные эффекты почти у 25-30% пациентов. NUCs действуют как конкурентные ингибиторы полимеразы ВГВ, направленные на ингибирование обратной транскрипции прегеномной РНК, в результате которой образуется минус-цепь ДНК и затем двуцепочечная вирусная ДНК. Они ограничивают образование новых вирионов, но неэффективны для удаления суперспирализованной cccDNA, спрятанной в ядре инфицированных гепатоцитов, которая является источником новых поколений вирусов. Это может объяснить, почему эффективность NUC является временной и сразу после прекращения лечения наступает рецидив, что заставляет пациентов находиться на терапии пожизненно. Кроме того, долгосрочная эффективность также является умеренной из-за появления резистентных мутантов ВГВ (более 24% после 1 года и приблизительно 66% после 4 лет лечения ламивудином по данным некоторых исследований, хотя новые NUCs вызывали появление резистентных к лекарству мутантов ВГВ гораздо реже). В настоящее время выделен ряд штаммов ВГВ, обладающих пониженной чувствительностью к противовирусным агентам, и секвенирование их генома позволило обнаружить участок с высокой частотой встречаемости мутаций по типу замены в полимеразном домене, в том числе мотиве YMDD (US 2008-0233557; Zoulim and Locarnini, 2009, Gastroenterology, 137:1593).

Кроме противовирусной терапии в настоящее время делаются попытки разработать дополнительные способы лечения, нацеленные на улучшение иммунного ответа хозяина, особенно реакций, опосредуемых цитотоксическими и хелперными Τ лимфоцитами. Было разработано несколько обнадеживающих стратегий вакцинации, нацеленных на поверхностные белки S, preS1 и/или preS2 вируса гепатита В (Zanetti et al., 2008, Vaccine 26: 6266; Mancini-Bourguine et al., 2006, Vaccine 24:4482), a также мультивалентных вакцин, одновременно направленных против множества антигенов ВГВ. Например, в доклинических исследованиях на моделях у мышей было показано, что иммунизация полиэпитопной ДНК-вакциной, кодирующей множество поверхностных, коровых и полимеразных эпитопов, запускает реакции, опосредованные цитотоксическими и хелперными Т-лимфоцитами (Depla et al., 2008, J. Virol. 82: 435). Подход, в при котором использовалась смесь плазмидной ДНК, кодирующей HBsAg, НВсАд и полимеразу ВГВ (WO2005/056051; WO2008/020656), продемонстрировал специфические клеточные и гуморальные ответы, направленные против ВГВ, на модели хронического гепатита В у трансгенных мышей (Chae Young Kim et al., 2008, Exp.Mol. Medicine 40: 669). В Южной Корее были начаты клинические исследования I фазы с участием носителей ВГВ, получающих ламивудин (Yang et al., 2006, Gene Ther. 13: 1110). Другой недавно разработанный подход включает применение векторной терапевтической вакцины, кодирующей НВс и полимеразу ВГВ вместе с иммуногенными доменами Hbs (WO2011/01565). Мыши, иммунизированные векторной вакциной на основе аденовируса, демонстрировали Т-клеточный ответ, направленный против всех экспрессируемых антигенов ВГВ, в частности, против полимеразы.

Можно ожидать, что ВГВ будет по-прежнему представлять собой серьезную угрозу для здоровья населения во всем мире на протяжении многих лет вследствие хронической и персистирующей природы инфекции, ее высокой распространенности, продолжающейся трансмиссии ВГВ и высокой частоте сопутствующих заболеваний. Таким образом, необходимо разработать более эффективные приемы для улучшения профилактики и лечения инфекций, вызванных ВГВ, или заболеваний или нарушений, обусловленных ВГВ. В частности, по-прежнему существует потребность в приемах, при которых опосредованные Т-клетками иммунные реакции, направленные против антигена(ов) ВГВ, особенно против коровых антигенов, сочетались бы с низкой потенциальной токсичностью. Такие приемы наиболее целесообразны при лечении субъектов с хронической инфекцией, вызванной ВГВ.

Данная техническая задача решена путем разработки воплощений, описанных в формуле изобретения.

Другие аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего ниже описания предпочтительных в настоящий момент воплощений изобретения. Эти воплощения приводятся в целях раскрытия изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение касается мутантного полипептида полимеразы, имеющего в своем составе по меньшей мере 500 аминокислотных остатков нативной полимеразы ВГВ, где указанный мутантный полипептид полимеразы имеет в своем составе домен полимеразы с внутренней делецией, которая подавляет функциональную активность полимеразы, и где указанная внутренняя делеция включает по меньшей мере мотив YMDD, присутствующий в полимеразном домене нативной полимеразы в природных условиях.

Настоящее изобретение также касается молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный мутантный полипептид полимеразы, вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты, или композиции, содержащей или кодирующей указанный мутантный полипептид полимеразы.

Настоящее изобретение также относится к применению этого мутантного полимеразного полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или композиции, предпочтительно в сочетании с дополнительными полипептидами (например, с одним или более полипептидом(ами) ВГВ) для лечения, предупреждения или подавления инфекции, вызванной ВГВ, или улучшения состояния, связанного с инфекцией, вызванной ВГВ.

Следующий аспект настоящего изобретения включает способ лечения, предупреждения или подавления инфекции, вызванной ВГВ, или улучшения состояния, связанного с инфекцией, вызванной ВГВ, у нуждающегося в этом субъекта, включающий предоставление или введение этого мутантного полипептида полимеразы, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или композиции, возможно в комбинации с дополнительными полипептидами (например, с одним или более полипептидом(ами) ВГВ) и/или со стандартным лечением.

Еще один аспект настоящего изобретения касается способа индукции иммунного ответа у субъекта, который в этом нуждается, включающего предоставление или введение этого мутантного полипептида полимеразы, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или композиции, возможно в комбинации с дополнительными полипептидами (например, с одним или более полипептидом(ами) ВГВ) и/или со стандартным лечением с целью индукции или стимуляции иммунного ответа у этого субъекта или для лечения инфекции, вызванной ВГВ, или улучшения состояния или симптома, связанного с инфекцией, вызванной ВГВ.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложен набор элементов, включающий некоторое количество контейнеров и инструкций для предоставления или введения субъекту этого мутантного полипептида полимеразы, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или композиции, возможно в комбинации с дополнительными полипептидами (например, с одним или более полипептидом(ами) ВГВ), в соответствии с композициями и способами, описанными в данном документе.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложен мутантный полипептид полимеразы, который имеет в своем составе мутантный домен полимеразы с внутренней делецией, которая подавляет функциональную активность полимеразы, где указанная внутренняя делеция включает по меньшей мере мотив YMDD, присутствующий в полимеразном домене нативной полимеразы в природных условиях. Такой мутантный полипептид полимеразы или кодирующий его вектор могут применяться в композициях и способах для лечения или предупреждения инфекции, вызванной ВГВ, или состояния, связанного с инфекцией, вызванной ВГВ, возможно в комбинации с другими полипептидами ВГВ и/или стандартным лечением. Данное изобретение предусматривает экспрессию и продукцию мутантного полипептида полимеразы в различных векторных системах благодаря подавлению связанной с ним ферментативной активности. Изобретение особенно подходит для применения у человека и может применяться для усиления стандартной терапии (например, стандартного лечения). В моделях на животных иммунизация вектором, кодирующим этот мутантный полипептид полимеразы, гибридизованный с иммуногенными доменами НВс и Hbs, индуцировала Т-клеточный ответ, специфический в отношении ВГВ, при этом было неожиданным, что наблюдавшийся сильный иммунный ответ был направлен как против НВс, так и против полимеразы.

В следующем ниже разделе приводится подробное объяснение значений некоторых терминов, употребляющихся в данном документе.

Определения

В данной заявке, когда употребляют единственное число, подразумевают "по меньшей мере один", "по меньшей мере первый", "один или более чем один" или "множество" упоминаемых соединений или стадий, если контекстом не продиктовано иное.

Термин "и/или" при использовании здесь включает значение "и", "или" и "все или любая другая комбинация элементов, объединенных указанным термином".

Термин "примерно" или "приблизительно", используемый здесь, означает в пределах 10%, предпочтительно в пределах 8% и более предпочтительно в пределах 5% данного значения или интервала. Термины "аминокислоты", "остатки" и "аминокислотные остатки" являются синонимами и охватывают как природные аминокислоты, так и аналоги аминокислот (например, не имеющие природного происхождения, синтетические и модифицированные аминокислоты, включая D или L оптические изомеры).

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" обозначают полимеры аминокислотных остатков, которые имеют в своем составе по меньшей мере девять или более аминокислот, соединенных пептидными связями. Полимер может быть линейным, разветвленным или циклическим и может иметь в своем составе аминокислоты природного происхождения и/или аналоги аминокислот и может быть прерван не аминокислотами. В качестве общего указания, если аминокислотный полимер состоит более чем из 50 аминокислотных остатков, на него предпочтительно ссылаются как на полипептид или белок, тогда как если он состоит из 50 аминокислот или менее, на него ссылаются как на "пептид".

В данном документе при обозначении продуктов, композиций и способов термин "содержащий" (и любая его форма, например "содержать" и "содержит"), "имеющий" (и любая его форма, например "иметь" и "имеет"), "включающий" (и любая его форма, например "включает" и "включать") или "имеющий в своем составе" (и любая его форма, например "имеет в своем составе" и "иметь в своем составе") являются неограничивающими и не исключают дополнительных, не указанных элементов или этапов способа. Так, полипептид "содержит" аминокислотную последовательность, когда аминокислотная последовательность является частью конечной аминокислотной последовательности полипептида. Такой полипептид может иметь до нескольких сотен дополнительных аминокислотных остатков. Под "состоящим по существу из" следует понимать исключающий другие компоненты или стадии какой-либо существенной значимости. Так, композиция, по существу состоящая из указанных компонентов, не будет исключать следовые примеси и фармацевтически приемлемые носители. Полипептид "по существу состоит из" аминокислотной последовательности, когда в такой аминокислотной последовательности может быть только несколько дополнительных аминокислотных остатков. "Состоящий из" означает исключение более чем следовых элементов других компонентов или стадий. Например, полипептид "состоит из" аминокислотной последовательности, когда полипептид не содержит каких-либо аминокислотных остатков помимо указанных в аминокислотной последовательности.

В данном документе "ВГВ" и "вирус гепатита В" используются взаимозаменяемо и обозначают любого представителя гепаднавирусов (см., например, Ganem and Schneider in Hepadnaviridae (2001) "The viruses and their replication", pp2923-2969, Knipe DM et al., eds. Fields Virology, 4th ed. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins or subsequent edition). Аминокислотные последовательности различных полипептидов ВГВ и кодирующие нуклеотидные последовательности можно найти в специальных базах данных (например, упоминавшихся выше) и в литературе (см., например, Valenzuela et al., 1980, The nucleotide sequence of the hepatitis В viral genome and the identification of the major viral genes (pp57-70) in "Animal Virus Genetics"; eds В. Fields, et al.; Academic Press Inc., New York and Vaudin et al., 1988, J. Gen. Virol. 69: 1383).

В данном документе термин "полимераза ВГВ" обозначает полипептид, у которого сохранено по меньшей мере 500 аминокислотных остатков, содержащихся в нативном белке полимеразы ВГВ. Желательно, эти по меньшей мере 500 аминокислотных остатков распределены по трем функциональным доменам и предпочтительно по четырем доменам, присутствующим в нативной полимеразе ВГВ в природных условиях. Этот термин охватывает нативные (т.е. природного происхождения) полипептиды полимеразы любого штамма, изолята или генотипа ВГВ, которые можно обнаружить, выделить, получить из такого источника ВГВ в природе, как, например, перечисленные выше в связи с термином "ВГВ", а также модифицированную полимеразу (т.е. мутантный полипептид полимеразы) и их фрагменты. В иллюстративных целях аминокислотные остатки полимеразы ВГВ, описанные в данном документе, пронумерованы как в полимеразе, состоящей из 832 аминокислот, у которой Туг в мотиве Tyr Met Asp Asp (YMDD) находится в положении 538. Специалист в данной области сможет адаптировать нумерацию аминокислотных остатков для других полимераз (например, состоящих из 843 или 845 аминокислот).

В данном документе термин "нативный" или "имеющий природное происхождение", использующиеся в отношении любой аминокислотной последовательности (например, пептида, полипептида, белка и т.д.) или нуклеотидной последовательности (например, гена, молекулы нуклеиновой кислоты, полинуклеотида и т.д.), обозначают аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая может быть обнаружена, выделена, получена из источника в природе, и которая отличается от искусственным образом модифицированной или измененной человеком в лаборатории (т.е. мутантной). Такие источники в природе включают биологические образцы (например, кровь, плазму, сыворотку, семенную жидкость, слюну, образцы тканей, биопсийный материал и т.д.), взятые у инфицированного или подвергшегося воздействию ВГВ организма, культивируемые клетки (такие как HepG2.2.15, HuH6-C15 (Sureau et al., 1986, Cell 47:37; Sells et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84(4): 1005); HuH7.TA61 or HuH7.TA62 (Sun et al., 2006, J Hepatol. 45(5):636), культуры тканей, а также рекомбинантный материал. Рекомбинантный материал включает изоляты ВГВ (например, имеющиеся в депозитарных учреждениях), геном ВГВ, библиотеки геномной РНК или библиотеки кДНК, векторы, содержащие геном ВГВ или его фрагмент(ы) или любые векторы предшествующего уровня техники, известные как включающие такие элементы, но не ограничиваются ими.

В иллюстративных целях "нативная полимераза ВГВ" означает полимеразу ВГВ, которая кодируется открытой рамкой считывания Ρ любого генотипа, штамма или изолята ВГВ, имеющего природное происхождение, известного из уровня техники (например, полипептида, имеющего в своем составе от 832 до 845 аминокислот, в зависимости от генотипа), или его фрагмента. Термин "нативный" также охватывает полипептид/пептиды полимеразы ВГВ, которые являются репрезентативными для определенного генотипа и, следовательно, включают аминокислотную последовательность, соответствующую или близкую консенсусной последовательности, которая обычно определяется при сопоставлении последователностей различных полимераз ВГВ конкретного генотипа.

Термин "мутант" в данном документе обозначает полипептид, имеющий одну или более мутаций по сравнению с нативным аналогом. В иллюстративных целях "мутантный полипептид полимеразы" обозначает полипептид полимеразы, происходящий из нативной полимеразы, которую человек искусственным образом модифицировал или изменил в лабораторных условиях, как описано в данном документе. Предусматриваются различные мутации, включая замену, вставку и/или делецию одного или более нуклеотидов/аминокислотных остатков, не встречающиеся в природе перестройки (например, гибридизацию с чужеродными полипептидами/пептидами), а также любые их комбинации. Если предполагается несколько мутаций, они могут затрагивать остатки, расположенные как последовательно, так и не последовательно. Мутации могут быть осуществлены с помощью ряда методов, известных специалистам, таких как сайт-специфический мутагенез (например, с помощью системы для проведения мутагенеза in vitro Sculptor™ производства Amersham, Les Ullis, France), мутагенеза с помощью ПЦР, перестройки ДНК и с помощью методов химического синтеза (например, приводящие к получению синтетической молекулы нуклеиновой кислоты). Согласно предпочтительным воплощениям, мутации, которые предусматриваются настоящим изобретением, охватывают делецию(и) и/или замену(ы) одного или более аминокислотных остатков (расположенных последовательно или нет), которые прямо или косвенно связаны по меньшей мере с одной ферментативной активностью, проявляемой нативной полимеразой ВГВ, для подавления указанной по меньшей мере одной ферментативной активности, например, активности полимеразы и/или активности РНКазы Н. В контексте изобретения полученный мутантный полипептид полимеразы в целом сохраняет высокую степень идентичности (например, по меньшей мере 80%) с соответствующей нативной полимеразой ВГВ в участках, не подвергавшихся мутации.

Термин "подавлять", который в данном документе используется в связи с указанной ферментативной активностью, или любое его производное, например, "подавляющий" означает "устранять" (полное отсутствие остаточной активности) или "существенно снижать" (остаточная активность менее 20% от активности, проявляемой нативной полимеразой).

Термин "идентичность" обозначает точное соответствие по аминокислотам или нуклеотидам между двумя полипептидами или нуклеотидными последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества позиций, идентичных для двух последовательностей, с учетом количества разрывов, которые нужно ввести для оптимального выравнивания, и длины каждого разрыва. В области техники существуют различные компьютерные программы и математические алгоритмы для определения процента идентичности между аминокислотными последовательностями, например, программа Blast, предоставляемая NCBI, или ALIGN в Атласе белковых последовательностей и структур (Dayhoffed., 1981, Suppl., 3 482-489). Доступ к программам для определения гомологии между нуклеотидными последовательностями также можно получить в специализированных базах данных (например, Genbank, the Wisconsin Sequence Analysis Package, программы BESTFIT, FASTA и GAP). В иллюстративных целях "идентичность по меньшей мере 80%" в данном документе означает 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

В данном документе термин "выделенный" обозначает белок, полипептид, пептид, полинуклеотид, плазмидный вектор, вирусный вектор или клетку-хозяина, которая извлечена из своего естественного окружения (т.е. отделена от по меньшей мере одного другого компонента, с которым она связана естественным образом).

Последовательность ВГВ

Ряд последовательностей ВГВ подходят для применения в воплощениях, описанных в данном документе, включая те последовательности, которые известны специалистам в данной области, включая последовательности ВГВ, описанные в Genbank и PubMed, но не ограничиваясь ими. В иллюстративных целях, многочисленные филогенетические исследования, позволили выделить 8 основных генотипов вируса гепатита В (от А до Н), для которых, несмотря на высокую степень консервативности последовательностей, характерно различное географическое распределение и исход заболевания. Было выделено 9 различных подтипов ВГВ (ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+ and adqr-) в зависимости от серотипов HBsAg (см. обзор Mamum-AI Mahtab et al., 2008, Hepatobiliary Pancrease Dis Int 5: 457; Schaeffer, 2007, World Gastroenterol. 7: 14). Каждый генотип и серотип охватывает различные штаммы и изоляты ВГВ. Изолят соответствует определенному вирусу, выделенному из конкретного источника ВГВ (например, образца пациента или другого биологического источника ВГВ), тогда как штамм охватывает различные изоляты с близкими геномными последовательностями.

Приведенный в качестве примера ВГВ с генотипом А включает изолят НВ-JI444AF и штамм HB-JI444A (регистрационный номер АР007263), но не ограничивается ими. Приведенный в качестве примера ВГВ с генотипом В включает клон pJDW233 (регистрационный номер D00329), изолят HBV/14611 (регистрационный номер AF121243), HBV-B1 (регистрационный номер GenBank AF282917.1), штамм HBVWhutj-37 (регистрационный номер GenBank AY2933309.1), китайский штамм HBV GDH1 (регистрационный номер GenBank AY766463.1) и изолят HBV 57-1 подтипа adw (регистрационный номер GenBank AY518556.1), но не ограничивается ими. Приведенный в качестве примера ВГВ с генотипом С включает изолят AH-1-ON980424 (регистрационный номер АВ113879), штамм НСС-3-ТТ (регистрационный номер АВ113877), изолят HBV SWT3.3 (регистрационный номер GenBank EU916241.1), изолят HBV Н85 (регистрационный номер GenBank AY306136.1), штамм HBV С1248 (регистрационный номер GenBank DQ975272.1), изолят HBV CHN-H155 (регистрационный номер GenBank DQ478901.1) и изолят HBV GZ28-1 (регистрационный номер GenBank EF688062), но не ограничивается ими. Приведенный в качестве примера ВГВ с генотипом D включает изоляты КАМСНАТКА27 (регистрационный номер АВ188243), ALTAY136 (регистрационный номер АВ188245) и Y07587 (регистрационный номер GenBank Y07587 и Stoll-Becker et al., 1997, J. Virol. 71: 5399), а также изолят ВГВ, описанный под регистрационным номером АВ267090, но не ограничивается ими. Приведенный в качестве примера ВГВ с генотипом Ε включает изолят HB-JI411F и штамм НВ-JI411 (регистрационный номер АР007262). Приведенный в качестве примера ВГВ с генотипом F включает изоляты HBV-BL597 (регистрационный номер АВ214516) и HBV-BL592 (регистрационный номер АВ166850), но не ограничивается ими. Приведенный в качестве примера ВГВ с генотипом G включает изолят HB-JI444GF и штамм HB-JI444G (регистрационный номер АР007264), но не ограничивается ими. Приведенный в качестве примера ВГВ с генотипом H включает изолят HBV ST0404 (регистрационный номер АВ298362) и изолят HB-JI260F и штамм HB-JI260 (регистрационный номер АР007261), но не ограничивается ими.

Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается данными последовательностями ВГВ, приведенными в качестве примера. Более того, нуклеотидные и аминокислотные последовательности любых возможных полипептидов/пептидов ВГВ, согласно настоящему изобретению, могут варьировать у различных изолятов и генотипов ВГВ, и такие естественные генетические вариации находятся в рамках изобретения. Более того, полипептиды/пептиды ВГВ по данному изобретению могут представлять определенный генотип и, таким образом, включать аминокислотную последовательность, соответствующую или близкую консенсусной последовательности.

Кроме того, каждый из полипептидов/пептидов ВГВ может независимо происходить из любого генотипа, штамма или изолята ВГВ, известного в настоящее время, например, любого из указанных выше в связи с термином "ВГВ". Такая конфигурация позволяет обеспечить защиту против более широкого спектра генотипов ВГВ или адаптацию к определенному географическому региону, за счет использования генотипа(ов) ВГВ, который(е) являе(ю)тся эндемичным(и) для данного региона или для определенной популяции пациентов. При этом, генотипы А и С больше всего распространены в США, генотипы А и D в странах Западной Европы, а генотип D в странах Средиземноморья, тогда как генотипы В и С чаще всего встречаются в Китае. Ограниченные данные по Индии позволяют предположить, что генотипы А и D являются преобладающими в Индии. Специалист в данной области может выбрать соответствующие генотипы, серотипы, штаммы и/или изоляты ВГВ в зависимости от популяции, которая будет получать лечение, и/или географического региона.

Согласно предпочтительному воплощению, полипептиды/пептиды ВГВ, применяющиеся в данном изобретении, происходят из вируса с генотипом D, наиболее предпочтительным является изолят ВГВ Y07587.

Мутантная полимераза ВГВ

Мутантный полипептид полимеразы по изобретению включает мутированный домен полимеразы с внутренней делецией, которая подавляет функциональную активность полимеразы и включает по меньшей мере мотив YMDD, который присутствует в полимеразном домене нативной полимеразы в природных условиях. Подавление полимеразной активности, проявляющееся у полученного мутантного полипептида полимеразы, можно оценить с помощью методов, хорошо известных в области техники (например, определение эндогенной полимеразы, описанное Radziwill et al., 1990, J Virol. 64:613).

Общая аминокислотная последовательность, охватывающая полимеразный домен нативных полимераз ВГВ генотипов В, С и D, приведена в SEQ ID NO: 1, где остаток Хаа в положении 7 представляет собой Thr (Τ) или Ala (А); остаток Хаа в положении 13 представляет собой Asn (Ν), Arg (R) или His (H); остаток Хаа в положении 16 представляет собой Ile (I) или Thr (Т); остаток Хаа в положении 38 представляет собой Thr (Τ) или Ala (А); остаток Хаа в положении 53 представляет собой Ser (S) или Asn (N); остаток Хаа в положении 54 представляет собой Thr (Τ) или Туг (Y); остаток Хаа в положении 55 представляет собой His (Η) или Arg (R); остаток Хаа в положении 91 представляет собой Ile (I) или Leu (L); остаток Хаа в положении 109 представляет собой Pro (Ρ) или Ser (S); остаток Хаа в положении 118 представляет собой Thr (Τ) или Asn (N); остаток Хаа в положении 121 представляет собой Asn (Ν) или Ile (I); остаток Хаа в положении 122 представляет собой Ile (I) или Phe (F); остаток Хаа в положении 124 представляет собой Туг (Y) или Asn (N); остаток Хаа в положении 127 представляет собой Gly (G) или Arg (R); остаток Хаа в положении 131 представляет собой Asp (D) или Asn (N); остаток Хаа в положении 134 представляет собой Asp (D) или Asn (N); остаток Хаа в положении 145 представляет собой Leu (L) или Met (M); остаток Хаа в положении 149 представляет собой Lys (К) или Gin (Q); остаток Хаа в положении 151 представляет собой Phe (F) или Tyr (Y); остаток Хаа в положении 221 представляет собой Phe (F) или Tyr (Y); остаток Хаа в положении 222 представляет собой Thr (Τ) или Ala (А); остаток Хаа в положении 223 представляет собой Ser (S) или Ala (А); остаток Хаа в положении 224 представляет собой Ile (I) или Val (V); остаток Хаа в положении 238 представляет собой Asn (Ν) или His (H); остаток Хаа в положении 248 представляет собой Asn (Ν) или His (H); остаток Хаа в положении 256 представляет собой Ser (S) или Cys (С); остаток Хаа в положении 257 представляет собой Trp (W) или Tyr (Y); остаток Хаа в положении 259 представляет собой Thr (Τ) или Ser (S); остаток Хаа в положении 263 представляет собой Glu (Ε) или Asp (D); остаток Хаа в положении 266 представляет собой Val (V) или Не (I); остаток Хаа в положении 267 представляет собой Leu (L) или Gin (Q); остаток Хаа в положении 271 представляет собой Gin (Q), Met (M) или Glu (E); остаток Хаа в положении 317 представляет собой Ser (S) или Ala (А); и остаток Хаа в положении 332 представляет собой Cys (Τ) или Ser (S).

В соответствии с настоящим изобретением, в мутированном полимеразном домене в составе мутантного полипептида полимеразы по изобретению отсутствует по меньшей мере мотив YMDD, находящийся в положениях с 203 по 206 этого общего полимеразного домена с последовательностью SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также охватывает любые другие внутренние делеции по меньшей мере 4 аминокислотных остатков и самое большее 30 ами