Ген фосфатазы фосфатидной кислоты

Ген фосфатазы фосфатидной кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая заявка относится к новому гену фосфатазы фосфатидной кислоты и его применению.

Уровень техники

Известно, что жирные кислоты, содержащие две или более ненасыщенные связи, в совокупности, именуемые полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), включают арахидоновую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую кислоту. Некоторые из полиненасыщенных жирных кислот не могут быть синтезированы в организме животных, и такие полиненасыщенные жирные кислоты должны поступать в организм с пищей, как незаменимые жирные кислоты. Полиненасыщенные жирные кислоты широко распространены. Например, арахидоновая кислота выделена из липидов, экстрагированных из надпочечников или печени животных. Однако, полиненасыщенные жирные кислоты содержатся в органах животных в небольших количествах, и экстрагирование и выделение полиненасыщенных жирных кислот только из органов животных является недостаточным для получения больших количеств полиненасыщенных жирных кислот. Поэтому были разработаны микробиологические методы для получения полиненасыщенных жирных кислот путем культивирования различных микроорганизмов. В частности, известно, что микроорганизмы рода Mortierella продуцируют липиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты, такие как арахидоновая кислота.

Также были предприняты другие попытки получения полиненасыщенных жирных кислот в растениях. Известно, что полиненасыщенные жирные кислоты образуют запасные липиды, такие как триацилглицерин (также называемый триглицерид или ТГ), который накапливается в клетках микроорганизмов или семенах растений.

В качестве запасного липида триацилглицерин синтезируется в организме следующим образом. Ацильная группа вводится в глицерин-3-фосфат при помощи глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы с образованием лизофосфатидной кислоты, в которую ацильная группа вводится при помощи лизофосфатацилтрансферазы с образованием фосфатидной кислоты. Фосфатидная кислота затем дефосфорилируется фосфатазой фосфатидной кислоты с образованием диацилглицерина. Ацильная группа вводится в диацилглицерин при помощи диацилглицерин-ацилтрансферазы с образованием триацилглицерина.

В этом метаболическом пути фосфатидная кислота (далее именуемая также «ФК» или 1,2-диацил-sn-глицерин-3-фосфат) является предшественником триацилглицерина, а также биосинтетическим предшественником диацилглицерофосфолипида. В таких клетках как дрожжи, фосфатидная кислота-цитидилтрансфераза воздействует на ФК и цитидин-5'-трифосфат (ЦТФ), синтезируя ЦТФ диацилглицерин (ЦТФ-ДГ), который используется для биосинтеза различных фосфолипидов.

Как описано выше, известно, что дефосфорилирование ФК для биосинтеза диацилглицерина (далее именуемого также «ДГ») катализируется фосфатазой фосфатидной кислоты (К.Ф, 3.1.3.4, далее именуемая также «ФФК»). Известно, что ФФК присутствует во всех организмах от бактерий до позвоночных.

Известно, что дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), которые относятся к низшим грибам, имеют два типа ФФК (Непатентные документы 1, 2 и 7). Одним из них является Mg²⁺-зависимая ФФК (ФФК1), а другим - Mg²⁺-независимая ФФК (ФФК2). Ген PAH1 известен как ген, кодирующий ФФК1 (Непатентные документы 3-5). Мутант pah1Δ также обладает ФФК1 активностью, что позволяет предположить существование других генов, проявляющих ФФК1 активность. У мутанта pah1Δ ядерная мембрана и мембрана ЭПС ненормально увеличены, и чрезмерно повышена экспрессия генов, играющих ключевую роль в биосинтезе фосфолипидов (Непатентный документ 6).

С другой стороны, известны гены DPP1 и LPP1, кодирующие ФФК2, которые обладают наибольшей ФФК2 активностью в дрожжах. Ферменты, кодируемые этими генами, обладают широкой субстратной специфичностью, и известно, что они дефосфорилируют, например, диацилглицеринпирофосфат (ДГПФ), лизофосфатидную кислоту, фосфаты сфингооснований и фосфаты изопреноидов.

Известно, что липид-продуцирующий грибок Mortierella alpina имеет два типа генов, т.е. MaPAH1.1 и MaPAH1.2, которые являются гомологами Mg²⁺-зависимой ФФК1 (Патентный документ 1), и ген MaPAP1, который является гомологом Mg²⁺-независимой ФФК2 (Патентный документ 2).

Список библиографических ссылок

Патентные документы

Патентный документ 1: Международная публикация No. WO 2011/081135

Патентный документ 2: Международная публикация No. WO 2009/008466

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Biochem. Biophys. Acta, 1348, 45-55, 1997

Непатентный документ 2: Trends Biochem. Sci., 31(12), 694-699, 2006

Непатентный документ 3: EMBO J., 24, 1931-1941, 2005

Непатентный документ 4: J. Biol. Chem., 281(14), 9210-9218, 2006

Непатентный документ 5: J. Biol. Chem., 281(45), 34537-34548, 2006

Непатентный документ 6: J. Biol. Chem., 282(51), 37026-37035, 2007

Непатентный документ 7: J. Biol. Chem., 284(5), 2593-2597, 2009

Сущность изобретения

Техническая проблема

Большинство генов ФФК, о которых сообщалось ранее, не было исследовано относительно их способности изменять составное соотношение жирных кислот в композициях жирных кислот, продуцируемых клетками-хозяевами, в которых экспрессируются введенные гены ФФК. Существует потребность в ведении в практику нового гена, способного продуцировать жир с необходимым составным соотношением жирных кислот или повышать содержание необходимой жирной кислоты, при введении в клетку-хозяин или экспрессии в ней.

Целью настоящего изобретения является новый ген фосфатазы фосфатидной кислоты, кодируемый им белок и способы его применения.

Решение проблемы

Для решения вышеупомянутой проблемы авторами настоящего изобретения были проведены тщательные исследования. Был проанализирован геном липид-продуцирующего грибка Mortierella alpina с целью идентифицировать последовательности, обладающие гомологией с известными генами Mg²⁺-независимой фосфатазы фосфатидной кислоты (ФФК2). При помощи скрининга библиотеки кДНК или ПЦР была клонирована кДНК, чтобы получить полную открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую ФФК. Этот ген был введен в высоко пролиферативные клетки-хозяева (например, клетки дрожжей), для подтверждения того, что белок, кодируемый клонированной кДНК, обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты. Таким образом, ген новой фосфатазы фосфатидной кислоты (ФФК) был успешно клонирован, что привело к осуществлению настоящего изобретения. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение может быть следующим.

(1) Нуклеиновая кислота по любому из приведенных ниже пунктов (a)-(g):

(a) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и который обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(b) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и которая кодирует белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(c) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая имеет идентичность 70% или более нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и которая кодирует белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(d) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность 70% или более аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и который обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(e) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и которая кодирует белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(f) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4, и которая включает экзон, кодирующий белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты; и

(g) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая имеет идентичность 70% или более нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4, и которая включает экзон, кодирующий белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

(2) Нуклеиновая кислота по любому из приведенных ниже пунктов (a)-(g):

(a) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением от 1 до 110 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и который обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(b) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, в условиях 2x SSC буфер при температуре 50°C, и которая кодирует белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(c) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая имеет идентичность 90% или более нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, и которая кодирует белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(d) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность 90% или более аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и который обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(e) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, в условиях 2x SSC буфер при температуре 50°C, и которая кодирует белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(f) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4, в условиях 2x SSC буфер при температуре 50°C, и которая включает экзон, кодирующий белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты; и

(g) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая имеет идентичность 90% или более нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4, и которая включает экзон, кодирующий белок, обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

(3) Нуклеиновая кислота по любому из приведенных ниже пунктов (a)-(d):

(a) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или ее фрагмент;

(b) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, или ее фрагмент;

(c) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, или ее фрагмент; и

(d) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, или ее фрагмент.

(4) Нуклеиновая кислота по пункту (1) или (2), отличающаяся тем, что активность фосфатазы фосфатидной кислоты имеет более высокую субстратную специфичность к фосфатидной кислоте, содержащей C₁₈-ацильную группу, чем к фосфатидной кислоте, содержащей C₁₇-ацильную группу.

(5) Белок по любому из приведенных ниже пунктов (a) или (b):

(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты, и

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность 70% или более аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

(6) Белок по любому из приведенных ниже пунктов (a) или (b):

(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность с делецией, заменой или добавлением от 1 до 110 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты; и

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность 90% или более аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

(7) Белок по пункту (5) или (6), отличающийся тем, что активность фосфатазы фосфатидной кислоты имеет более высокую субстратную специфичность к фосфатидной кислоте, содержащей C₁₈-ацильную группу, чем к фосфатидной кислоте, содержащей C₁₇-ацильную группу.

(8) Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2.

(9) Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пунктов (1)-(4).

(10) Трансформант, трансформированный рекомбинантным вектором по пункту (9).

Полезный эффект изобретения

Настоящее изобретение относится к новому гену ФФК, кодируемому им белку и способам его применения. Ожидается, что ФФК настоящего изобретения будет продуцировать жирные кислоты в клетке-хозяине, эти жирные кислоты будут иметь составное соотношение, отличающееся от составного соотношения жирных кислот, продуцируемых в клетке-хозяине, в которую не вводилась ФФК. Это может обеспечить получение липидов, обладающих желаемыми характеристиками и действиями, и в связи с этим пригодных для применения, например, в пищевых продуктах, косметике, фармацевтических препаратах и мыле.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1-1 показана геномная последовательность и кодирующая нуклеотидная последовательность MaPAP2.2.

Фигура 1-2 является продолжением Фигуры 1-1.

На фигуре 2 показано выравнивание аминокислотной последовательности MaPAP2.2 и аминокислотных последовательностей предполагаемого белка, полученного из Laccaria bicolor, и ScDPP1 (YDR284C: регистрационный номер AAS56070), полученного из дрожжей.

На фигуре 3 показано выравнивание аминокислотных последовательностей MaPAP2.2 и MaPAP1, известного как Mg²⁺-независимая ФФК (ФФК2), полученная из Mortierella alpina (WO2009/008466). Три дважды подчеркнутых сегмента представляют собой консервативные области среди представителей семейства ферментов Mg²⁺-независимые фосфатазы фосфатидной кислоты типа 2 (ФФК2) (домены 1, 2 и 3, считая от N-конца), и знаком «*» обозначены аминокислотные остатки, существенные для активности ФФК.

На фигуре 4 показаны диаграммы, иллюстрирующие результаты изучения зависимости активности MaPAP2.2, которая превращает 18:2-ФК в 18:2-ДГ (n = 1), от ионов Mg²⁺. На диаграмме A показаны результаты добавления Mg²⁺. На диаграмме B показаны результаты добавления ЭДТА (без Mg²⁺). По вертикальной оси показаны количества 18:2-ДГ (обнаруженные во фракциях ДГ) по отношению к белку (мкг/мг белка) в неочищенных ферментных растворах.

На фигуре 5 показаны диаграммы, иллюстрирующие результаты изучения активности MaPAP2.2 (A) и MaPAP1 (B), которая превращает 18:2-ФК в 18:2-ДГ (n=3), в реакционном растворе, не содержащем ионы Mg²⁺. По вертикальной оси показаны количества 18:2-ДГ (обнаруженные во фракциях ДГ) по отношению к белку (мкг/мг белка) в неочищенных ферментных растворах.

На фигуре 6A показаны диаграммы, иллюстрирующие результаты изучения количества 18:1-ДГ без добавления в качестве субстрата фосфатидной кислоты, в реакционных растворах, содержащих MaPAP2.2, и контролях (n=3). На Фигуре 6B показаны диаграммы, иллюстрирующие результаты изучения количества 18:1-ДГ при добавлении 18:1-ФК в качестве субстрата, в реакционных растворах, содержащих MaPAP2.2, и контролях (n=3). По каждой вертикальной оси показаны количества 18:1-ДГ (обнаруженные во фракциях ДГ) по отношению к белку (мкг/мг белка) в неочищенном ферментном растворе.

На фигуре 7 показаны диаграммы, иллюстрирующие результаты изучения количества 17:0-ДГ при добавлении 17:0-ФК в качестве субстрата, в реакционных растворах, содержащих MaPAP2.2, и контролях (n=3). По вертикальной оси показаны количества 17:0-ДГ (обнаруженные во фракциях ДГ) по отношению к белку (мкг/мг белка) в неочищенных ферментных растворах.

Описание вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к новому гену фосфатазы фосфатидной кислоты, полученному из рода Mortierella, где эта фосфатаза фосфатидной кислоты дефосфорилирует фосфатидную кислоту с образованием диацилглицерина, кодируемому им белку и способам его применения.

Фосфатаза фосфатидной кислоты представляет собой фермент, который катализирует реакцию образования диацилглицерина путем дефосфорилирования фосфатидной кислоты. Субстрат ФФК настоящего изобретения, как правило, представляет собой фосфатидную кислоту, но не ограничивается ею.

Нуклеиновая кислота, кодирующая фосфатазу фосфатидной кислоты

Фосфатаза фосфатидной кислоты (ФФК) настоящего изобретения включает MaPAP2.2 и ее мутанты. Соответствие между кДНК, кодирующей последовательностью, ОРС, которые представляют собой нуклеиновые кислоты, кодирующие MaPAP2.2, и аминокислотной последовательностью MaPAP2.2 обобщено в Таблице 1.

Таблица 1
	MaPAP2.2
SEQ ID NO:	Соответствующая область в SEQ ID NO: 5
кДНК	SEQ ID NO: 5	*****
Кодирующая последовательность	SEQ ID NO: 3	Положения с 75 по 1166
ОРС	SEQ ID NO: 1	Положения с 75 по 1163

Аминокислотная последовательность

SEQ ID NO: 2

*****

А именно, последовательности, относящиеся к MaPAP2.2, включают SEQ ID NO: 2, соответствующую аминокислотной последовательности MaPAP2.2; SEQ ID NO: 1, соответствующую последовательности области ОРС MaPAP2.2; SEQ ID NO: 3, соответствующую последовательности области кодирующей последовательности MaPAP2.2; и SEQ ID NO: 5, соответствующую последовательности кДНК MaPAP2.2. Среди этих последовательностей SEQ ID NO: 1, соответствует нуклеотидам 75-1163 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 5; и SEQ ID NO: 3, соответствует нуклеотидам 75-1166 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 4 соответствует геномной нуклеотидной последовательности, кодирующей MaPAP2.2. Геномная последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 4, состоит из трех экзонов и двух интронов, и области экзонов соответствуют нуклеотидам 1-207, 445-582 и 889-1632 в SEQ ID NO: 4.

Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения включают одноцепочечные и двухцепочечные ДНК и комплементарные им РНК, которые могут быть либо природного происхождения, либо искусственно синтезированными. Примеры ДНК включают без ограничений геномные ДНК, кДНК, соответствующие геномным ДНК химически синтезированные ДНК, ПЦР-амплифицированные ДНК, их комбинации и ДНК/РНК гибриды.

Предпочтительные варианты осуществления для нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают нуклеиновые кислоты, содержащие (a) нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и (c) нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5.

Для получения этих нуклеотидных последовательностей данные о нуклеотидных последовательностях из баз данных маркерных экспрессируемых последовательностей (EST) или геномных ДНК организмов, обладающих активностью ФФК, могут быть использованы для поиска нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий гомологией с известными белками, обладающими активностью ФФК. Предпочтительными организмами, обладающими активностью ФФК, являются липид-продуцирующие грибки, включая без ограничения M. alpina.

Для анализа EST сначала получают библиотеку кДНК. Библиотека кДНК может быть получена методами, описанными в «Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed.» (Cold Spring Harbor Press (2001)). В другом варианте может быть использован коммерчески доступный набор реагентов для получения библиотеки кДНК. Библиотека кДНК, пригодная для настоящего изобретения, может быть получена, например, по следующей методике. А именно, подходящим штаммом липид-продуцирующего грибка M. alpina инокулирут соответствующую питательную среду и прекультивируют в течение соответствующего периода. В число условий культивирования, подходящих для этого прекультивирования, входят, например, состав среды, включающий 1,8% глюкозы и 1% дрожжевого экстракта, значение pH 6,0, период культивирования от 3 до 4 суток и температуру культивирования 28°C. Продукт, полученный в результате прекультивирования, затем подвергают основному культивированию в соответствующих условиях. Состав среды, подходящей для основного культивирования, включает в себя, 1,8% глюкозы, 1% соевого порошка, 0,1% оливкового масла, 0,01% Адеканола, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% Na₂SO₄, 0,05% CaCl₂·2H₂O и 0,05% MgCl₂·6H₂O и имеет значение pH 6,0. Условия культивирования, подходящие для основного культивирования, включают в себя, например, аэрацию и перемешивание культуры при 300 об./мин, аэрации 1 vvm и температуре 26°C в течение 8 суток. Необходимое количество глюкозы может быть добавлено в процессе культивирования. Во время основного культивирования в определенный момент времени из культуры отбирают образцы, из которых выделяют клетки для получения тотальной РНК. Тотальная РНК может быть получена любым известным способом, таким как методика с использованием гуанидин гидрохлорида и CsCl. Поли(A)+РНК может быть выделена из полученной тотальной РНК при помощи коммерчески доступного набора реагентов, и библиотека кДНК может быть сконструирована с использованием коммерчески доступного набора реагентов. Нуклеотидную последовательность любого клона из полученной библиотеки кДНК определяют с использованием праймеров, которые сконструированы для вектора и позволяют определить нуклеотидную последовательность вставки. В результате могут быть получены маркерные экспрессируемые последовательности. Например, получение библиотеки кДНК с использованием набора реагентов ZAP cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (STRATAGENE) позволяет проводить прямое клонирование.

При анализе геномной ДНК культивируют клетки организма, обладающего активностью ФФК, из которых затем получают геномную ДНК. Определяют нуклеотидную последовательность полученной геномной ДНК и объединяют определенную нуклеотидную последовательность. В полученной в конечном итоге последовательности суперконтига ищут последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, обладающую высокой гомологией аминокислотной последовательности известного белка, обладающего активностью ФФК. Из последовательностей суперконтига, которые были идентифицированы как кодирующие такую аминокислотную последовательность, получают праймеры. Затем проводят ПЦР, используя библиотеку кДНК в качестве матрицы, и полученные фрагменты ДНК встраивают в плазмиду для клонирования. Клонированную плазмиду в качестве матрицы и вышеупомянутые праймеры используют для ПЦР для получения зонда, который затем используют для скрининга библиотеки кДНК.

Поиск гомологии аминокислотных последовательностей MaPAP2.2 проводили среди аминокислотных последовательностей, зарегистрированных в GenBank, с помощью программы BLASTp. Полученная аминокислотная последовательность имела совпадение с самым высоким баллом с предсказанным белком Laccaria bicolor (SEQ ID NO: 10, регистрационный номер: XP_001878243), имея идентичность по нуклеотидной последовательности 36,7%. Идентичность между аминокислотной последовательностью MaPAP1, которая является известной ФФК2 (Mg²⁺-независимая ФФК), полученной из Mortierella alpina, и аминокислотной последовательностью MaPAP2.2 составила 20,5%.

Настоящее изобретение также включает нуклеиновые кислоты, функционально эквивалентные нуклеиновой кислоте, включающей вышеупомянутую нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2. Предполагается, что термин «функционально эквивалентный» означает, что белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, и белок, состоящий из аминокислотной последовательности настоящего изобретения, обладают активностью фосфатазы фосфатидной кислоты (ФФК). Используемый здесь термин «активность ФФК» относится к активности катализирования реакции дефосфорилирования фосфатидной кислоты с образованием диацилглицерина. Активность ФФК может обладать, но не ограничивается, более высокой субстратной специфичностью по отношению к фосфатидной кислоте, содержащей C₁₈-ацильную группу, чем к фосфатидной кислоте, содержащей C₁₇-ацильную группу. Кроме того, активность ФФК может быть, но не ограничивается, независимой от ионов Mg²⁺.

Такие нуклеиновые кислоты, которые являются мутантами нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и которые являются функционально эквивалентными этих нуклеиновых кислот, включают нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, указанные ниже в любом из пунктов (a)-(g).

(a) Нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и который обладает активностью ФФК

Примеры нуклеотидной последовательности, содержащейся в нуклеиновой кислоте настоящего изобретения, включают нуклеотидные последовательности, кодирующие белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и который обладает активностью ФФК.

В частности, нуклеотидная последовательность, содержащаяся в нуклеиновой кислоте настоящего изобретения, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью ФФК, и состоящий из:

(i) аминокислотной последовательности с делецией одной или более (предпочтительно, одной или нескольких (например, от 1 до 110, от 1 до 100, от 1 до 75, от 1 до 50, от 1 до 30, от 1 до 25, от 1 до 20 или от 1 до 15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2;

(ii) аминокислотной последовательности, имеющей замену одной или более (предпочтительно, одной или нескольких (например, от 1 до 110, от 1 до 100, от 1 до 75, от 1 до 50, от 1 до 30, от 1 до 25, от 1 до 20 или от 1 до 15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) аминокислот другими аминокислотами в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2;

(iii) аминокислотной последовательности, имеющей добавление одной или более (предпочтительно, одной или нескольких (например, от 1 до 110, от 1 до 100, от 1 до 75, от 1 до 50, от 1 до 30, от 1 до 25, от 1 до 20 или от 1 до 15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) других аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2; или

(iv) аминокислотную последовательность в любой комбинации (i)-(iii).

Из них замена является предпочтительно консервативной заменой, что означает замещение конкретного аминокислотного остатка другим остатком, обладающим аналогичными физико-химическими свойствами, и может быть любой заменой, которая не оказывает существенного влияния на структурные свойства исходной последовательности. Например, любая замена является допустимой, при условии, что замененные аминокислоты не нарушают спираль исходной последовательности или не нарушают любую другую вторичную структуру, характеризующую исходную последовательность.

Консервативную замену, как правило, вводят путем синтеза в биологической системе или химического синтеза пептидов, предпочтительно, путем химического синтеза пептидов. В этом случае, заместители могут включать не встречающийся в природе аминокислотный остаток, пептидомиметик или перевернутую или инвертированную форму, где незамещенная область является перевернутой или инвертированной по аминокислотной последовательности.

Неограниченные примеры взаимозаменяемых аминокислотных остатков систематизированы и перечислены ниже:

Группа A: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норвалин, аланин, 2-аминобутановая кислота, метионин, O-метилсерин, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин и циклогексилаланин;

Группа B: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, изоаспарагиновая кислота, изоглутаминовая кислота, 2-аминоадипиновая кислота и 2-аминосубериновая кислота;

Группа C: аспарагин и глутамин;

Группа D: лизин, аргинин, орнитин, 2,4-диаминобутановая кислота и 2,3-диаминопропионовая кислота;

Группа E: пролин, 3-гидроксипролин и 4-гидроксипролин;

Группа F: серин, треонин и гомосерин; и

Группа G: фенилаланин и тирозин.

В случае неконсервативной замены, член одной из этих групп может быть заменен членом другой группы. В этом случае для поддержания биологических функций белка настоящего изобретения, предпочтительно учитываются гидропатические индексы аминокислот (индексы гидропатичности аминокислот) (Kyte, et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982)).

В случае неконсервативной замены, замена аминокислоты может быть выполнена на основе гидрофильности.

В тексте всего описания и на чертежах, нуклеотиды, аминокислоты и аббревиатуры обозначаются в соответствии с номенклатурой, утвержденной Комиссией по Биохимической Номенклатуре ИЮПАК-ИЮБ, или с использованием названий, традиционно используемых в данной области техники, например, как описано в Immunology: A Synthesis (second edition, edited by E.S. Golub and D.R. Gren, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts (1991)). Кроме того, подразумевается, что аминокислоты, которые могут иметь оптические изомеры, представлены своими L-изомерами, если не указано иное.

Стереоизомеры, такие как D-аминокислоты вышеупомянутых аминокислот, не встречающиеся в природе аминокислоты, такие как α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетипичные аминокислоты также могут быть мономерами, образующими белки настоящего изобретения.

Необходимо отметить, что в используемой в настоящем изобретении номенклатуре белка направление влево является аминоконцевым направлением, а направление вправо является карбоксиконцевым направлением, в соответствии со стандартной практикой и сложившимися правилами в данной области техники.

Аналогично, как правило, если не указано иное, то левый конец одноцепочечной полинуклеотидной последовательности является 5’-концом, а направление влево двухцепочечной полинуклеотидной последовательности обозначается как 5’-направление.

Специалисты в данной области техники могут теоретически спланировать и получить соответствующие мутанты описанных здесь белков при помощи способов, известных из уровня техники. Так, например, они могут идентифицировать подходящие области в белковой молекуле, структура которых может быть изменена без ухудшения биологической активности белка настоящего изобретения, полагая, что выбранные области являются менее важными для биологической активности белка. Специалисты в данной области техники также могут идентифицировать остатки и области в молекулах, которые являются консервативными среди аналогичных белков, и также могут ввести консервативные аминокислотные замены в области, которые могут быть важными для биологической активности или структуры белка настоящего изобретения, без ухудшения биологической активности и без неблагоприятного воздействия на полипептидную структуру белка.

В частности, аминокислотная последовательность MaPAP2.2 (SEQ ID NO: 2) содержит три области, дважды подчеркнутые на Фигуре 3, которые являются консервативными среди представителей семейства ферментов Mg²⁺-независимые фосфатазы фосфатидной кислоты типа 2 (ФФК2), они соответствуют остаткам 115-123, 172-175 и 229-233. Известно, что в этих трех консервативных областях в семействе ферментов ФФК2 аргинин в домене 1 и гистидин в доменах 2 и 3 являются аминокислотами, существенными для активности, и эти аминокислоты также являются консервативными у MaPAP2.2, т.е. аргинин в положении остатка 122 и гистидин в положении остатков 175 и 229 в SEQ ID NO: 2. Вышеуказанные консервативные области являются существенными для семейства ферментов ФФК2, и они также являются важными для ФФК настоящего изобретения. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением мутанты могут содержать вышеуказанные консервативные области.

Специалисты в данной области техники могут провести так называемое структурно-функциональное исследование, которое выявляет остатки пептида, которые являются важными для биологической активности или структуры белка настоящего изобретения, и пептида, который является аналогичным пептиду этого белка, сравнивая аминокислотные остатки этих двух пептидов, и таким образом предсказывая, какой остаток в белке, аналогичном белку настоящего изобретения, является аминокислотным остатком, соответствующим аминокислотному остатку, важному для биологической активности или структуры. Они также могут выбрать мутант, который сохраняет биологическую активность белка настоящего изобретения, выбирая аминокислотный заместитель, химически аналогичный предсказанному аминокислотному остатку. Также специалисты в данной области техники могут проанализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность этого белкового мутанта. Результаты анализа могут в дальнейшем быть использованы для предсказания расположения аминокислотных остатков, вовлеченных в трехмерную структуру белка. На основе вышеуказанных результатов анализа специалисты в данной области техники могут получить мутант, не имеющий изменений в тех аминокислотных остатках, которые теоретически могут находиться на поверхности белка, и которые могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Специалисты в данной области техники также могут получить мутант, имеющий одну аминокислотную замену любого из аминокислотных остатков, которые образуют белок настоящего изобретения. Эти мутанты могут быть подвергнуты скринингу любым известным способом анализа для сбора информации об отдельных мутантах, которая позволит оценить функциональность отдельных аминокислотных остатков, образующих белок настоящего изобретения, на основе сравнения биологической активности в следующем случае: мутант, имеющий замену конкретного аминокислотного остатка, обладает более низкой биологической активностью по сравнению с белком настоящего изобретения; такой мутант не обладает биологической активностью; или такой мутант обладает неприемлемой активностью, ингибирующей биологическую активность белка настоящего изобретения. Кроме того, специалисты в данной области техники смогут без труда определить аминокислотную замену, нежелательную для мутантов белка настоящего изобретения, на основе информации, собранной в результате только таких стандартных экспериментов или в сочетании с другими мутациями.

Как описано выше, белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецие