Антитела и другие молекулы, которые связывают в7-н1 и pd-1

Антитела и другие молекулы, которые связывают в7-н1 и pd-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки:

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки Соединенных Штатов No. 61/477414 (поданной 20 апреля 2011 г.; находящейся на рассмотрении), эта заявка включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Ссылка на перечень последовательностей:

Заявка включает один или более Перечней последовательностей согласно 37 C.F.R. 1.821 и тому подобное, которые раскрыты как в бумажном, так и в машиночитаемом вариантах, где их описания в бумажном и машиночитаемом вариантах включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Известный уровень техники:

Область техники, к которой относится изобретение:

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам и к другим молекулам, которые способны иммуноспецифически связываться с B7-H1 или PD-1. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы дополнительно способны модулировать способность B7-H1 или B7-DC связываться с PD-1, или способны влиять на сигнальную активность B7-H1 или PD-1. Изобретение дополнительно относится к применению таких молекул для диагностики и лечения злокачественного новообразования и других заболеваний.

Описание известного уровня техники:

A. Опосредуемые клетками иммунные ответы

Иммунная система человека и других млекопитающих ответственна за обеспечение защиты против инфекций и заболеваний. Такая защита обеспечивается как гуморальным иммунным ответом, так и иммунным ответом, опосредуемым клетками. Гуморальный ответ приводит к продукции антител и других биомолекул, которые способны распознавать и нейтрализовать чужеродные агенты (антигены). В противоположность этому иммунный ответ, опосредуемый клетками, включает активацию Т-клетками макрофагов, клеток-природных киллеров (NK) и антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и секрецию различных цитокинов в ответ на распознавание антигена (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules" Immunolog. Res. 28(1):39-48).

Способность Т-клеток оптимально опосредовать иммунный ответ против антигена требует двух отдельных сигнальных взаимодействий (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation" Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy" Adv. Immunol. 90:297-339). Во-первых, антиген, который располагается на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC), должен быть представлен специфичной для антигена наивной CD4⁺ Т-клетке. При таком представлении сигнал доставляется через рецептор Т-клетки (TCR), что заставляет Т-клетку инициировать иммунный ответ, который должен быть специфичным в отношении представляемого антигена. Во-вторых, серии костимуляторных и ингибиторных сигналов, опосредуемых взаимодействиями между APC и определенными молекулами поверхности Т-клетки, запускают сначала активацию и пролиферацию Т-клеток, и затем их ингибирование. Таким образом, первый сигнал придает специфичность иммунному ответу, тогда как второй сигнал служит для определения природы, степени и продолжительности ответа.

Иммунная система жестко контролируется костимуляторными и коингибиторными лигандами и рецепторами. Эти молекулы являются вторым сигналом для активации Т-клеток и обеспечивают сбалансированной сетью позитивных и негативных сигналов для доведения до максимума иммунных ответов против инфекции, в то же время, ограничивая иммунный ответ на собственные антигены (Wang, L. et al. (March 7, 2011) “VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T Cell Responses,” J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, B. et al. (2008) “The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,” Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). Особую важность приобретает связывание между лигандами B7.1 (CD80) и B7.2 (CD86) антигенпрезентирующей клетки и CD28 и CTLA-4 рецепторами CD4⁺ Т-лимфоцита (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229:307-321). Связывание B7.1 или B7.2 с CD28 стимулирует активацию Т-клеток; связывание B7.1 или B7.2 с CTLA-4 ингибирует такую активацию (Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) “The B7 Family Revisited,” Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28 конститутивно экспрессируется на поверхности Т-клеток (Gross, J., et al. (1992) “Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse,” J. Immunol. 149:380-388), тогда как экспрессия CTLA4 быстро позитивно регулируется после активации Т-клеток (Linsley, P. et al. (1996) “Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement,” Immunity 4:535-543). Так как CTLA4 является более высокоаффинным рецептором (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126), связывание сначала инициирует пролиферацию Т-клеток (через CD28), а затем ингибирует ее (через возникающую экспрессию CTLA4), тем самым ослабляя эффект, когда в пролиферации больше нет необходимости.

Последующие исследования лигандов CD28 рецептора привели к идентификации и характеристики набора молекул, родственных B7 («надсемейства B7») (Coyle, A.J. et al. (2001) “The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function,” Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) “The B7 Family Revisited,” Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells.” Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) “The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance,” Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) “CD28/B7 System of T Cell Costimulation,” Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) “Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses,” Microbes Infect. 6:759-766). В настоящее время существует несколько представителей семейства: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), индуцибельный костимуляторный лиганд (ICOS-L), лиганд запрограммированной смерти 1 (PD-L1; B7-H1), лиганд запрограммированной смерти 2 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 и B7-H6 (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al. (2012) “Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC,” Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2).

B. Взаимодействия B7-H1/PD1

1. B7-H1

B7-H1 (PD-L1, CD274) является особенно значимым представителем надсемейства B7, так как он главным образом вовлечен в формирование иммунного ответа на опухоли (Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260; патенты Соединенных Штатов No. 6803192, 7794710; публикации патентных заявок Соединенных Штатов No. 2005/0059051, 2009/0055944, 2009/0274666, 2009/0313687; публикации PCT No. WO 01/39722; WO 02/086083). B7-H1 представляет собой трансмембранный белок типа 1 с М.м. приблизительно 33 кДа. Предполагается, что он играет главную роль в подавлении иммунной системы во время определенных состояний, таких как беременность, аллотрансплантаты тканей, аутоиммунное заболевание и другие заболевания, такие как гепатит.

B7-H1 широко экспрессируется в различных тканях человека и мыши, таких как сердце, плацента, мышца, печень плода, селезенка, лимфатические узлы и тимус у обоих видов, а также в печени, легком и почке только у мыши (Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). У человека экспрессия белка B7-H1 найдена в эндотелиальных клетках человека (Chen, Y. et al. (2005) “Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,” Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al. (2005) “Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1” Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al. (2002) “B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T Cell Cytokine Synthesis,” J. Immunol. 169:3581-3588), миокарде (Brown, J.A. et al. (2003) “Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T Cell Activation And Cytokine Production,” J. Immunol. 170:1257-1266), синцитиотрофобластах (Petroff, M.G. et al. (2002) “B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface,” Placenta 23:S95-S101), в резидентных макрофагах некоторых тканей или в макрофагах, которые активированы интерфероном (IFN)-γ или фактором некроза опухолей (TNF)-α (Latchman, Y. et al. (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation,” Nat. Immunol 2:261-268), and in tumors (Dong, H. (2003) “B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,” J. Mol. Med. 81:281-287). У мыши экспрессия белка B7-H1 найдена в эндотелии сердца, в клетках островкового аппарата поджелудочной железы, в тонком кишечнике и плаценте (Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).

2. PD-1

Белок-1 программируемой смерти ("PD-1") представляет собой рецептор B7-H1 и B7-DC. PD-1 представляет собой представитель мембранных белков типа I широкого семейства CD28/CTLA4 регуляторов Т-клеток с М.м. приблизительно 31 кДа (Ishida, Y. et al. (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895; публикации патентных заявок Соединенных Штатов No. 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; патенты Соединенных Штатов No. 6808710; 7101550; 7488802; 7635757; 7722868; публикация PCT No. WO 01/14557). По сравнению с CTLA4, PD-1 более широко негативно регулирует иммунные ответы.

PD-1 экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках и моноцитах (Agata, Y. et al. (1996) “Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. et al. (2002) “Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T Cells And APC,” J. Immunol. 169:5538-5545) и на низких уровнях в Т-клетках природных киллерах (NK) ((Nishimura, H. et al. (2000) “Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice,” J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).

Внеклеточная область PD-1 состоит из единичного иммуноглобулинового (Ig)V домена с 23% идентичностью эквивалентному домену в CTLA4 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). За внеклеточным доменом IgV следует трансмембранная область и внутриклеточный хвост. Внутриклеточный хвост содержит два сайта фосфорилирования, локализованных в иммунорецепторном ингибиторном мотиве на основе тирозина и в иммунорецепторном переключающем мотиве на основе тирозина, что предполагает негативную регуляцию PD-1 сигналов TCR (Ishida, Y. et al. (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895; Blank, C. et al. (Epub 2006 Dec 29) “Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer,” Immunol. Immunother. 56(5):739-745).

Сообщалось об антителах, способных иммуноспецифически связываться с PD-1 (см., например, Agata, T. et al. (1996) “Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5):765-772).

C. Взаимодействия B7-H1 и PD-1

Взаимодействие B7-H1 и PD-1, как обнаружено, снабжает Т- и В-клетки решающим негативным костимуляторным сигналом (Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298) и действует в качестве индуктора клеточной смерти (Ishida, Y. et al. (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, S.K. et al. (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition,” J. Molec. Med. 83:193-202).

Взаимодействие между низкими концентрациями PD-1 рецептора и B7-H1 лиганда приводит к передаче ингибиторного сигнала, который усиленно ингибирует пролиферацию антигенспецифических CD8⁺ Т-клеток; при более высоких концентрациях взаимодействия с PD-1 не ингибируют пролиферацию Т-клеток, но существенно снижают продукцию множества цитокинов (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Пролиферация Т-клеток и продукция цитокинов как находящимися в покое, так и предварительно активированными CD4 и CD8 Т-клетками, и даже наивными Т-клетками из крови пупочного канатика, как обнаружено, ингибируются растворимыми слитыми белками B7-H1-Fc (Freeman, G.J. et al. (2000) “Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation,” J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al. (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation,” Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) “PD-1:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2,” Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126).

Взаимодействия B7-H1 - PD-1 ведут к аресту клеточного цикла на фазе G0-G1, но не увеличивают клеточной смерти (Latchman, Y. et al. (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation,” Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) “PD-1:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2,” Eur. J. Immunol. 32(3):634-643). Таким образом, комплексирование B7-H1 - PD-1 обладает способностью антагонистически действовать на сигнал B7 - CD28, когда антигенная стимуляция является слабой или лимитирующей, и играет ключевую роль в негативной регуляции ответов Т-клеток.

Передача сигнала, опосредуемого B7-H1 и PD-1, является сложной. Обе молекулы дополнительно связываются с другими белками. B7-H1 способен связываться с B7-1 (CD80) (Butte, M.J. et al. (2008) “Interaction of PD-L1 and B7-1,” Molecular Immunol. 45:3567-3572); PD-1 способен связываться с B7-DC (PD-L2) (Lázár-Molnár, E. et al. (2008) “Crystal Structure Of The Complex Between Programmed Death-1 (PD-1) And Its Ligand PD-L2,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(30):10483-10488). B7-1 взаимодействует с CD28 для доставки костимуляторного сигнала для активации Т-клеток, что важно на ранних стадиях иммунного ответа (Elloso, M.M. et al. (1999) “Expression and Contribution of B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) in the Early Immune Response to Leishmania major Infection,” J. Immunol. 162:6708-6715). B7-DC является сильным стимулятором Т-клеток, повышая пролиферацию Т-клеток и продукцию IFN-γ. Однако он также проявляет ингибиторное влияние на иммунный ответ через свое взаимодействие с PD-1 (Ishiwata, K. et al. (epub January 10, 2010) “Costimulator Responses Induced by Nippostrongylus brasiliensis,” J. Immunol. 184:2086-2094). Микробы и опухоли, очевидно, используют PD-1 и B7-H1 для ускользания от уничтожения иммунной системой. Различия в связывающей аффинности к различным рецепторам и лигандам, которые взаимодействуют с PD-1 и B7-H1, как предполагается, обусловливают индивидуальные функциональные исходы блокады PD-1 и B7-H1 в моделях заболеваний (Butte, M.J. et al. (2008) “Interaction of PD-L1 and B7-1,” Molecular Immunol. 45:3567-3572). Путь PD-1 вовлечен как играющий ключевую роль также в повреждение иммунной функции в процессе хронической инфекции («Т-клеточное истощение»), и блокада функции PD-1 способна восстановить многие функции Т-клеток (Rodríquez-García, M. et al. (November 19, 2010) “Expression Of PD-L1 And PD-L2 On Human Macrophages Is Up-Regulated By HIV-1 And Differentially Modulated By IL-10,” J. Leukocyte Biol. 89: doi:10.1189/jlb.0610327:1-9).

Роль B7-H1 и PD-1 в ингибировании активации и пролиферации Т-клеток предполагает, что эти молекулы могут служить в качестве терапевтических мишеней для лечения воспаления и злокачественного новообразования. Предлагается применение антител против PD1 для лечения инфекций и опухолей и позитивной модуляции адаптивного иммунного ответа (см. публикации патентных заявок Соединенных Штатов No. 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401; патенты Соединенных Штатов No. 7521051; 7563869; 7595048; публикации PCT No. WO 2004/056875; WO 2008/083174). Наоборот, средства, которые модулируют взаимодействие PD-1 с B7-H1, как предполагается, находят применение в позитивной или негативной модуляции иммунного ответа (см. патенты Соединенных Штатов No. 7029674; 7488802; публикации патентных заявок Соединенных Штатов No. 2007/0122378; 2009/0076250; 2009/0110667; 2009/0263865; 2009/0297518; публикацию PCT No. WO 2006/133396). Подобно этому предлагается использование антител против B7-H1 для лечения инфекций и опухолей и позитивной регуляции адаптивного иммунного ответа (публикации патентных заявок Соединенных Штатов No. 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0317368; патенты Соединенных Штатов No. 6803192; 7794710; публикации PCT No. WO 01/39722; WO 02/086083).

Тем не менее, несмотря на все эти достижения, остается потребность в композициях, способных модулировать взаимодействие между B7-H1 и PD-1. Настоящее изобретение направлено на такие композиции и их применение для лечения злокачественного новообразования и других заболеваний и состояний.

Краткое изложение сущности изобретения:

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам и к другим молекулам, которые способны иммуноспецифически связываться с B7-H1 или PD-1. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы дополнительно способны модулировать способность B7-H1 связываться с PD-1 или способны влиять на сигнальную активность B7-H1 или PD-1. Изобретение дополнительно касается применения таких молекул для диагностики и лечения злокачественного новообразования и других заболеваний.

Конкретнее, в изобретении предлагается молекула, содержащая антигенсвязывающий фрагмент антитела, которая иммуноспецифически связывается с B7-H1 или PD-1 и, в особенности, с B7-H1 человека или PD-1 человека, предпочтительно, экспрессирующимися на поверхности живой клетки в эндогенной концентрации или концентрации, полученной в результате трансфекции. Изобретение особенно касается варианта осуществления в виде такой молекулы, в которой антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H1, и где живая клетка представляет собой опухолевую клетку, клетку, инфицированную патогеном, или антигенпрезентирующую клетку, а также варианта осуществления в виде такой молекулы, в которой антигенсвязывающий фрагмент связывается с PD-1, и где живая клетка представляет собой Т-клетку.

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам и к другим молекулам, которые способны иммуноспецифически связываться с B7-H1 или PD-1. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы дополнительно способны модулировать способность B7-H1 связываться с PD-1 или способны влиять на сигнальную активность B7-H1 или PD-1. Изобретение дополнительно касается применения таких молекул для диагностики и лечения злокачественного новообразования и других заболеваний.

Конкретнее, в изобретении предлагается молекула, содержащая антигенсвязывающий фрагмент антитела, которая иммуноспецифически связывается с B7-H1 или PD-1 и, в особенности, с B7-H1 человека или PD-1 человека, предпочтительно, экспрессирующимися на поверхности живой клетки в эндогенной концентрации или концентрации, полученной в результате трансфекции. Изобретение особенно касается варианта осуществления в виде такой молекулы, в которой антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H1, и где живая клетка представляет собой опухолевую клетку, клетку, инфицированную патогеном, или антигенпрезентирующую клетку, а также варианта осуществления в виде такой молекулы, в которой антигенсвязывающий фрагмент связывается с PD-1, и где живая клетка представляет собой Т-клетку.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде таких молекул, где молекула представляет собой моноклональное антитело, антитело человека, химерное антитело или гуманизированное антитело. Изобретение включает варианты осуществления, где такие антитела являются моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими или мультиспецифическими.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде таких молекул или антител, которые связываются с B7-H1, и где их антигенсвязывающий фрагмент содержит шесть CDR, где CDR содержат по меньшей мере одну консенсусную CDR из CDR антител 1E12, 1F4, 2G11, 3B6 и 3D10 против B7-H1 со всеми оставшимися CDR, выбранными из:

(A) трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи антитела 1E12 против B7-H1;

(B) трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи антитела 1F4 против B7-H1;

(C) трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи антитела 2G11 против B7-H1;

(D) трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи антитела 3B6 против B7-H1; или

(E) трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи антитела 3D10 против B7-H1.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде таких молекул или антител, которые связываются с B7-H1, и где их антигенсвязывающий фрагмент содержит шесть CDR, где шесть CDR представляют собой:

(A) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела 1E12 против B7-H1;

(B) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела 1F4 против B7-H1;

(C) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела 2G11 против B7-H1;

(D) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела 3B6 против B7-H1; или

(E) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела 3D10 против B7-H1.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде таких антител, где антитело связывается с B7-H1 и содержит вариабельный домен антитела h3D10 Var 1, h3D10 Var 2, h3D10 Var 3, h3D10 Var 4, h3D10 Var 5, h3D10 Var 6, h3D10 Var 7, h3D10 Var 8, h3D10 Var 9, h3D10 Var 10, h3D10 Var 11, h3D10 Var 12, h3D10 Var 13 или h3D10 Var 14.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде описанных выше молекул или антител, где молекулы или антитела связываются с PD-1, и где антигенсвязывающий фрагмент содержит шесть CDR, где CDR содержат по меньшей мере одну консенсусную CDR из CDR антител 1E3, 1E8 и 1H3 против PD-1 со всеми оставшимися CDR, выбранными из:

(A) трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи антитела 1E3 против PD-1;

(B) трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи антитела 1E8 против PD-1; или

(C) трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи антитела 1H3 против PD-1.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде таких антител, где шесть CDR представляют собой:

(A) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела 1E3 против PD-1;

(B) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела 1E8 против PD-1; или

(C) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела 1H3 против PD-1.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде таких антител, где антитело связывается с PD-1 и содержит вариабельный домен антитела h1H3 Var 1, h1H3 Var 2, h1H3 Var 3, h1H3 Var 4, h1H3 Var 5, h1H3 Var 6, h1H3 Var 7, h1H3 Var 8, h1H3 Var 9, h1H3 Var 10, h1H3 Var 11, h1H3 Var 12, h1H3 Var 13 или h1H3 Var 14.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде описанных выше молекул или антител, где молекула или антитело помечены определяемой меткой или содержит конъюгированный токсин, лекарственное средство, рецептор, фермент, лиганд рецептора.

Изобретение дополнительно касается варианта осуществления в виде описанных выше молекул или антител, где молекула или антитело:

(A) модулирует передачу сигнала, опосредуемую B7-H1 или PD-1;

(B) ослабляет способность B7-H1 связываться с рецептором B7-H1 или ослабляет способность PD-1 связываться с лигандом PD-1;

(C) является агонистом B7-H1 или PD-1 в отношении опосредуемой ими передачи сигнала;

(D) опосредует пролиферацию Т-клеток; или

(E) повышает продукцию IFN-γ.

Изобретение дополнительно касается фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество любых из описанных выше молекул или антител и физиологически приемлемый носитель или наполнитель. Изобретение дополнительно касается применения такой фармацевтической композиции для лечения злокачественного новообразования, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания или заболевания, влияющего на количество Т-клеток или на их здоровое состояние. Изобретение дополнительно касается применения такой фармацевтической композиции, где лечение является профилактическим и предлагается перед любым симптомом злокачественного новообразования, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания или заболевания, влияющего на количество Т-клеток или на их здоровое состояние, или для лечения побочных состояний при трансплантации.

Изобретение дополнительно касается применения любых описанных выше молекул или антител для диагностики злокачественного новообразования, аутоиммунного заболевания (особенно заболевания трансплантат против хозяина), инфекционного заболевания (особенно хронического вирусного заболевания) или заболевания, влияющего на количество Т-клеток или на их здоровое состояние, у индивидуума с помощью анализа клеток индивидуума на их способность связываться с B7-H1 или PD-1.

Изобретение особенно касается варианта осуществления в виде таких молекул, антител и композиций, где B7-H1 представляет собой B7-H1 человека и PD-1 представляет собой PD-1 человека.

Изобретение особенно касается способа диагностики заболевания (особенно злокачественного новообразования) у индивидуума, включающего оценку клеток индивидуума на их способность связываться с любыми из описанных выше молекул, связывающих B7-H1, где в способе предлагается цитологическая оценка для диагностики наличия заболевания у индивидуума.

Изобретение дополнительно касается способа диагностики заболевания (особенно заболевания, влияющего на количество Т-клеток и/или на их здоровое состояние) у индивидуума, включающего оценку клеток индивидуума на их способность связываться с молекулой, связывающей PD-1, где в способе предлагается цитологическая оценка для диагностики наличия и/или прогрессии заболевания у индивидуума, или для оценки ответа индивидуума на лечение.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлено тестирование супернатантов гибридом, на связывание антитела с B7-H1. Положительный контроль (PC): 1:1000 разведенные сыворотки от мыши, используемой для создания гибридомы; отрицательный контроль (NC): 5% молоко/PBS. Данные показаны для связывания с B7-H1-Fc и определения с помощью IgG против мыши.

На фигуре 2 представлены результаты экспериментов по определению того, способны ли выделенные антитела против B7-H1 модулировать связывание B7-H1 с PD-1. Положительный контроль: клоны MIH-1 и 29E.2A3 (оба против CD274 человека (B7-H1); два отрицательных контроля: кондиционные среды от неродственной гибридомы (случайные АТ) и векторный контроль (VC).

На фигуре 3 представлена медиана интенсивности флуоресценции (MFI) тестируемых антител против B7-H1 при связывании с CHO-hB7-H1. Как обнаружено, ни один из тестируемых клонов не имел перекрестной реакции с родительской линией CHO, что указывает на то, что экспрессируемое антитело было иммуноспецифическим в отношении B7-H1 человека.

На фигуре 4 представлена медиана интенсивности флуоресценции (MFI), полученная в результате тестирования связывания выбранных антител против B7-H1 человека с клетками CHO, экспрессирующими B7-H1 человека.

На фигуре 5 сравнивается медиана интенсивности флуоресценции (MFI), полученная в результате тестирования связывания антител 5H1 и 1E12 против B7-H1 человека с клетками CHO, экспрессирующими B7-H1 человека.

На фигуре 6 представлено связывание антигена и изотип выделенных антител против PD-1 человека.

На фигурах 7A-7B представлены результаты экспериментов, указывающие на то, что некоторые из выделенных гибридом экспрессировали нейтрализующие антитела против PD-1 человека.

На фигуре 8 представлена медиана интенсивности флуоресценции (MFI) тестируемых антител против PD-1 при связывании с CHO-hPD-1. Как обнаружено, ни один из тестируемых клонов не имел перекрестной реакции с родительской линией CHO, что указывает на то, что экспрессируемое антитело было специфичным в отношении PD-1 человека.

На фигуре 9 представлена медиана интенсивности флуоресценции (MFI), полученная в результате тестирования связывания выбранных антител против PD-1 человека с клетками CHO, экспрессирующими PD-1 человека. Положительный контроль: EH12 (имеющееся в продаже от BioLegend антитело против PD-1 человека); mIgG1: отрицательный контроль - IgG мыши.

На фигуре 10 представлена медиана интенсивности флуоресценции (MFI), полученная в результате основанного на клетках конкурентного анализа при различных концентрациях антител против PD-1 человека.

На фигуре 11 представлена медиана интенсивности флуоресценции (MFI), полученная в результате основанного на клетках конкурентного анализа при концентрации антитела против PD-1 человека 20 мкг/мл.

На фигуре 12 представлены результаты эксперимента, в котором клетки CHO, трансфицированные полноразмерным PD-1 человека, предварительно инкубировали с насыщающей дозой моноклональных антител (mAb) против PD-1 человека или с контрольными Ig перед окрашиванием меченными биотином hB7-H1-FC или hB7-DC mIg.

На фигуре 13, панели A-B, представлено сравнение связывания: (A) имеющегося в продаже антитела против PD-1, EH12 с (B) моноклональным антителом мыши, которое является химерным («ch»), обладая областями Fab антитела мыши против PD-1 человека и областью Fc антитела человека.

На фигуре 14, панели A-B, представлена способность антител против PD-1 по настоящему изобретению проявлять блокирующий эффект в отношении связывания биотинилированного B7-Hl-Fc и биотинилированного B7-DC-Fc с PD-1.

На фигуре 15 показана кривая связывания химерного антитела 1H3 против PD-1 человека с клетками CHO.hPD-1 при определении с помощью антитела против hIg.

На фигурах 16A-16B показаны результаты исследований способности химерного антитела 1H3 против PD-1 человека связываться с первичными Т-клетками человека CD8+ (фигура 16A) и CD4+ (фигура 16B) относительно антител отрицательного контроля (паливизумаб; SYNAGIS®, Medimmune, Inc.).

На фигуре 17 представлена способность антител по настоящему изобретению повышать антигенспецифический ответ Т-клеток при измерении с помощью разведения CFSE при повторном присутствии столбнячного токсина (TT).

На фигурах 18A-18D показана способность гуманизированных вариантов 1H3 (h1H3 Var 1 - h1H3 Var 14) связываться с клетками CHO.hPD1.

На фигурах 19A-19B показана способность гуманизированных антител против PD-1 блокировать взаимодействия между hPD-1-Fc и клетками HEK293, экспрессирующими B7-H1 (фигура 19A) или B7-DC (фигура 19B).

На фигуре 20 представлены кривые связывания h1H3 Var 1 - h1H3 Var 6.

Подробное описание изобретения:

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам и к другим молекулам, которые способны иммуноспецифически связываться с B7-H1 или PD-1. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы дополнительно способны модулировать способность B7-H1 или B7-DC в отношении связывания с PD-1, или способны влиять на сигнальную активность B7-H1 или PD-1. Изобретение дополнительно касается применения таких молекул для лечения злокачественного новообразования и других заболеваний.

Молекула, как говорится, способна «иммуноспецифически связываться» со второй молекулой, если такое связывание характеризуется специфичностью и аффинностью антитела к распознаваемому им антигену. Антитела, как говорится, способны «иммуноспецифически связываться» с областью-мишенью или конформационной областью («эпитопом») антигена (и в частности, антигенов: B7-H1 или PD-1), если в такое связывание вовлекается сайт распознавания антигена молекулы иммуноглобулина. Антитело, которое иммуноспецифически связывается с конкретным антигеном, может связываться с другими антигенами с более низкой аффинностью, если другой антиген обладает некоторым сходством последовательности или конформационным сходством, которое распознается сайтом распознавания антигена при определении, например, иммунометодами, методами BIACORE® или другими методами, известными в данной области, но оно не должно связываться с совершенно неродственным антигеном. Однако предпочтительно, чтобы антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты) не реагировали перекрестно с другими антигенами. Антитела могут также связываться с другими молекулами путем, который не является иммуноспецифическим, например, с рецепторами FcR с помощью связывающих доменов в других областях/доменах молекулы, которые не входят в сайт распознавания антигена, например, с помощью области Fc.

Как используется в настоящем описании термин «модулировать» относится к способности изменять эффект или результат. В частности, изобретение относится к молекулам (особенно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые иммуноспецифически связываются с B7-H1 человека или PD-1 человека), которые способны модулировать связывание между B7-H1 и PD-1 и/или модулировать передачу сигнала, которая возникает как следствие связывания B7-H1-PD-1. Такая модуляция может приводить к ослаблению или полному блокированию способности B7-H1 связываться с PD-1. В дополнительном варианте осуществления такая модуляция может ослаблять или полностью нейтрализовать способность B7-H1 или PD-1 опосредовать передачу сигнала. В дополнительном варианте осуществления такая модуляция может повышать или другим образом оказывать агонистические эффекты на передачу сигнала через B7-H1 или PD-1 1) либо с помощью усиления взаимодействия между B7-H1 и PD-1 и облегчения связывания B7-H1 - PD-1, ii) либо с помощью прямого связывания с B7-H1 и PD-1 и в результате этого имитирования активности эндогенного лиганда и т.п. В еще одном варианте осуществления такая модуляция может изменять природу взаимодействия между B7-H1 и PD-1 так, что изменяется природа вызываемой передачи сигнала. Например, молекулы по настоящему изобретению могут при связывании с B7-H1 или PD-1 изменять способность таких молекул связываться с другими лигандами и рецептором (например, влияя на способность PD-1 связываться с B7-DC или на способность B7-H1 связываться с B7-1 (CD80)) и тем самым изменяя итоговую активность. Предпочтительно, такая модуляция должна обеспечивать по меньшей мере 10% изменение в измеряемой активности иммунной системы, более предпочтительно, по меньшей мере 50% изменение такой активности, или по меньшей мере 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное или, еще более предпочтительно, по меньшей мере 100-кратное изменение такой активности.

Как используется в настоящем описании термин «антитело» предназначен для обозначения молекулы иммуноглобулина, которая обладает антигенраспознающим сайтом «вариабельной области». Термин «вариабельная область» предназначен для отличия такого домена иммуноглобулина от доменов, которые широко используются антителами (таких как домен Fc). Вариабельная область содержит «гипервариабельную область», остатки которой отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR» (т.е. обычно приблизительно остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и приблизительно остатки 27-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или такие остатки из «гипервариабельной петли» (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia, C. et al. (1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196:901-917). Остатки «области каркаса» или «FR» представляют собой те остатки вариабельного домена, которые отличны от остатков гипервариабельной области, как определено в настоящем описании. Термин антитело включает моноклональные антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химерные антитела, приближенные к верблюдным антитела (см., например, Muyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25; международные публикации No. WO 94/04678 и WO 94/25591; патент США No. 6005079), одноцепочечные Fv (scFv) (см., например, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Fv (sdFv), интратела и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id и анти-анти-Id антитела к антителам по изобретению). В частности, такие антитела включают молекулы иммуноглобулинов любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂) или подкласса.

Как используется в настоящем описании термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела относится к одной или более частям антитела, которые содержат области, определяющие комплементарность («CDR»), и необязательно остатки каркаса, которые содержат антигенраспознающий сайт «вариабельной области» антитела, и проявляют способность к иммуноспецифическому связыванию антигена. Такие фрагменты включают Fab', F(ab')₂, Fv, одноцепочечные антитела (ScFv) и их мутанты, природные варианты и слитые белки, содержащие антигенраспознающий сайт «вариабельной области» антитела, и гетерологичный белок (например, токсин, антигенраспознающий сайт для отличного антигена, фермент, рецептор, лиганд рецептора и т.п.). Как используется в настоящем описании термин «фрагмент» относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность по меньшей мере из 5 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 10 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 15 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 20 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 25 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 40 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 60 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 70 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 80 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 90 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 100 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 125 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 150 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 175 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 200 последовательных аминокислотных остатков или по меньшей мере из 250 последовательных аминокислотных остатков.

Антитела человека, химерные или гуманизированные антитела особенно предпочтительны для использования in vivo у человека, однако антитела мыши или антитела других видов могут быть успешно применены для многих вариантов использования (например, для методов определения in vitro или in situ, экстренного использования in vivo и т.п.). Полностью человеческие а