Способы ингибирования фукозилирования белков in vivo с использованием аналогов фукозы

Способы ингибирования фукозилирования белков in vivo с использованием аналогов фукозы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США 61/371116, поданной 5 августа 2010 г., раскрытие которой включено в данный документ для сведения.

Уровень техники

L-фукоза, также относящаяся к 6-дезокси-L-галактозе, представляет собой моносахарид, который является компонентом некоторых N- и О-связанных гликанов и гликолипидов у животных (см. Becker and Lowe, Glycobiology, 13:41R-51R, 2003). Как правило, фукоза добавляется в качестве концевых модификаций гликанов, включая гликаны, соединенные с антигенами группы крови, селектины и антитела. Фукоза может присоединяться к гликанам посредством α(1,2)-, α(1,3)-, α(1,4)- и α(1,6)-связей под действием специфических фукозилтрансфераз. Как правило, α(1,2)-фукозидные связи ассоциированы с антигенами группы Н-крови. α(1,3)- и α(1,4)-фукозидные связи ассоциированы с модификацией антигенов Lewis^X. α(1,6)-фукозидные связи ассоциированы с молекулами N-связанных GlcNAc, которые находятся на антителах.

Полагается, что фукозилирование белков играет роль в развитии млекопитающих. У мышей, гомозиготных по нацеленной мутации гена FX, имеют место многочисленные аномалии развития, включая летальный фенотип. Также сообщалось о пониженной рождаемости мышей от гетерозиготных гибридов (Becker et al., Mammalian Genome, 14:130-139, 2003). Было высказано предположение о том, что аберрантное фукозилирование ассоциировано с заболеваниями человека, включая положительную регуляцию сиалил-Lewis^X и сиалил-Lewis^Y при раке. Эти гликаны являются лигандами молекул Е- и Р-селектина. Предполагается, что повышение уровня гликанов в сиалил-Lewis^X и сиалил-Lewis^Y в раковых клетках приводит к усилению распространения метастазов за счет взаимодействия Е- и Р-селектинов в эндотелии. Гликаны с высокой степенью фукозилирования также были обнаружены у пациентов с ревматоидным артритом. Однако в настоящее время отсутствуют разрешенные для применения терапевтические подходы, нацеленные на степень фукозилирования белков.

Сущность изобретения

Способы и композиции, описанные в данном документе, частично основываются на неожиданных результатах, представленных в разделе «Примеры», показывающих, что у животных, которым ввели аналог фукозы, имеется пониженный уровень фукозилирования белков. Фукозилирование антител и других белков можно модулировать с использованием аналогов фукозы, описанных в данном документе.

В одном аспекте изобретение относится к способам и композициям для продукции in vivo дефукозилированных белков. У животных, таких как млекопитающие, которым ввели аналог фукозы (формул I, II, II, IV, V или VI), продуцируются белки, такие как поверхностные клеточные белки, имеющие пониженный уровень фукозилирования. Снижение фукозилирования оценивается относительно животных, не обработанных аналогами фукозы соответственно формул I, II, II, IV, V или VI.

В близком аспекте изобретение относится к продукции in vivo антител и производных антител с пониженным фукозилированием кора. У животных, которым ввели аналог фукозы (формул I, II, II, IV, V или VI), продуцируются антитела и производные антител, имеющие пониженный уровень фукозилирования кора (т.е. пониженный уровень фукозилирования N-ацетилглюкозамина сложных N-гликозид-связанных сахарных цепей, соединенных с F-областью через N-ацетилглюкозамин редуцирующего конца сахарных цепей). Снижение фукозилирования кора оценивается относительно животных, не обработанных аналогами фукозы соответственно формул I, II, II, IV, V или VI.

Еще в одном аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим аналоги фукозы и формулированным для введения целевому животному. Аналоги фукозы можно формулировать для введения животному для ингибирования или снижения фукозилирования в условиях in vivo.

Данные и другие аспекты настоящего изобретения можно полнее понять при обращении к последующему подробному описанию, неограничивающим примерам конкретных вариантов осуществления и прилагаемым фигурам.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 приведены результаты влияния введения аналогов фукозы (внутрибрюшинной инъекцией) на фукозилирование антител. Дот-блоты показаны на левой панели, и график приведен на правой панели. Уровни нагрузки белками дот-блотов (вверху слева) и фукоза-специфическая биолюминесценция (внизу слева) для стандартов антитела сАС10 (нижний дот-блот, левый наиболее заштрихованный прямоугольник и соответствующие колонки верхнего дот-блота), необработанного контроля (нижний дот-блот, второй заштрихованный прямоугольник слева и соответствующая колонка верхнего дот-блота) и алкинилфукозы (SGD-1887; нижний дот-блот, средний заштрихованный прямоугольник и соответствующая колонка верхнего дот-блота), перацетата алкинилфукозы (SGD-1890; нижний дот-блот, второй заштрихованный прямоугольник справа и соответствующая колонка верхнего дот-блота) и 2-фторфукозы (SGD-2083; нижний дот-блот, правый наиболее заштрихованный прямоугольник и соответствующая колонка верхнего дот-блота). После корректировки на уровень нагрузки на графике справа показан % фукозилирования.

На фигуре 2 показано влияние на фукозилирование кора антитела введения аналогов фукозы с питьевой водой. На графиках показан % фукозилирования антител по данным газовой хроматографии (ГХ): на панелях А и В приведены уровни фукозилирования анти-KLH-антител (Ab), выделенных от животных обработанных групп, в то время как на панелях С и D показаны уровни фукозилирования остальных (не-KLH-специфических) IgG антител. На панелях А и С показан процент фукозилирования для каждого животного с использованием калибровочной кривой с очищенным антителом (0-100% фукозилирование). На панелях В и D показан уровень фукозилирования у обработанных животных в виде процента от среднего значения для животных в необработанной контрольной группе.

На фигуре 3 показано влияние введения аналогов фукозы с питьевой водой на фукозилирование кора антител. На данной фигуре приведены уровни фукозилирования неспецифических-KLH-антител. Уровни нагрузки белками дот-блотов (вверху слева) и фукоза-специфическая биолюминесценция (внизу слева) для стандартов антитела сАС10 (верхний и нижний дот-блоты, левый наиболее заштрихованные прямоугольники), необработанного контроля (верхний и нижний дот-блоты, второй левый (верхний) и правый прямоугольники) и 2-фторфукозы (верхний и нижний дот-блоты, второй слева (нижний) и второй справа прямоугольники (верхний и нижний)). После корректировки на уровень нагрузки на графике справа показан % фукозилирования.

На фигуре 4 показано влияние введения 2-фторфукозы в различных дозах с питьевой водой на фукозилирование кора антител. Дот-блоты показывают уровни нагрузки белками (слева) и фукоза-специфическую биолюминесценцию (в середине) для необработанного контроля и 1; 10 и 100 мМ SGD-2083 (как указано). На графике справа показан % фукозилирования по сравнению с необработанным контролем.

На фигуре 5 показано влияние введения 2-фторфукозы на циркулирующие лейкоциты и нейтрофилы. Панель А. От отдельных мышей отбирали пробы крови и определяли количество лейкоцитов на гемоцитометре с использованием раствора Тюрка для отделения эритроцитов. Панель В. Для подсчета числа нейтрофилов определяли процент лейкоцитов, которые были Gr-1+ проточной цитометрией и относили к общему определенному количеству клеток (А). Панель С. Отбирали пул лимфатических узлов от отдельных мышей, готовили суспензии отдельных клеток и на гемоцитометре подсчитывали количество клеток. Условные обозначения представляют отдельных мышей (n=3 в группе; ромбы, необработанные животные; прямоугольники, 1 мМ 2-фторфукозы (SGD-2083); треугольники, 10 мМ 2-фторфукозы; кружки, 100 мМ 2-фторфукозы.

На фигуре 6 показано влияние введения 2-фторфукозы на связывание Е-селектина с нейтрофилами. Панель А. Пример идентификации нейрофилов проточной цитометрией. Клетки гейтировали в прямом и боковом светорассеивании для включения живых лейкоцитов и затем применяли к гистограмме, отражающей Gr-1-окрашивание для идентификации нейтрофилов. Позитивные клетки гейтировали, подсчитывали процент позитивных клеток (использованных для определения числа клеток, приведенного на фигуре 5В), и гейтирование применяли к гистограммам на (В). Панель В. Примеры связывания Е-селектина с нейтрофилами от необработанного животного (слева) и животного, обработанного перорально 2-фторфукозой (SGD-2083) в дозе 100 мМ (справа). Серые гистограммы показывают связывание Е-селектина, и точечные линии показывают связывание одного вторичного реагента. Определяли геометрические средние значение интенсивности флуоресценции для связывания Е-селектина. Панель С. Определяли геометрические средние значения интенсивности флуоресценции для связывания Е-селектина для каждого животного (В) и сравнивали между группами (n=3 на группу; ошибки в виде коротких отрезков представляют стандартное отклонение).

На фигуре 7 показано влияние на фукозилирование белков клеточных линий, культивированных с некоторыми аналогами фукозы. Исследовали клеточные линии LS174T, PC-3, Ramos, HL-60cy и Caki-1.

На фигуре 8 показаны эффекты аналогов фукозы на моделях опухолевых ксенотрансплантатов на мышах. Результаты, полученные на моделях ксенотрансплантатов на мышах с клеточными линиями LS174T, PC-3, Ramos, HL-60 и Caki-1 (предварительно обработанными 2-фторфукозой (SGD-2083)), приведены соответственно на панелях А-Е. Результаты на модели ксенотрансплантатов на мышах с необработанными клеточными линиями LS174T показаны на панели F.

На фигуре 9 приведен дизайн опыта (панель А) и результаты (панель В) с моделью опухолевой вакцины, основанной на предварительной иммунизации убитыми клетками мышиной лимфомы А20 с последующим введением живых клеток лимфомы А20 с или без введения аналога фукозы (2-фторфукозы).

Подробное описание изобретения

Определения

Термин «антитело» относится к (а) иммуноглобулиновым полипептидам и иммунологически активным фрагментам иммуноглобулиновых полипептидов, т.е. полипептидам семейства иммуноглобулинов или их фрагментам, которые содержат антигенсвязывающий сайт(ы), который иммуноспецифически связывается с определенным антигеном и содержит Fc-домен, содержащий сложную N-гликозид-связанную сахарную цепь(и), или (b) консервативно замещенным производным таких иммуноглобулиновых полипептидов или фрагментов, которые иммуноспецифически связываются с антигеном. В общем, антитела описаны, например, Harlow&Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).

«Производное антитела» означает антитело, имеющее значения, определенные выше (включая фрагмент антитела), или Fc-домен или область антитела, содержащее сложную N-гликозид-связанную сахарную цепь(и), которое модифицировано ковалентным присоединением гетерологичной молекулы, например, присоединением гетерологичного полипептида (например, лиганд-связывающего домена гетерологичного белка) или гликозилированием (иным чем фукозилирование кора), дегликозилированием (иным чем фукозилирование нон-кора), ацетилированием, фосфорилированием или другой модификацией, обычно не ассоциированной с антителом или Fc-доменом или Fc-областью.

Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, которое получено из одного клеточного клона, включая клон любых эукариотических или прокариотически клеток, или фаговый клон, и независимо от метода, которым он получен. Таким образом, термин «моноклональное антитело» не ограничивается антителами, продуцированными гибридомной технологией.

Термин «Fc-область» относится к константной области антитела, например, C_H1-шарнирный участок-C_H2-C_H3 домен, необязательно содержащей C_H4 домен, или консервативно замещенному производному такой Fc-области.

Термин «Fc-домен» относится к константному домену области антитела, например, C_H1, шарнирный участок, C_H2, C_H3, C_H4 домен, или консервативно замещенному производному такого Fc-домена.

Термин «антиген» является молекулой, с которой специфически связывается антитело или производное антитела.

Термины «специфическое связывание» и «специфически связывается» означает, что антитело или производное антитела будет связываться высокоселективным образом с его соответствующим антигеном-мишенью, а не с множеством других антигенов. Как правило, антитело или производное антитела связывается с аффинностью, составляющей, по меньшей мере, 1⋅10^-7 М и предпочтительно от 10^-8 М до 10^-9 М, 10^-10 М, 10^-11 М или 10^-12 М, и связывается с заранее определенным антигеном с аффинностью, которая, по меньшей мере, в два раза выше по сравнению с его аффинностью связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеин) иным, чем заранее определенный антиген или близко связанный антиген.

Термины «ингибировать» или «ингибирование» означает снижение на определяемое количество или полное предупреждение.

В том смысле, в котором в данном документе используется термин «перацетат алкинилфукозы», он относится к любой или всем формам алкинилфукозы (5-этиниларабинозы) с ацетатными группами в положениях R_1-4 (см. формулы I и II ниже), включая 6-этинилтетрагидро-2Н-пиран-2,3,4,5-тетраилтетраацетат, в том числе, изомеры (2S,3S,4R,5R,6S) и (2R,3S,4R,5R,6S), и 5-((S)-1-гидроксипроп-2-инил)тетрагидрофуран-2,3,4-триилтетраацетат, включая изомеры (2S,3S,4R,5R) и (2R,3S,4R,5R), и альдозную форму, если по контексту не указано иначе. Термины «триацетат алкинилфукозы», «диацетат алкинилфукозы» и «моноацетат алкинилфукозы» относятся соответственно к указанным три-, ди- и моноацетатам алкинилфукозы.

Если по контексту не указано иначе, термин «алкил» относится к незамещенному насыщенному углеводороду с прямой или разветвленной цепью, содержащему 1-20 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации пределов и конкретных чисел атомов углерода), если не указано иначе. Предпочтительной является алкильная группа из 1-3, 1-8 или 1-10 атомов углерода. Примерами алкильных групп являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, 2-пентил, 3-пентил, 2-метил-2-бутил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-1-бутил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил и 3,3-диметил-2-бутил.

Алкильные группы, в виде заместителя или в виде части другой замещающей группы, в том случае, когда они замещены, могут быть замещены одной или более группами, предпочтительно 1-3 группами (и любыми дополнительными заместителями, выбранными из атомов галогена), включая, не ограничиваясь этим, атом галогена, -О-(С₁-С₈ алкил), -О-(С₂-С₈ алкенил), -О-(С₂-С₈ алкинил), арил, -С(О)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH₂, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)₂, -NHC(O)R’, -SR’, -SO₃R’, -S(O)₂R’, -S(O)R’, -OH, =O, -NH₂, -NH(R’), -N(R’)₂ и -CN, где каждый R’ независимо выбран из -Н, -С₁-С₈ алкила, -С₂-С₈ алкенила, -С₂-С₈ алкинила или арила.

Если по контексту не указано иначе, то термины «алкенил» и «алкинил» относятся к незамещенным или необязательно замещенным (указаны) прямым или разветвленным углеводородным цепям, содержащим 2-20 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации пределов и конкретных чисел атомов углерода), притом что 2-3, 2-4, 2-8 или 2-10 атомов углерода являются предпочтительными. Алкенильная цепь содержит, по меньшей мере, одну двойную связь в цепи, и алкинильная цепь имеет, по меньшей мере, одну тройную связь в цепи. Примеры алкенильных групп включают, не ограничиваясь этим, этилен или винил, аллил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутеленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил и 2,3-диметил-2-бутенил. Примеры алкинильных групп включают, не ограничиваясь этим, ацетиленовую группу, пропаргил, ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил и 3-метил-1-бутинил.

Алкенильные и алкинильные группы, в виде заместителя или в виде части другой замещающей группы, в том случае, когда они замещены, могут быть замещены одной или более группами, предпочтительно 1-3 группами (и любыми дополнительными заместителями, выбранными из атомов галогена), включая, не ограничиваясь этим, атом галогена, -О-(С₁-С₈ алкил), -О-(С₂-С₈ алкенил), -О-(С₂-С₈ алкинил), арил, -С(О)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH₂, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)₂, -NHC(O)R’, -SR’, -SO₃R’, -S(O)₂R’, -S(O)R’, -OH, =O, -NH₂, -NH(R’), -N(R’)₂ и -CN, где каждый R’ независимо выбран из -Н, -С₁-С₈ алкила, -С₂-С₈ алкенила, -С₂-С₈ алкинила или арила.

Если по контексту не указано иначе, то термин «алкилен» относится к незамещенному насыщенному углеводородному радикалу с прямой или разветвленной цепью, содержащему 1-20 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации пределов и конкретных чисел атомов углерода), притом что 1-8 или 1-10 атомов углерода являются предпочтительными, и имеющему два одновалентных радикальных центра, образовавшихся в результате удаления двух атомов водорода от одного и того же или двух различных атомов углерода исходного алкана. Типичные алкилены включают, не ограничиваясь этим, метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, октилен, нонилен, декален, 1,4-циклогексилен и тому подобное.

Алкиленовые группы, в виде заместителя или в виде части другой замещающей группы, в том случае, когда они замещены, могут быть замещены одной или более группами, предпочтительно 1-3 группами (и любыми дополнительными заместителями, выбранными из атомов галогена), включая, не ограничиваясь этим, атом галогена, -О-(С₁-С₈ алкил), -О-(С₂-С₈ алкенил), -О-(С₂-С₈ алкинил), арил, -С(О)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH₂, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)₂, -NHC(O)R’, -SR’, -SO₃R’, -S(O)₂R’, -S(O)R’, -OH, =O, NH₂, -NH(R’), -N(R’)₂ и -CN, где каждый R’ независимо выбран из -Н, -С₁-С₈ алкила, -С₂-С₈ алкенила, -С₂-С₈ алкинила или арила.

Термин «алкенилен» относится к ненасыщенному углеводородному радикалу с разветвленной или прямой цепью или циклическому углеводородному радикалу алкенильной группы (как описано выше), имеющему два одновалентных радикальных центра, образовавшихся в результате удаления двух атомов водорода от одного и того же или двух различных атомов углерода исходного алкена. «Алкенилен» может быть незамещенным или необязательно замещенным (указано), как описано выше для алкенильных групп. В некоторых вариантах осуществления «алкенилен» является незамещенным.

Термин «алкинилен» относится к ненасыщенному углеводородному радикалу с разветвленной или прямой цепью или циклическому углеводородному радикалу алкинильной группы (как описано выше), и имеющему два одновалентных радикальных центра, образовавшихся в результате удаления двух атомов водорода от одного и того же и двух различных атомов углерода исходного алкина. «Алкинилен» может быть незамещенным или необязательно замещенным (указано), как описано выше для алкинильных групп. В некоторых вариантах осуществления «алкинилен» является незамещенным.

Если не указано иначе по контексту, то термин «арил» относится к замещенному или незамещенному одновалентному ароматическому углеводородному радикалу из 6-20 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации пределов и конкретных чисел атомов углерода), полученному удалением одного атома водорода от одного атома углерода исходной ароматической кольцевой системы. Некоторые арильные группы обозначаются в приводимых в качестве примера структурах как «Ar». Типичные арильные группы включают, не ограничиваясь этим, радикалы, полученные из бензола, замещенного бензола, фенила, нафталена, антрацена, бифенила и тому подобное.

Арильная группа, в виде заместителя или в виде части другой замещающей группы, может быть необязательно замещена одной или более группами, предпочтительно 1-5, или даже 1-2 группами, включая, не ограничиваясь этим, атом галогена, С₁-С₈ алкил, С₂-С₈ алкенил, С₂-С₈ алкинил, -О-(С₁-С₈ алкил), -О-(С₂-С₈ алкенил), -О-(С₂-С₈ алкинил), арил, -С(О)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH₂, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)₂, -NHC(O)R’, -SR’, -SO₃R’, -S(O)₂R’, -S(O)R’, -OH, -NO₂, -NH₂, -NH(R’), -N(R’)₂ и -CN, где каждый R’ независимо выбран из -Н, -С₁-С₈ алкила, -С₂-С₈ алкенила, -С₂-С₈ алкинила или арила.

Если не указано иначе по контексту, то термин «гетероцикл» относится к замещенной или незамещенной моноциклической кольцевой системе, содержащей 3-7 или 3-10 кольцевых атомов (также относящихся к членам кольца), в которой, по меньшей мере, один кольцевой атом представляет гетероатом, выбранный из N, O, P или S (и все комбинации и субкомбинации пределов и конкретных чисел атомов углерода и гетероатомов). Гетероцикл может содержать 1-4 кольцевых гетероатомов независимо выбранных из N, O, P или S. Один или более атомов N, O или S в гетероцикле могут быть окисленными. Моноциклический гетероцикл предпочтительно содержит 3-7 членов кольца (например, 2-6 атомов углерода и 1-3 гетероатомов, независимо выбранных из N, O, P или S). Кольцо, которое содержит гетероатом, может быть ароматическим или неароматическим. Если не указано иначе, то гетероцикл, соединен с его боковой группой по любому гетероатому или атому углерода, что приводит к обеспечению стабильной структуры.

Гетероциклы описаны Paquette, «Principles of Modern Heterocyclic Chemistry» (W.A. Benjamin, New York, 1968), в частности главы 1, 3, 4, 6, 7 и 9; «The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs» (John Wiley & Sons, New York, 1950 до настоящего времени), в частности тома 13, 14, 16, 19 и 28; и J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960). Примеры «гетероциклических» групп включают, в качестве примера и без ограничения, пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (пиперидил), тиазолил, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, фукозил, азиридинил, азетидинил, оксиранил, оксетанил и тетрагидрофуранил.

Гетероциклическая группа, в виде заместителя или в виде части другой замещающей группы, в том случае, когда она замещена, может быть замещена одной или более группами, предпочтительно 1-2 группами, включая, не ограничиваясь этим, -С₁-С₈ алкил, -С₂-С₈ алкенил, -С₂-С₈ алкинил, атом галогена, -О-(С₁-С₈ алкил), -О-(С₂-С₈ алкенил), -О-(С₂-С₈ алкинил), арил, -С(О)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH₂, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)₂, -NHC(O)R’, -SR’, -SO₃R’, -S(O)₂R’, -S(O)R’, -OH, -NH₂, -NH(R’), -N(R’)₂ и -CN, где каждый R’ независимо выбран из -Н, -С₁-С₈ алкила, -С₂-С₈ алкенила, -С₂-С₈ алкинила или арила.

В качестве примера и без ограничения связанные с углеродом гетероциклы, могут быть соединены в следующих положениях: положение 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина; положение 3, 4, 5 или 6 пиридазина; положение 2, 4, 5 или 6 пиримидина; положение 2, 3, 5 или 6 пиразина; положение 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола; положение 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола; положение 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола; положение 2 или 3 азиридина; или положение 2, 3 или 4 азетидина. Приведенные в качестве примера связанные с углеродом гетероциклы могут включать 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 5-пиридил, 6-пиридил, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил, 5-пиридазинил, 6-пиридазинил, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил, 6-пиримидинил, 2-пиразинил, 3-пиразинил, 5-пиразинил, 6-пиразинил, 2-тиазолил, 4-тиазолил или 5-тиазолил.

В качестве примера и без ограничения связанные с азотом гетероциклы, могут быть соединены в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина или 1Н-индазола; положении 2 изоиндола или изоиндолина, и положении 4 морфолина. Еще более типичные, связанные с азотом гетероциклы могут включать 1-азиридил, 1-азетидил, 1-пирролил, 1-имидазолил, 1-пиразолил и 1-пиперидинил.

Если не указано иначе, то термин «карбоцикл» относится к замещенной или незамещенной, насыщенной или ненасыщенной неароматической моноциклической кольцевой системе, содержащей 3-6 кольцевых атомов (и все комбинации и субкомбинации пределов и конкретных чисел атомов углерода), где все кольцевые атомы являются атомами углерода.

Карбоциклические группы, в виде заместителя или в виде части другой замещающей группы, в том случае, когда они замещены, могут быть замещены, например, одной или более группами, предпочтительно 1 или 2 группами (и любыми дополнительными заместителями, выбранными из атомов галогена), включая, не ограничиваясь этим, атом галогена, -С₁-С₈ алкил, -С₂-С₈ алкенил, -С₂-С₈ алкинил, -О-(С₁-С₈ алкил), -О-(С₂-С₈ алкенил), -О-(С₂-С₈ алкинил), арил, -С(О)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH₂, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)₂, -NHC(O)R’, -SR’, -SO₃R’, -S(O)₂R’, -S(O)R’, -OH, =O, -NH₂, -NH(R’), -N(R’)₂ и -CN, где каждый R’ независимо выбран из -Н, -С₁-С₈ алкила, -С₂-С₈ алкенила, -С₂-С₈ алкинила или арила.

Примеры моноциклических карбоциклических заместителей включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогептил, циклооктил, 1,3-циклогексадиенил, 1,4-циклогексадиенил, 1,3-циклогептадиенил, 1,3,5-циклогептатриенил и циклооктадиенил.

В том случае, если переменная имеется более чем один раз в любом заместителе или в любой формуле, то его определение в каждом случае является независимым по отношению к определению в каждом другом случае. Комбинации заместителей и/или переменных допустимы только, если такие комбинации приводят к стабильным соединениям.

Если не указано иначе по контексту, то термин «гифен»(-) означает точку присоединения к боковой молекуле. Следовательно, термин «-(С₁-С₁₀ алкилен)арил» или «-С₁-С₁₀ алкилен(арил)» относится к С₁-С₁₀ алкиленовому радикалу, имеющему значения, определенные выше, где алкиленовый радикал соединен с боковой молекулой по любому из атомов углерода алкиленового радикала, и один из атомов водорода, соединенный с атомом углерода алкиленового радикала, замещен арильным радикалом, имеющим значения, определенные выше.

В тех случаях, когда определенная группа «замещена», то группа может иметь один или более заместителей, предпочтительно от одного до пяти заместителей, более предпочтительно от одного до трех заместителей, наиболее предпочтительно от одного до двух заместителей, независимо выбранных из приведенного перечня заместителей. Однако, в общем, группа имеет любое число заместителей, выбранных из атома галогена.

Подразумевается, что определение любого заместителя или переменной в определенном положении в молекуле не зависит от его определений в другом месте в этой молекуле. Очевидно, понятно, что заместители и характер замещения в соединениях по данному изобретению могут быть выбраны специалистами в данной области для получения соединений, которые являются активными и химически стабильными, которые можно легко синтезировать методами, известными в данной области, а также способами, приведенными в данном документе.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает разрешенный регулирующим органом федерального или правительственного значения, или входящий в Фармакопею США, или другую широко признанную фармакопею, для применения у животных и, в частности, у людей. Термин «фармацевтически совместимый ингредиент» относится к фармацевтически приемлемому разбавителю, адъюванту, наполнителю или носителю, с которым вводят аналог фукозы.

Выражение «небольшие электроноакцепторные группы» относится к любому заместителю, который имеет более высокую электроотрицательность в месте присоединения заместителя, чем, например, атом водорода или гидроксильная группа, или по сравнению с заместителем, находящимся в фукозе в этом месте. В общем небольшая электроноакцепторная группа содержит 10 или менее атомов (других чем атом водорода) и включает группы, такие как нитро; циано и цианоалкил (например, -CH₂CH₂CN); галогены; ацетилен или другие алкины или галогеналкины (например, -C≡CCF₃); алкены или галогеналкены; аллены; карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды и их галогензамещенные формы; сульфоновая и фосфорная кислоты, сложные эфиры и амиды; и их галогензамещенные формы; галогеналкильные группы (например, -CF₃, -CHF₂, -CH₂CF₃), ацил и галогенацил (например, -С(О)СН₃ и -C(O)CF₃); алкилсульфонил и галогеналкилсульфонил (например, -S(O)₂алкил и -S(O)₂галогеналкил); арилокси (например, фенокси и замещенный фенокси); аралкилокси (например, бензилокси и замещенный бензилокси) и оксираны. Предпочтительные электроноакцепторные группы представляют группы, содержащие 8, 7 или 6, или менее атомов (других, чем атом водорода).

Как правило, аналоги фукозы представляют по существу чистые соединения, не содержащие нежелательных примесей. Это означает, что аналог обычно имеет чистоту, по меньшей мере, 50% мас./мас. (масса/масса), а также в основном не содержит интерферирующих белков и других примесей. В некоторых случаях агенты имеют чистоту, по меньшей мере, 80% мас./мас., более предпочтительно 90% или примерно 95% мас./мас. С использованием обычных методов очистки можно получить гомогенный продукт с чистотой, по меньшей мере, 99%.

Общая информация

Изобретение относится к способам и композициям для снижения фукозилирования белка у животных. Способы частично основаны на неожиданных результатах, представленных в разделе «Примеры», которые показывают, что введение аналога фукозы субъекту (например, млекопитающему) приводит к синтезу антитела или производного антитела, имеющего пониженное фукозилирование кора, и другие белки также имеют пониженный уровень фукозилирования. Выражение «пониженное фукозилирование» по отношению к белкам, в общем, относится к пониженному присоединению фукозы к гликанам через α(1,2)-, α(1,3)-, α(1,4)- и α(1,6)-связи. «Фукозилирование кора» по отношению к антителу относится к присоединению фукозы («фукозилированию») к N-ацетилглюкозамину («GlcNAc») в редуцирующем конце N-связанного гликана антитела. «Пониженное фукозилирование кора» по отношению к антителу относится к уменьшению количества фукозы, связанной с N-ацетилглюкозамином («GlcNAc») в редуцирующем конце N-связанного гликана антитела по сравнению с необработанным животным.

В различных аспектах, описанных в данном документе, животное, которому вводят аналог фукозы, как правило, представляет собой млекопитающее и предпочтительно является человеком. Следовательно, изобретение также относится к способам и композициям для снижения фукозилирования белка у млекопитающего, такого как человек.

В других аспектах изобретение относится к фармацевтическим композициям аналогов фукозы и фармацевтических наполнителей, в которых эффективное количество аналога(в) фукозы находится в смеси с наполнителями, подходящими для введения животному. В некоторых вариантах осуществления аналог фукозы находится в сухой форме (например, лиофилизированной), необязательно со стабилизаторами, которые повышают стабильность композиции при длительном хранении. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию аналогов фукозы и фармацевтических наполнителей формулируют для введения млекопитающему. В некоторых дополнительных вариантах осуществления фармацевтические композиции аналогов фукозы и фармацевтических наполнителей формулируют для введения человеку.

В некоторых вариантах осуществления фукозилирование сложных N-гликозид-связанных сахарных цепей, связанных с Fc-областью (или доменом) антитела, снижается. В том смысле, в котором в данном документе используется это выражение, «сложная N-гликозид-связанная сахарная цепь», как правило, связана с аспарагином 297 (согласно системе нумерации Kabat), хотя, сложная N-гликозид-связанная сахарная цепь может быть связана с другими остатками аспарагина. В том смысле, в котором в данном документе используется это выражение «сложная N-гликозид-связанная сахарная цепь» имеет биантенную составную сахарную цепь, в основном имеющую следующую структуру:

где ± указывает, что молекула сахара может присутствовать или отсутствовать, и число указывает положение связей между молекулами сахара. В приведенной выше структуре конец сахарной цепи, который связан с аспарагином, называется редуцирующим концом (справа), и противоположная сторона называется нередуцирующим концом. Фукоза обычно связана с N-ацетилглюкозамином («GlcNAc») редуцирующего конца, обычно α-1,6-связью (положение 6 GlcNAc связано с положением 1 фукозы). Сокращенное обозначение «Gal» относится к галактозе, и «Man» относится к маннозе.

«Сложная N-гликозид-связанная сахарная цепь» исключает высокоманнозный тип сахарной цепи, в котором только манноза включается в нередуцирующий конец структуры кора, но она включает 1) сложный тип, в котором сторона нередуцирующего конца структуры кора имеет одно или более разветвлений галактоза-N-ацетилглюкозамина (также относящегося к «gal-GlcNAc»), и сторона нередуцирующего конца Gal-GlcNAc необязательно содержит сиаловую кислоту, двурассекающую N-ацетилглюкозамин или тому подобное, или 2) гибридный тип, в котором сторона нередуцирующего конца структуры кора имеет разветвления высокоманнозной N-гликозид-связанной сахарной цепи и сложную N-гликозид-связанную сахарную цепь.

В некоторых вариантах осуществления «сложная N-гликозид-связанная сахарная цепь» включает сложный тип, в котором сторона нередуцирующего конца структуры кора имеет ноль, одно или более разветвлений галактоза-N-ацетилглюкозамина (также относящегося к «gal-GlcNAc»), и сторона нередуцирующего конца Gal-GlcNAc необязательно дополнительно содержит структуру, такую как сиаловая кислота, двурассекающую N-ацетилглюкозамин или тому подобное, но исключает цепи с высокоманнозным компонентом.

Согласно настоящему изобретению, как правило, только небольшое количество фукозы включается в сахарную цепь(и) (например, в гликан или сложные N-гликозид-связанные сахарные цепи) после введения аналога фукозы. Например, в различных вариантах осуществления менее чем примерно 60%, менее чем примерно 50%, менее чем примерно 40%, менее чем примерно 30%, менее чем примерно 20%, менее чем примерно 15%, менее чем примерно 10%, менее чем примерно 5% или менее чем примерно 1% антител в сыворотке крови животного (например, млекопитающего, такого как человек) являются фукозилированными в коре по сравнению с животным, не получившим аналог фукозы. В некоторых вариантах осуществления по существу отсутствуют (т.е. менее 0,5%) антитела в сыворотке крови животного, которые фукозилированы в коре, по сравнению с животным, не получавшим аналог фукозы.

В некоторых вариантах осуществления фукозилирование белков снижено примерно на 60%, примерно на 50%, примерно на 40%, примерно на 30%, примерно на 20%, примерно на 15%, примерно на 10%, примерно на 5% или примерно на 1%, для клеточных поверхностных белков у животного (например, млекопитающего, такого как человек), которые фукозилируются, по сравнению с животным, не получавшим аналог фукозы. В некоторых вариантах осуществления фукозилирование белков через α(1,2)-связь снижено примерно на 60%, примерно на 50%, примерно на 40%, примерно на 30%, примерно на 20%, примерно на 15%, примерно на 10%, примерно на 5% или примерно на 1%, для клеточных поверхностных белков у животного (например, млекопитающего, такого как человек), которые фукозилируются, по сравнению с животным, не получавшим аналог фукозы.

В некоторых вариантах осуществления фукозилирование белков через α(1,3)-связь снижено примерно на 60%, примерно на 50%, примерно на 40%, примерно на 30%, примерно на 20%, примерно на 15%, примерно на 10%, примерно на 5% или примерно на 1%, для клеточных поверхностных белков у животного (например, млекопитающего, такого как человек), которые фукозилируются, по сравнению с животным, не получавшим аналог фукозы. В некоторых вариантах осуществления фукозилирование белков через α(1,4)-связь снижено примерно на 60%, примерно на 50%, примерно на 40%, примерно на 30%, примерно на 20%, примерно на 15%, примерно на 10%, примерно на 5% или примерно на 1%, для клеточных поверхностных белков у животного (например, млекопита