Устойчивый к насекомым-вредителям и толерантный к гербицидам селекционный гибрид трансформанта сои pdab9582.814.19.1 и pdab4468.04.16.1

Устойчивый к насекомым-вредителям и толерантный к гербицидам селекционный гибрид трансформанта сои pdab9582.814.19.1 и pdab4468.04.16.1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники, предшествующий изобретению

[0001] Гены, кодирующие Cry1F и Cry1Ac synpro (Cry1Ac) способны обеспечивать устойчивость трансгенных растений к насекомым-вредителям, например устойчивость к чешуекрылым насекомым, и ген, кодирующий PAT (фосфинотрицинацетилтрансферазу) способен обеспечивать устойчивость трансгенных растений к гербициду фосфинотрицину (глуфосинату). PAT успешно экспрессировали в сое для использования в качестве селектируемуего маркера при получении устойчивых к насекомым-вредителям трансгенных культур и для обеспечения коммерческих уровней толерантности трансгенных культур к гербициду глуфосинату. При экспрессии в трансгенных растениях ген, кодирующий AAD-12 (арилоксиалканоатдиоксигеназу-12), способен обеспечивать коммерческие уровни толерантности к гербицидам на основе феноксиуксусной кислоты, 2,4-D и MCPA и гербицидам на основе пиридилоксиуксусной кислоты, триклопиру и флуроксипиру.

[0002] Известно, что на экспрессию чужеродных генов в растениях влияет их локализация в геноме растения, возможно, вследствие структуры хроматина (например, гетерохроматина) или близости регуляторных элементов транскрипции (например, энхансеров) рядом с участком интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet., 22:421-477, 1988). В то же время наличие трансгена при различных локализациях в геноме влияет на весь фенотип растения различными способами. По этой причине часто является необходимым проведение скрининга большого числа трансформационных событий для идентификации трансформационного события, характеризующегося оптимальной экспрессией представляющего интерес вводимого гена. Например, наблюдали, что у растений и у других организмов может существовать широкая вариация уровней экспрессии вводимого гена среди трансформационных событий. Также могут существовать различия в пространственных или временных паттернах экспрессии, например, различия относительной экспрессии трансгена в различных тканях растения, которые могут не соответствовать паттернам, прогнозируемым на основании регуляторных элементов транскрипции, содержащихся во вводимой генной конструкции. По этой причине, общепринято получают от сотен до нескольких тысяч различных трансформационных событий и проводят скрининг таких трансформационных событий для поиска одного трансформационного события, которое обладает желаемыми уровнями и паттернами экспрессии трансгена для коммерческих целей. Трансформационное событие, которое обладает желаемыми уровнями или паттернами экспрессии трансгена, является пригодным для интрогрессии трансгена в другие генетические среды, посредством полового ауткроссинга общепринятыми способами скрещивания. Потомство таких скрещиваний сохраняет характеристики экспрессии трансгена исходного трансформационного события. Такую стратегию используют для обеспечения надежной экспрессии гена в ряде сортов, которые хорошо адаптируются к условиям роста в определенной местности.

[0003] Для определения может ли потомство полового скрещивания содержать трансген или группу представляющих интерес трансгенов, желательно иметь возможность детектировать наличие конкретного трансформационного события или многих трансформационных событий. Кроме того, способ детекции конкретного трансформационного события или многих трансформационных событий может оказаться полезным для соблюдения правил, необходимых для предпродажного одобрения и маркировки пищевых продуктов, получаемых, например, из рекомбинантных сельскохозяйственных культур, или для применения в мониторинге окружающей среды, мониторинге следов культур в поле или мониторинге продуктов, получаемых из урожая культуры, а также для применения в обеспечении соблюдения сторон установленных нормативных условий или условий договора.

[0004] Наличие одного или нескольких трансгенных трансформационных событий можно детектировать посредством детекции любой нуклеиновой кислоты известным в данной области способом, включая, но, не ограничиваясь ими, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или гибридизацию ДНК с использованием зондов для нуклеиновых кислот. Такие способы детекции, как правило, направлены на часто используемые генетические элементы, такие как промоторы, терминаторы, маркерные гены и т.д., т.к. для многих ДНК-конструкций кодирующая область является взаимозаменяемой. В результате такие способы могут являться непригодными для идентификации различных трансформационных событий, в частности трансформационных событий, получаемых с использованием аналогичной ДНК-конструкции или очень сходных конструкций, за исключением тех случаев, когда последовательность ДНК, фланкирующая ДНК, смежная со встраиваемой гетерологичной ДНК, является известной. Например, в патентной заявке 2006/0070139 описан специфичный по отношению к трансформационному событию ПЦР анализ для трансформационного события кукурузы DAS-59122-7. Желательно иметь простой и дифференциальный способ идентификации селекционных гибридов трансформантов сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1.

Краткое описание сущности изобретения

[0005] Настоящее изобретение относится к новому устойчивому к насекомым-вредителям и толерантному к гербицидам трансгенному селекционному гибриду трансформанта сои, обозначаемому как трансформант сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. Этот селекционный гибрид содержит Cry1F, Cry1Ac и pat, как описано в настоящем описании, и aad-12 и pat, как описано в настоящем описании и в международной патентной заявке № WO/2012/075426, введенные в конкретные участки в геном клетки сои. Репрезентативные семена сои депонировали в American Type Culture Collection (ATCC) с № доступа, указанным в абзаце [0021]. ДНК растений сои, содержащих такое трансформационное событие, включают соединительные/фланкирующие последовательности, описываемые в настоящем описании, которые характеризуют локализацию встраиваемой ДНК в геном сои. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:15 являются диагностическими для трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. Более конкретно, последовательности, окружающие участки соединения при 1400/1401 п.н., 1536/1537 п.н. SEQ ID NO:1, 152/153 п.н. SEQ ID NO:2, 2730/2731 п.н. SEQ ID NO:15 и 9121/9122 п.н. SEQ ID NO:15, являются диагностическими для трансформационного события pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. В абзаце [0012] ниже описаны примеры последовательностей, содержащих эти участки соединения, которые представляют собой характерный признак ДНК сои, содержащей трансформационное событие сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1.

[0006] В одном из вариантов осуществления изобретение относится к растению сои или его части, которое является устойчивым к Pseudoplusia includens (соевой совке), и геном которой содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2, и п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, и одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15 и их комплементов. В другом варианте осуществления изобретение относится к семенам таких растений.

[0007] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу борьбы с насекомыми-вредителями, который включает подвергание воздействию насекомыми-вредителями устойчивых к насекомым-вредителям растений сои, где растения сои обладают геномом, который содержит один или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2 и п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, и одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15, и их комплементы, которые характеризуются содержанием трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1, чтобы таким образом бороться с насекомыми-вредителями. Наличие генов cry1F v3 (cry1F) и cry1Ac synpro (cry1Ac) в трансформационном событии сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 обеспечивает устойчивость, например, к Pseudoplusia includens (соевой совке), Anticarsia gemmatalis (гусенице бархатных бобов), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica и Elasmopalpus lignosellus.

[0008] В одном из вариантов осуществления изобретение относится к растению сои или его части, которое является толерантным к гербицидам на основе феноксиуксусной кислоты, таким как 2,4-D и MCPA. В другом варианте осуществления изобретение относится к растению сои или его части, которое является толерантным к гербицидам на основе пиридилоксиуксусной кислоты, таким как триклопир и флуроксипир. В этих вариантах осуществления растение сои обладает геномом, содержащим одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2, п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, и одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и, п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15, и их комплементов. В другом варианте осуществления изобретение относится к семенам таких растений.

[0009] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу борьбы с сорняками соевой культуры, который включает применение гербицидов на основе феноксиуксусной кислоты, таких как 2,4-D и MCPA. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу борьбы с сорняками соевой культуры, который включает применение гербицидов на основе пиридилоксиуксусной кислоты, таких как триклопир и флуроксипир, к соевой культуре, где соевая культура содержит растения сои, которые обладают геномом, содержащим одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2, п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, и одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15, и их комплементов. Наличие гена aad-12 в селекционном гибриде трансформанта сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 обеспечивает толерантность к гербицидам на основе феноксиуксусной кислоты и гербицидам на основе пиридилоксиуксусной кислоты.

[0010] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу борьбы с сорняками соевой культуры, который включает применение гербицида глуфосината к соевой культуре, где указанная соевая культура содержит растения сои, которые обладают геномом, содержащим одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2, п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, и одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15, и их комплементов, которые являются диагностическими для содержания трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. Наличие гена pat v6 (pat) в трансформационном событии сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 обеспечивает толерантность к гербициду глуфосинату.

[0011] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу детекции трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 в образце, содержащем ДНК сои, где указанный способ включает:

a) контактирование указанного образца с первым праймером длиной по меньшей мере 10 п.н., который селективно связывается с фланкирующей последовательностью в п.н. 1-1400 SEQ ID NO:1 или ее комплементе, и вторым праймером длиной по меньшей мере 10 п.н., который селективно связывается с встраиваемой последовательностью в п.н. 1401-1836 SEQ ID NO:1 или ее комплементом, и анализ ампликона, образуемого между указанными праймерами, или

b) контактирование указанного образца с первым праймером длиной по меньшей мере 10 п.н., который селективно связывается с встраиваемой последовательностью в п.н. 1-152 SEQ ID NO:2 или ее комплементе, и вторым праймером длиной по меньшей мере 10 п.н., который селективно связывается с фланкирующей последовательностью в п.н. 153-1550 SEQ ID NO:2 или ее комплементе, или

c) контактирование указанного образца с первым праймером длиной по меньшей мере 10 п.н., который селективно связывается с встраиваемой последовательностью в п.н. 2731-9121 SEQ ID NO:15 или ее комплементе, и вторым праймером длиной по меньшей мере 10 п.н., который селективно связывается с фланкирующей последовательностью в п.н. 1-2730 SEQ ID NO:15 или ее комплементе, или

d) контактирование указанного образца с первым праймером длиной по меньшей мере 10 п.н., который селективно связывается с встраиваемой последовательностью в п.н. 2731-9121 SEQ ID NO:15 или ее комплементе, и вторым праймером длиной по меньшей мере 10 п.н., который селективно связывается с фланкирующей последовательностью в п.н. 9122-10198 SEQ ID NO:15 или ее комплементе, и

c) анализ ампликона, образуемого между указанными праймерами.

[0012] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу детекции трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1, включающему:

a) контактирование указанного образца с первым праймером, который селективно связывается с фланкирующей последовательностью, выбранной из группы, состоящей из п.н. 1-1400 SEQ ID NO:1 и п.н. 153-1550 SEQ ID NO:2 и их комплементом, и вторым праймером, который селективно связывается с SEQ ID NO:3 или ее комплементом, и третьим праймером, который селективно связывается с фланкирующей последовательностью п.н. 1-2730 SEQ ID NO:15 и п.н. 9122-10198 SEQ ID NO:15, и их комплементом; и четвертым праймером, который селективно связывается с встраиваемой последовательностью 2731-9121 SEQ ID NO:15 и ее комплементом.

b) подвергание указанного образца полимеразной цепной реакции и

c) анализ ампликона, образуемого между указанными праймерами.

[0013] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу селекции растения сои, включающему: скрещивание первого растения со вторым растением сои с получением третьего растения сои, где указанное первое растение, содержит ДНК, содержащую одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2 и п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, и одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15 и их комплементов, и анализ указанного третьего растения сои на содержание ДНК, содержащей одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2, п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15 и их комплементов.

[0014] В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной молекуле ДНК, которая является диагностической для трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. Такие молекулы наряду с SEQ ID NO:1, 2 и 15 включают молекулы длиной по меньшей мере 25 п.н., содержащие п.н. 1400-1401 SEQ ID NO:1 и по меньшей мере 10 п.н. SEQ ID NO:1 в каждом направлении от п.н. 1400/1401 участка соединения; ампликоны длиной по меньшей мере 25 п.н., содержащие 152-153 SEQ ID NO:2 и по меньшей мере 10 п.н. SEQ ID NO:2 в каждом направлении от п.н. 152/153 участка соединения; ампликоны длиной по меньшей мере 25 п.н., содержащие п.н. 2730-2731 SEQ ID NO:15 и по меньшей мере 10 п.н. SEQ ID NO:15 в каждом направлении от п.н. 2730/2731 участка соединения; ампликоны длиной по меньшей мере 25 п.н., содержащие п.н. 9121-9122 SEQ ID NO:15 и по меньшей мере 10 п.н. SEQ ID NO:15 в каждом направлении от п.н. 9121/9122 участка соединения. Примеры представляют собой п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2 и п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15, и их комплементы.

[0015] В другом варианте осуществления изобретение относится к способу борьбы с вредителями зерна сои, семян или жмыха, который включает введение трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 в указанное зерно, семена или жмых, как продемонстрировано указанным зерном, семенами или жмыхом, содержащим ДНК, содержащую одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 1385-1415 SEQ ID NO:1, п.н. 1350-1450 SEQ ID NO:1, п.н. 1300-1500 SEQ ID NO:1, п.н. 1200-1600 SEQ ID NO:1, п.н. 137-168 SEQ ID NO:2, п.н. 103-203 SEQ ID NO:2 и п.н. 3-303 SEQ ID NO:2, и одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.н. 2680-2780 SEQ ID NO:15, п.н. 2630-2830 SEQ ID NO:15, п.н. 2530-2930 SEQ ID NO:15, п.н. 9071-9171 SEQ ID NO:15, п.н. 9021-9221 SEQ ID NO:15 и п.н. 8921-9321 SEQ ID NO:15 и их комплементов.

[0016] Изобретение также включает клетки растения и части растения сои, включая, но, не ограничиваясь ими, пыльцу, семязачаток, цветы, побеги, корни и листья, и ядра вегетативных клеток, клеток пыльцы, семян и жмыха и яйцеклетки, которые содержат трансформационное событие сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 селекционного гибрида.

[0017] В некоторых вариантах осуществления трансформационное событие сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 селекционного гибрида можно комбинировать с другими признаками, включая, например, другой ген(ы) толерантности к гербицидам и/или подавляющих рост насекомых белков и регуляторные последовательности транскрипции (т.е. РНК-интерференцию, дцРНК, факторы транскрипции и т.д.). Можно осуществлять стэкинг дополнительных признаков в геноме растения путем селекции растений, повторной трансформации трансгенного растения, содержащего трансформационное событие сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 селекционного гибрида, или добавления новых признаков путем направленной интеграции.

[0018] Другие варианты осуществления включают эксцизию полинуклеотидных последовательностей, которые содержат трансформационное событие сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 селекционного гибрида, включая, например, экспрессионную кассету гена pat. В результате эксцизии полинуклеотидной последовательности модифицированное трансформационное событие можно перенаправлять на конкретный участок хромосомы, где проходит стэкинг дополнительных полинуклеотидных последовательностей совместно с трансформационным событием сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 селекционного гибрида.

[0019] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к участку-мишени хромосомы сои, локализованному в хромосоме 02 между фланкирующими последовательностями, указанными в SEQ ID NO:1 и 2.

[0020] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к участку-мишени хромосомы сои, локализованному в хромосоме 04 между фланкирующими последовательностями, указанными в SEQ ID NO:15.

[0021] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения трансгенного растения сои, включающему введение гетерологичной нуклеиновой кислоты в положение в хромосоме 02 между геномными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:1 и 2, т.е. между п.н. 1-1400 SEQ ID NO:1 и п.н. 153-1550 SEQ ID NO:2.

[0022] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения трансгенного растения сои, включающему введение гетерологичной нуклеиновой кислоты в положение в хромосоме 04 между геномными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:15, т.е. между п.н. 1-2730 SEQ ID NO:15 и п.н. 9122-10198 SEQ ID NO:15.

[0023] Кроме того настоящее изобретение относится к анализам детекции наличия рассматриваемого трансформационного события в образце (например, сои). Анализы могут быть основаны на последовательности ДНК рекомбинантной конструкции, встраиваемой в геном сои, и на геномных последовательностях, фланкирующих участок вставки. Также предоставлены наборы и условия, пригодные для проведения анализов.

[0024] Настоящее изобретение частично относится к клонированию и анализу последовательностей ДНК граничных областей, получаемых в результате введения Т-ДНК из pDAB9582 и pDAB4468 в трансгенные линии сои. Эти последовательности являются уникальными. На основании встраиваемой и соединительной последовательностей могут существовать специфичные для трансформационного события праймеры и их получали. ПЦР анализ демонстрировал, что эти трансформационные события можно идентифицировать анализом ПЦР-ампликонов, получаемых с использованием таких наборов специфичных для трансформационного события праймеров. Таким образом, эти и другие связанные способы можно использовать для уникальной идентификации линий сои, содержащих трансформационное событие по настоящему изобретению.

Депонирование семян

[0025] В качестве части настоящего изобретения депонировали по меньшей мере 2500 семян линии сои, содержащей трансформационное событие сои pDAB9582.814.19.1, и 2500 семян линии сои, содержащей трансформационное событие сои pDAB4468.04.16.1, и обеспечивали общественный без ограничения (но при условии патентных прав) в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Депозиты, обозначаемые как № ATCC депозита PTA-10442 (pDAB4468.04.16.1) и № ATCC депозита (pDAB9582.814.19.1), регистрировали от имени Dow AgroSciences LLC 22 октября, 2009 года и соответственно. Эти депозиты вносили, и их будут поддерживать в соответствии и по условиям Будапештского договора в отношении депозитов семян для целей патентной процедуры.

Краткое описание последовательностей

[0026] SEQ ID NO:1 представляет собой 5'-фланкирующую граничную последовательность ДНК для трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1. Нуклеотиды 1-1400 представляют собой геномную последовательность. Нуклеотиды 1401-1535 представляют собой реаранжированную последовательность из pDAB9582. Нуклеотиды 1536-1836 представляют собой встраиваемую последовательность.

[0027] SEQ ID NO:2 представляет собой 3'-фланкирующую граничную последовательность ДНК для трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1. Нуклеотиды 1-152 представляют собой встраиваемую последовательность. Нуклеотиды 153-1550 представляют собой геномную последовательность.

[0028] SEQ ID NO:3 представляет собой последовательность ДНК pDAB9582, которая аннотирована ниже в таблице 1.

[0029] SEQ ID NO:4 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81419_FW3 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

[0030] SEQ ID NO:5 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81419_RV1 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

[0031] SEQ ID NO:6 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81419_RV2 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

[0032] SEQ ID NO:7 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81419_RV3 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

[0033] SEQ ID NO:8 представляет собой олигонуклеотидный праймер 5'IREnd-0l для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

[0034] SEQ ID NO:9 представляет собой олигонуклеотидный праймер 5'IREnd-02 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

[0035] SEQ ID NO:10 представляет собой олигонуклеотидный праймер AtUbi10RV1 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

[0036] SEQ ID NO:11 представляет собой олигонуклеотидный праймер AtUbi10RV2 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

[0037] SEQ ID NO:12 представляет собой олигонуклеотидный праймер 3'PATEnd05 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

[0038] SEQ ID NO:13 представляет собой олигонуклеотидный праймер 3'PATEnd06 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

[0039] SEQ ID NO:14 представляет собой подтвержденную последовательность трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1. Включая 5'-фланкирующую геномную последовательность, pDAB9582T-вставку цепи и 3'-фланкирующую геномную последовательность.

[0040] SEQ ID NO:15 представляет собой подтвержденную последовательность трансформационного события сои pDAB4468.04.16.1. Включая 5'-фланкирующую геномную последовательность, pDAB4468T-вставку цепи и 3'-фланкирующую геномную последовательность.

Краткое описание чертежей

[0041] Фиг.1 представляет собой карту плазмиды pDAB9582, содержащей экспрессионные кассеты cry1F, cry1Ac и pat.

[0042] На фиг.2 проиллюстрированы локализации праймеров для подтверждения 5'- и 3'-граничной последовательности трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1.

[0043] На фиг.3 проиллюстрировано расположение геномной последовательности в трансформационном событии сои pDAB9582.814.19.1.

Подробное описание изобретения

[0044] Секвенировали и характеризовали фланкирующие последовательности встраивания трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. Разрабатывали специфические по отношению к трансформационному событию анализы. Также их картировали в геноме сои (хромосома сои 02 и 04). Трансформационные события можно совместно интрогрессировать в дополнительные элитные линии.

[0045] Как указано выше в разделе уровень техники, предшествующий изобретению, введение и интеграция трансгена в геном растения включает некоторые случайные трансформационные события (таким образом, используют название "трансформационное событие" для данной вставки). Таким образом, многими способами трансформации, такими как опосредованная Agrobacterium трансформация, биолистическая трансформация (т.е. генная пушка) и опосредованная карбидом кремния трансформация (т.е. WHISKERS™), невозможно прогнозировать, где в геноме встроится трансген. Таким образом, определение фланкирующей геномной ДНК растения на обеих сторонах вставки может являться важным для идентификации растения, которое содержит данное трансформационное событие вставки. Например, можно конструировать праймеры для ПЦР, которые образуют ПЦР-ампликон между соединительной областью вставки и генома хозяина. Такой ПЦР-ампликон можно использовать для идентификации уникального или отдельного типа трансформационного события встраивания.

[0046] В настоящем описании предоставлены определения и примеры с целью облегчения описания настоящего изобретения и для руководства для специалистов в данной области для практического осуществления изобретения. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с их общепринятым использованием специалистами в соответствующей области. Используют такую номенклатуру для оснований ДНК, как указанная в 37 CFR §1.822.

[0047] Как используют в настоящем описании, термин "потомство" означает потомство любой генерации родительского растения, которое содержит трансформационное событие сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 селекционного гибрида.

[0048] Трансгенное "трансформационное событие" получают трансформацией растительных клеток гетерологичной ДНК, т.е. конструкцией нуклеиновой кислоты, которая содержит представляющие интерес трансгены, восстановлением популяции растений, получаемых в результате встраивания трансгена в геном растения, и отбором конкретного растения, характеризующегося конкретной локализацией в геноме. Термин "трансформационное событие" относится к исходному трансформанту и потомство трансформанта, которые содержат гетерологичную ДНК. Термин "трансформационное событие" также относится к потомству, получаемому половым ауткроссингом трансформанта и другого сорта, который содержит геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного обратного скрещивания с рекуррентным родителем, встраиваемая трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК) от трансформированного родителя содержится у потомства скрещивания в аналогичной локализации в хромосоме. Термин "трансформационное событие" также относится к ДНК от исходного трансформанта и его потомства, содержащего встраиваемую ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно прилегающую к встраиваемой ДНК, для которой предполагают, что она передастся потомству, которое получает встраиваемую ДНК, содержащую представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая содержит встраиваемую ДНК (например, исходный трансформант и потомство, получаемое в результате самоопыления) и родительской линии, которая не содержит встраиваемую ДНК.

[0049] "Соединительная последовательность" или "граничная последовательность" включает точку, в которой страиваемая в геном ДНК является соединенной с ДНК нативного генома сои, фланкирующей точку встраивания, где идентификация или детекция одной или других соединительных последовательностей в генетическом материале растения является достаточной для диагностики трансформационного события. Также включены последовательности ДНК, которые включают вставки в описываемых в настоящем описании трансформационных событиях сои и аналогичные длины фланкирующей ДНК. В настоящем описании предоставлены конкретные примеры таких диагностических последовательностей, однако, другие последовательности, которые перекрывают участки соединения вставок или соединения вставок и геномной последовательности, также являются диагностическими, и их можно использовать по настоящему изобретению.

[0050] Настоящее изобретение частично относится к идентификации трансформационного события с использованием таких фланкирующих, соединительных и встраиваемых последовательностей. Соответствующие праймеры для ПЦР и ампликоны также входят в изобретение. В соответствие с настоящим изобретением можно использовать способы ПЦР анализа с использованием ампликонов, которые охватывают встраиваемую ДНК и ее границы, для детекции или идентификации находящихся в продаже трансгенных сортов или линий сои, получаемых из трансгенных линий сои объекта собственности.

[0051] Фланкирующие/соединительные последовательности являются диагностическими для трансформационного события сои pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 селекционного гибрида. На основании этих последовательностей получали специфичные к трансформационному событию праймеры. ПЦР анализ демонстрировал, что эти линии сои можно идентифицировать в различных генотипах сои посредством анализа ПЦР-ампликонов, получаемых с использованием таких наборов специфичных к трансформационному событию праймеров. Таким образом, эти и другие связанные способы можно использовать для уникальной идентификации этих линии сои. Последовательности, определяемые в настоящем описании, являются уникальными.

[0052] Способы детекции по настоящему изобретению являются особенно пригодными в сочетании с селекцией растений для определения, какие растения потомства содержат данное трансформационное событие после того, как родительское растение, содержащее представляющее интерес трансформационное событие, скрещивают с другой линией растений с целью внесения одного или более дополнительных представляющих интерес признаков в потомство. Такие способы ПЦР анализа являются полезными для программ селекции сои, а также для контроля качества, в частности для находящихся в продаже трансгенных семян сои. В настоящее время также можно получать и использовать наборы для детекции ПЦР для таких трансгенных линий сои. Это также может быть полезным для регистрации продуктов и управления качеством продукта.

[0053] Кроме того, фланкирующие/геномные последовательности сои можно использовать для конкретной идентификации локализации в геноме каждой вставки. Эту информацию можно использовать для получения системы молекулярных маркеров, специфических для каждого трансформационного события. Их можно использовать для способов ускоренной селекции и для установления данных сцепления.

[0054] Кроме того, информацию о фланкирующей последовательности можно использовать для исследования и характеристики способов интеграции трансгена, характеристики участков геномной интеграции, сортировки трансформационных событий, стабильности трансгенов и их фланкирующих последовательностей и экспрессии гена (в частности, связанной с выключением генов, паттернами метилирования трансгенов, эффектов положения и потенциальных связанных с экспрессией элементов, таких как MARS [участки прикрепления к матриксу] и т.п.).

[0055] В свете описания предмета изобретения следует понимать, что настоящее изобретение включает семена, доступные по № ATCC депозита, указанному в абзаце [0021]. Настоящее изобретение также включает толерантное к гербицидам растение сои, выращенное из семян, депонированных с № ATCC депозита, указанным в абзаце [0021]. Настоящее изобретение дополнительно включает части указанного растения, такие как листья, образцы ткани, семена, продуцируемые указанным растением, пыльцу и т.п. (где они содержат cry1F, cry1Ac, pat, и SEQ ID NO:1 и 2 наряду с aad-12, pat и SEQ ID NO:15).

[0056] Кроме того, настоящее изобретение включает растения потомков и/или потомства растений, выращенных из депонированных семян, предпочтительно устойчивого к гербицидам растения сои, где указанное растение, обладает геномом, содержащим детектируемую соединительную последовательность дикого типа, как описано в настоящем описании. Как используют в настоящем описании, термин "соя" означает Glycine max и включает все его сорта, которые можно выводить из растения сои.

[0057] Настоящее изобретение дополнительно включает способы проведения скрещиваний с использованием растения по настоящему изобретению в качестве по меньшей мере одного родителя. Например, настоящее изобретение включает гибридное растение F₁, имеющее в качестве одного или обоих родителей любое из растений, иллюстрируемых в настоящем описании, включая, но, не ограничиваясь тем, что оно имеет одного родителя, содержащего трансформационное событие сои pDAB9582.814.19.1, и другого родителя, содержащего pDAB4468.04.16.1. Также настоящее изобретение относится к семенам, продуцируемым такими гибридами F₁ по настоящему изобретению. Настоящее изобретение включает способ получения семян гибрида F₁ путем скрещивания иллюстративного растения с отличным (например, инбредным родителем) растением и сбора получаемых семян гибрида. Настоящее изобретение включает иллюстративное растение, которое представляет собой материнскую форму или отцовскую форму. Характеристики получаемых растений можно улучшать путем тщательного рассмотрения родительских растений.

[0058] Устойчивое к насекомым-вредителям/толерантное к 2,4-D/ толерантное к глуфосинату растение сои по настоящему изобретению можно размножать сначала половым скрещиванием первого родительского растения сои, состоящего из растения сои, выращенного из семян любой из линий, указанных в настоящем описании, и второго родительского растения сои, таким образом, получая ряд растений первого потомства; затем отбирая растение первого потомства, которое является устойчивым к глуфосинату и/или 2,4-D; проводя самоопыление растения первого потомства, таким образом, получая ряд растений второго потомства, а затем отбирая из растений второго потомства растение, которое является устойчивым к глуфосинату и/или 2,4-D. Эти этапы могут дополнительно включать обратное скрещивание растения первого потомства или растения второго потомства со вторым родительским растением сои или третьим родительским растением сои. Затем можно культивировать культуру сои, содержащую семена сои по настоящему изобретению или их потомство.

[0059] Также следует понимать, что два различных трансгенных растения также можно связывать (mated) с получением потомства, которое содержит два независимо сегрегированных, добавленных экзогенных гена. Самоопылением соответствующего потомства можно получать растение, которое является гомозиготным по обоим добавленным экзогенным генам. Также предусмотрены обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением в виде вегетативного размножения. Другие способы селекции, широко используемые для различных признаков и культур, являются известными в данной области. Размножение обратным скрещиванием используют для переноса генов для просто наследуемого, высоконаследуемого признака в желаемый гомозиготный культивар или инбредную линию, которая представляет собой рекуррентного родителя. Источник признака, который необходимо переносить, называют донорным растением. Ожидают, что получаемое растение обладает характеристиками рекуррентного родителя (например, культивара) и желаемым признаком, переносимым от донорного родителя. После первичного скрещивания отбирают индивидуумов, обладающих фенотипом донорного родителя, и повторно скрещивают (проводят обратное скрещивание) с рекуррентным родителем. Ожидают, что получаемый родитель обладает характеристиками рекуррентного родителя (например, культивара) и желаемым признаком, переносимым от донорного родителя.

[0060] Аналогично, устойчивое к насекомым-вредителям/толерантное к 2,4-D/толерантное к глуфосинату растение сои по настоящему изобретению можно трансформировать дополнительными трансгенами способами, известными в данной области. Способы трансформации, такие как опосредо