Получение иммуноглобулинов с пониженным содержанием тромбогенных агентов и иммуноглобулиновая композиция

Получение иммуноглобулинов с пониженным содержанием тромбогенных агентов и иммуноглобулиновая композиция

Реферат

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к препарату иммуноглобулина, содержащему низкий уровень тромбогенных агентов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Препараты иммуноглобулина для внутривенного введения (IVIG) часто используют в лечении различных состояний иммунологической недостаточности, а также аутоиммунных расстройств, включая болезнь Вагнера, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, болезнь Кавасаки и синдром Гийена-Барре. Некоторые тромбоэмболические нежелательные явления связывают с использованием препаратов IVIG (Brannagan et al. Complications of intravenous immune globulin treatment in neurologic disease. Neurology 1996 г.; 47:674–677; Rosenbaum JT. Myocardial infarction as a complication of immunoglobulin therapy. Arthritis Rheum 1997 г.; 40:1732–1733; и Dalakas MC. High-dose intravenous immunoglobulin and serum viscosity: risk of precipitating thromboembolic events. Neurology 1994 г.; 44:223–226).

Эти явления, которые включают в себя глубокий венозный тромбоз и инфаркт миокарда, в основном наблюдают у пациентов, получающих высокие дозы IVIG, и связывают их с повышением уровня вязкости крови (Dalakas MC. 1994 г.; и Reinhart WH, Berchtold PE. Effect of high-dose intravenous immunoglobulin therapy on blood rheology. Lancet 1992 г.; 339:662–664).

Ранее компоненты контактной системы свертывания крови были определены в препаратах иммуноглобулина человека (Alving et al. Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulin preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med 1980 г.; 96:334–346). В коммерческих препаратах сывороточного иммуноглобулина было отмечено содержание различных уровней активатора прекалликреина (PKA) и активности калликреина. Эти виды активности представляли интерес ввиду своей способности производить биоактивные пептиды, которые могут повышать проницаемость сосудов. Ранее полагали, что присутствие вазоактивных фрагментов этих белков связано с редкими нежелательными явлениями во время приема препаратов иммуноглобулина. Также эти авторы обнаружили фактор XI (FXI) в препаратах иммуноглобулина (Alving et al. 1980 г.).

В статье Alving et al. (1980 г.) проанализированы двадцать пять наборов коммерческого сывороточного иммуноглобулина (ISG) на наличие PKA и калликреина, компонентов контактной системы активации, которые могли содействовать этим реакциям путем формирования кининов в реципиентах. Активность калликреина находилась в пределах от необнаруживаемых уровней до >60% общей потенциальной активности калликреина в нормальной плазме. Уровень PKA находился в пределах от 5% до 3950% от активности в контрольных белковых фракциях плазмы, что вызывало гипотензию. Кроме пяти наборов, все остальные наборы повысили проницаемость сосудов морской свинки. Пять наборов, не вызвавших повышения проницаемости сосудов, также продемонстрировали самый низкий уровень PKA и активности калликреина. Во время проведения гель-хроматографии препарата иммуноглобулина с целью отделения ферментных контаминантов от иммуноглобулина G только части, содержащие PKA и/или калликреин, повышали проницаемость сосудов. Несколько наборов IVIG сокращали неактивированное парциальное тромбопластиновое время нормальной плазмы с 236 секунд до 38–55 секунд. Во время гель-хроматографии активность коагулянта элюировали в положении, соответствующем молекулярной массе 150 000, ингибированной антителами к фактору XI человека. Эти данные свидетельствуют о том, что фактор XIa отвечает за наблюдаемую активность прокоагулянта, и что PKA и/или калликреин являются потенциальными посредниками вазоактивных реакций на препарат IVIG.

Было также обнаружено, что иммуноглобулины загрязняют препараты фактора XI. Фактор XI и иммуноглобулины совместно очищают на последовательных ионообменных колонках, что требует присоединения специальной колонки для аффинной хроматографии с конкавалином A для устранения следов загрязнения иммуноглобулином из фактора XI (Bonno BN, Griffin JH. Human blood coagulation factor XI: purification, properties, and mechanism of activation by activated factor XII. J Biol Chem 1977 г.; 252:6432–6437).

Wolberg et al. (Coagulation Factor XI Is a Contaminant in Intravenous Immunoglobulin Preparations. Am J Hem 2000 г.; 65:30–34) продемонстрировали наличие прокоагулянта, известного под названием активированный фактор XI, в препаратах иммуноглобулина (IgG). В настоящем исследовании двадцать девять образцов иммуноглобулина для внутривенного введения (IVIG) от восьмерых различных производителей были проанализированы на наличие активности прокоагулянта. Двадцать шесть из этих образцов сократили время свертывания дефицитной по фактору XI плазмы. Из них в четырнадцати образцах была отмечена активность фактора XI на уровне более 0,001 ЕД/мл выше показателей нормальной объединенной плазмы. Остальные образцы имели менее 0,001 ЕД/мл активности нормальной плазмы. Активность прокоагулянта в этих образцах могла быть ингибирована поликлональным анти-фактор XI антителом, в предположении, что активность прокоагулянта принадлежала фактору XI. После хранения при температуре 4°C на протяжении 4 недель активность прокоагулянта повысилась в двух образцах, что может быть результатом самоактивации фактора XIa. Кроме того, активность в некоторых образцах IVIG могла непосредственно активировать фактор IX, что означает присутствие активированного фактора XI в этих образцах.

За последние три столетия было разработано множество способов очистки иммуноглобулинов для внутривенного введения, чтобы удовлетворить возросший спрос на IVIG. Большинство производственных процессов включает в себя различные технологии поглощения иммуноглобулина на специальной, обычно ионообменной смоле (Jerry Siegel. The Product: All Intravenous Immunoglobulins Are Not Equivalent. The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy. Том 25, выпуск 11, часть 2, ноябрь 2005 г.). Поглощение иммуноглобулина на смоле требует очень много средств и времени, поскольку используется большое количество смолы. В среднем один литр ионообменной смолы поглощает приблизительно 30–50 г иммуноглобулина. Таким образом, использование обычной большой колонки емкостью приблизительно 100 л смолы позволяет получить 3–5 кг иммуноглобулина. Поглощение агентов, присутствующих в растворе иммуноглобулина, с помощью небольшой колонки является экономически выгодным.

В патенте США 5252217 раскрывается приготовление концентрата человеческого фактора XI путем нанесения криопреципитатной надосадочной жидкости на этапе фильтрования-адсорбции и одного этапа хроматографии на катионообменной смоле. Полученный концентрат идеально подходит для терапевтических целей во время заместительной терапии в случае дефицита фактора XI. Катионообменную смолу уравновешивают буферным раствором с pH от 5,5 до 6,5, предпочтительно pH 6.

В патенте США 4272521 раскрывается способ удаления активатора прекалликреина (PKA) и активируемого калликреином предшественника PKA (фактора XII) из раствора сывороточного иммуноглобулина (ISG) с помощью ионообменного вещества при pH ≥ 7,2.

В патенте США 5164487 раскрывается способ производства препарата переносимого иммуноглобулина-G для внутривенного введения, свободного от скоплений, вазоактивных веществ и протеолитических ферментов. Исходный материал обрабатывают с помощью 0,4–1,5% от объема октановой кислоты с последующей хроматографией, особенно на ионо- или катионообменной установке или на гидрофобной матрице.

В заявке на патент США 2010/0311952 раскрывается способ очистки иммуноглобулина, включающий этапы, на которых наносят водный буферный раствор, содержащий иммуноглобулин в мономерной и агрегированной форме, на катионообменный материал при условии, что иммуноглобулин не связывается с катионообменным материалом, а также восстанавливают иммуноглобулин в мономерной форме из раствора после контакта с катионообменным материалом.

В заявке на международный патент PCT №WO 2010/072381 раскрывается способ очистки иммуноглобулина, включающий этапы, на которых наносят водный буферный раствор, содержащий иммуноглобулин в мономерной, агрегированной и фрагментированной форме, на материал для анионообменной хроматографии при условии, что иммуноглобулин в мономерной форме не связывается с анионообменным материалом, а также восстанавливают иммуноглобулин в мономерной форме в элюате материала для анионообменной хроматографии, где pH водного буферного раствора принимает значения в диапазоне от 8,0 до 8,5. В одном варианте осуществления изобретения материалом для анионообменной хроматографии является мембранный материал для анионообменной хроматографии.

Jose et al. (2010 г.) описали, что пастеризация в процессе производства иммуноглобулина для внутривенного введения инактивирует некоторые тромбогенные агенты, например коагулирующие фрагменты. Однако в этом способе не предусмотрена избирательная инактивация, что может изменить активность раствора иммуноглобулина.

Таким образом, необходимо разработать способ избирательного удаления тромбогенного агента из раствора иммуноглобулина без оказания какого-либо влияния на иммуноглобулин.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу для специфического удаления PKA, калликреина и/или FXI(a) из препарата иммуноглобулина. В одном варианте осуществления настоящего изобретения препарат иммуноглобулина получают из крови или фракции крови.

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ удаления тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора, включающий следующие этапы, на которых получают содержащий иммуноглобулин раствор с pH в диапазоне от выше 3,8 до значений, равных или ниже 5,3; получают подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы; приводят в контакт раствор с подложкой; а также собирают несвязанную фракцию I.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора составляет приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения несвязанная фракция I далее приходит в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы с таким же значением pH, а несвязанная фракция II собирается.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения подложка представлена в форме хроматографического материала или хроматографической мембраны.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения материал подложки или мембраны является гидрофильным и выбран из группы, состоящей из агарозы, сефарозы, акриловых гранул, целлюлозы, стекла с контролируемым размером пор, силикагеля и декстранов; или гидрофобным и выбран из группы, состоящей из смол или органических синтетических полимеров, выбранных из группы, состоящей из материалов или мембран на основании полиакриламидов или полистиролов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения отрицательно заряженные группы иммобилизованы на подложке посредством линкера между подложкой и отрицательно заряженными группами.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения линкер выбран из группы, состоящей из белков, аминокислот и пептидов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложка химически модифицирована.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложкой служит слабый или сильный катионообменник.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные отрицательно заряженные группы выбирают из группы, состоящей из производных сульфоновой кислоты и других серосодержащих кислот, фосфорной и других фосфорсодержащих кислот, нитратов и других азотсодержащих кислот и их комбинаций.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные отрицательно заряженные группы представляют собой серосодержащие кислоты, например сульфопропил.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные отрицательно заряженные группы представляют собой карбоновые кислоты, например карбоксиметил.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этапы, на которых регулируют несвязанную фракцию I или несвязанную фракцию II до значений pH в диапазоне от 7 до 8,2; приводят несвязанную фракцию I или несвязанную фракцию II в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы со значениями pH в диапазоне от 7 до 8,2; и собирают несвязанную фракцию.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этапы, на которых регулируют и приводят в контакт раствор и подложку, содержащую иммобилизованные положительно заряженные группы со значениями в диапазоне от 7 до 8,2, до приведения раствора в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы; и собирают несвязанную фракцию.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные положительно заряженные группы выбирают из группы, состоящей из аммония, алкиламмония, диалкиламмония, триалкиламмония, четвертичного аммония, алкильных групп, H⁺, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, http://en.wikipedia.org/wiki/Amine, функциональной аминогруппы и их комбинации.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные положительно заряженные группы представляют собой четвертичный аммоний. Четвертичным аммонием может быть диэтиламиноэтил (DEAE).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ включает в себя этапы, на которых приводят в контакт раствор и подложку, содержащую иммобилизованные положительно заряженные группы со значениями pH в диапазоне от 7 до 8,2; собирают несвязанную фракцию; регулируют pH несвязанной фракции до значений в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3; приводят в контакт несвязанную фракцию и подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы со значениями pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3; и собирают несвязанную фракцию I.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения приведение в контакт раствора и подложки, содержащей положительно заряженные группы, проводят при линейной скорости в диапазоне от 1 до 2 мл/мин/см², при этом температура содержащего иммуноглобулин раствора находится в диапазоне от 8 до 37°C.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этапы, на которых приводят в контакт раствор и хроматографический материал, содержащий трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер, до приведения в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы; и собирают несвязанную фракцию III.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этапы, на которых приводят в контакт несвязанную фракцию, несвязанную фракцию I или несвязанную фракцию II с хроматографическим материалом, содержащим трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер; и собирают несвязанную фракцию III.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложка, содержащая иммобилизованные положительно заряженные группы, представляет собой слабый или сильный анионообменник.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения иммуноглобулиновой композиции, который включает в себя этапы, на которых содержащий иммуноглобулин раствор подвергают по меньшей мере двум этапам отрицательной хроматографии: анионообменной хроматографии при значениях pH в диапазоне от 7 до 8,2 с последующей катионообменной хроматографией при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят дважды. В одном варианте осуществления изобретения две катионообменные хроматографии проводят последовательно.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этап проведения отрицательной хроматографии с помощью хроматографического материала, содержащего трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменник представлен в форме мембраны.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменник содержит функциональную сульфоновую группу.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуноглобулиновой композиции, полученной из крови или фракций крови, содержащих 4%–10% белка, которую можно получить в соответствии со способом настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также предоставляет контейнер, содержащий иммуноглобулиновую композицию в соответствии с настоящим изобретением.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения субъекта с иммунодефицитом, воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием или острой инфекцией, согласно которому требуется введение субъекту эффективного количества иммуноглобулиновой композиции в соответствии с настоящим изобретением.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу удаления тромбогенных агентов из препарата иммуноглобулина. В одном варианте осуществления настоящего изобретения препарат иммуноглобулина получен из крови или фракций крови. В другом варианте осуществления настоящего изобретения кровь или фракции крови получены от более чем одного донора или от множества доноров.

Настоящее изобретение продемонстрировало, что FXI и/или его активную форму, FXIa, можно эффективно удалить из содержащего иммуноглобулин раствора путем обработки раствора иммуноглобулина катионообменной хроматографией при уровне pH не менее 6. Оптимальные результаты были получены в диапазоне значений pH от выше 3,8 до равных или ниже 5,3. Этот диапазон значений pH продемонстрировал способность эффективного удаления FXIa с одновременным по существу сохранением уровней иммуноглобулина (IgG).

Эти результаты были неожиданными, поскольку иммуноглобулин (с изоэлектрической точкой 6–8, патенты США №№ 6592905 и 4296027) имеет положительный чистый электрический заряд при значениях pH ниже 6, поэтому ожидалось его связывание также и с катионообменником с последующим получением низкого уровня иммуноглобулина в растворе (патент США № 6592905).

Поскольку отсутствует механизм связывания, оказывается, что при значениях pH ниже 6 FXIa и иммуноглобулин конкурируют за отрицательно заряженные группы на катионообменнике, и связывание FXIa является более предпочтительным.

Также неожиданно было обнаружено, что в соответствии с настоящим изобретением можно достичь более высокой эффективности удаления FXIa из содержащего иммуноглобулин раствора путем обработки раствора иммуноглобулина на катионообменнике при значениях pH в диапазоне от 4,0 до 4,3. Эти результаты также неожиданны ввиду того, что FXIa имеет положительный чистый заряд в широком диапазоне значений pH, включая значения до приблизительно 9 (его изоэлектрическая точка - 8,9-9,1; каталог реагентов для исследований компании Haematologic Technologies Inc.). Неожиданно было обнаружено, что эти результаты были получены с помощью либо слабого катионообменника, либо сильного катионообменника.

Согласно настоящему изобретению было также обнаружено, что калликреин (с изоэлектрической точкой 8,6-9,5) может быть эффективно удален из содержащего иммуноглобулин раствора путем катионообменной хроматографии при уровне значений pH 4,1-4,3 с одновременным по существу сохранением уровней IgG. Эти результаты неожиданны в свете того, что иммуноглобулин имеет положительный чистый электрический заряд в этом диапазоне значений pH, поэтому от него также ожидается связывание с катионообменником, что приводит к низкому уровню иммуноглобулина в растворе.

Результаты демонстрируют максимальное удаление тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора путем применения к раствору катионообменника в очень узком диапазоне значений pH с одновременным поддержанием неизменного уровня иммуноглобулина в растворе.

Эти результаты проложили путь разработкам способа удаления тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора с одновременным сохранением большей части иммуноглобулина в растворе и/или без изменения распределения иммуноглобулинов на подклассы (например, IgG1 - приблизительно 65%, IgG2 -приблизительно 30%, IgG3 - приблизительно 6% и IgG4 - приблизительно 1%). Термин «сохранение большей части иммуноглобулина в растворе» означает, что способ предусматривает восстановление 75% и более иммуноглобулина от исходного содержания иммуноглобулина до приведения раствора в контакт с подложкой в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ предусматривает восстановление 80%, 85%, 90%, 95% и 99% иммуноглобулина от исходного содержания иммуноглобулина до приведения раствора в контакт с подложкой в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение предоставляет способ удаления тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора, включающий в себя этапы, на которых получают раствор иммуноглобулина с pH в диапазоне значений от выше 3,8 до равных или ниже 5,3; получают подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы; приводят в контакт раствор и подложку; а также собирают несвязанную фракцию. В одном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0. В другом варианте осуществления настоящего изобретения диапазон значений соответствует от или выше 4,0 до равных или ниже 5,0. В другом варианте осуществления диапазон охватывает значения от выше 3,8 до равных или ниже 4,7, например, pH 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7. В дополнительном варианте осуществления диапазон охватывает значения от выше 3,8 до равных или ниже 4,3. В дополнительном варианте осуществления диапазон охватывает значения от выше 4,0 до равных или ниже 5,3. В другом дополнительном варианте осуществления диапазон является очень узким, от значений, равных или выше 4,0, до значений, равных или ниже 4,3 или от приблизительно 4,1 до приблизительно 4,3 и позволяет специально удалять FXIa и калликреин.

Термин «тромбогенный агент» относится к агенту, обладающему способностью стимулировать образование фибриновых сгустков. В настоящем документе термин «тромбогенный агент» взаимозаменяем терминами «гемостатический агент», «тромбозный агент» и «прокоагулирующий агент». Например, тромбогенным агентом может являться калликреин, FXI, FXIa, фактор XII, тромбин и PKA. Термин «тромбогенный агент» включает в себя тромбогенные индуцированные агенты и «агенты, вызывающие тромбоз», в частности агенты, активирующие тромбогенные факторы в коагулирующей системе.

В настоящем документе термин «подложка» включает в себя носитель или какую-либо матрицу, используемую для присоединения, иммобилизации, перемещения или стабилизации отрицательно заряженных групп. Подложки хорошо известны в области применения, как описано в работе Hermanson et al. Immobilized Affinity Ligand Techniques (Academic Press Inc. 1992 г.). Подложка для выполнения способа настоящего изобретения может быть изготовлена из любого материала, способного связывать молекулу, содержащую отрицательно заряженные группы. Твердые подложки включают в себя, без ограничений, матрицы, колонки, покровные стекла, хроматографические материалы, фильтры, предметные стекла, пробирки, ампулы, бутылки, подложки для ELISA, стеклянные или пластиковые поверхности, хроматографические мембраны, листы, частицы, гранулы, включая магнитные микроносители, гели, порошки, волокна и т.п.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложка представлена в форме хроматографического материала. В другом варианте осуществления настоящего изобретения подложка представлена в форме хроматографической мембраны. Подложка может содержать гидрофильный материал, например агарозу, сефарозу, акриловые гранулы, целлюлозу, стекло с контролируемым размером пор, силикагель, декстраны; гидрофобный материал, например смолы; или органический искусственный/синтетический полимер, например материалы на основе полиакриламидов или полистиролов. Типичные материалы/полимеры доступны в продаже под торговыми названиями Sephacryl® (Pharmacia, Швеция), Ultragel® (Biosepara, Франция), TSK-Gel Toyopearl® (Toso Corp., Япония), ГЭМА (Alltech Ass. (Диэрфилд, штат Иллинойс, США), Eupergit® (Rohm Pharma, г. Дармштадт, Германия). Доступны также материалы на основе азлактонов (3M, г. Сент-Пол, штат Миннесота, США). В особенности предпочтительными являются Agarose® или Sepharose®. Эти материалы доступны в продаже, например, у компании Sigma, г. Сент-Луис. Хроматографический материал может быть суспендирован в соответствующей среде, и полученную суспензию можно использовать, например, в хроматографической колонке. Однако способ настоящего изобретения может также выполняться по партиям, например, с помощью пробирки или реактора периодического действия. В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложка представляет собой полимерную матрицу FRACTOGEL® EMD, TOYOPEARL® или TSK-GEL®.

Хроматография на колонке известна в области применения (Practical Protein Chromatography, под редакцией Kenney и Fowell, том 11, Humana Press, 1992 г.) и по существу этот термин относится к технологии, согласно которой раствор (подвижная фаза) может опускаться вниз по колонке, а индивидуальный компонент адсорбируют в неподвижной фазе, например, с помощью хроматографического материала. Термин «отрицательно заряженные группы» относится к молекуле, содержащей химические группы, несущие отрицательный заряд, например, производные сульфоновой кислоты или другие серосодержащие кислоты (например, SO₄^2- и SO₃^-), муравьиная кислота и другие карбоновые кислоты (например, COO^-), а также фосфорная и другие фосфорсодержащие кислоты (например, PO₄^3-), нитраты и другие азотсодержащие кислоты (например, NO²) и их комбинации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения отрицательно заряженные группы представляют собой серосодержащие кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения отрицательно заряженные группы представляют собой сульфопропил (SP). В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения заряженные группы представляют собой карбоновые кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения отрицательно заряженные группы представляют собой карбоксиметил (CM).

Подложка может иметь гидрофобную или гидрофильную поверхность, связывающую часть отрицательно заряженных групп с помощью гидрофобного/гидрофильного ковалентного взаимодействия. Гидрофобной/гидрофильной поверхностью подложки может также служить полимер, такой как пластик или какой-либо другой полимер, в котором гидрофобные/гидрофильные группы связаны с полиэтиленом, полистиролом или поливинилом. Альтернативно отрицательно заряженные группы могут иметь ковалентную связь с подложкой посредством линкера, служащего мостом между подложкой и отрицательно заряженными группами. Используемый выше термин «линкер» относится к спейсерной группе или цепи, молекулярная масса которой составляет от десятков до миллионов дальтонов, используемой в качестве промежуточного соединителя между подложкой и отрицательно заряженными группами. Например, линкер может представлять собой белок, пептид и/или аминокислоту. Если подложка непосредственно связывает молекулу, содержащую отрицательно заряженные группы (без линкера), может использоваться реакционноспособная группа внутри молекулы, содержащей отрицательно заряженные группы, например, гидроксильную группу, эфир, аминогруппу или карбоксильную группу для присоединения к реакционноспособной группе, присутствующей на подложке, с целью создания ковалентной связи. Подложка также может иметь заряженную поверхность или может быть модифицирована для переноса заряженной группы, взаимодействующей с отрицательно заряженными группами. Подложка также может содержать другие реакционно-способные группы, которые могут быть химически активированы с целью присоединения отрицательно заряженных групп, например матриц, активируемых бромидом цианогена, эпоксиактивируемых матриц и т.п. Также подложка может содержать такой неорганический носитель, как оксид кремния, например силикагель, с которым могут ковалентно связываться заряженные группы. В другом варианте осуществления заряженные группы присоединены к поверхности мембраны или встроены в мембрану. Возможно присоединение заряженных групп к мембране вышеописанным способом.

Катионообменник, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может быть представлен в форме мембраны или в форме хроматографического материала согласно приведенному выше описанию.

Обычно подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы, называют катионообменником. Катионообменники получили свое название за способность привлекать или связывать катионы или положительно заряженные частицы. Обычно система подложки имеет отрицательный заряд и молекула присоединяется при значении pH, которое соотносится с положительным чистым зарядом молекулы. Примерами доступных в продаже катионообменников в форме мембраны служат мембрана Mustang® S и капсула Mustang® S, содержащие функциональную сульфоновую группу.

В случае использования мембраны в качестве подложки (например мембраны Mustang® S, капсулы Mustang® S), возможно приведение раствора иммуноглобулина в контакт с мембраной при скорости потока текучей среды в диапазоне от 2 до 4,3 объема мембраны (MV)/мин. Термин «скорость потока текучей среды» обычно относится к потоку раствора сквозь подложку.

Термин «изоэлектрическая точка» относится к значению pH, при котором молекула не несет чистого заряда. Ниже значения изоэлектрической точки молекула несет чистый положительный заряд, а выше этого значения - чистый отрицательный заряд.

Подложка, содержащая отрицательно заряженные группы, может быть слабым (например, карбоксиметиловая (CM) колонка) или сильным катионообменником (например мембрана Mustang® S). Под слабым катионообменником обычно подразумевают обменник, образованный из слабой кислоты, постепенно теряющей свой заряд со снижением pH, в то время как под сильным катионообменником обычно подразумевают обменник, образованный из сильной кислоты, способной удерживать свой заряд в широком диапазоне pH.

Термин «приведение в контакт» относится к любому виду комбинированных действий, посредством которых раствор или фракцию приводят в достаточно близкий контакт с подложкой таким образом, что между заряженными группами и каким-либо партнером по связыванию, например, тромбогенным агентом, присутствующим в растворе/фракции, происходит связывающее взаимодействие. Возможно проведение инкубации раствора/фракции с подложкой на протяжении достаточного периода времени, который позволяет связывание между заряженными группами и тромбогенным агентом. Во время взаимодействия с подложкой температура раствора/фракции может находиться в диапазоне от 7°C до 37°C.

Благодаря настоящему изобретению было обнаружено, что проведение этапа второй катионообменной хроматографии приводит к повышенному удалению FXIa из содержащего иммуноглобулин раствора по сравнению с одним этапом катионообменной хроматографии. Этот второй этап катионообменной хроматографии проводился с по существу сохранением уровней иммуноглобулина. Таким образом, раствор может взаимодействовать с подложкой несколько раз. Альтернативно, если подложка представляет собой фильтр, возможно сочетание нескольких фильтров в одном функциональном блоке. В одном варианте осуществления настоящего изобретения этап первичного фильтрования приводит к получению несвязанной фракции I, которую приводят в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, в таком же диапазоне pH, как указано выше, и собирают вторую несвязанную фракцию II.

Возможно уравновешивание подложки до приведения в контакт раствора/фракции с буфером, например, путем мойки подложки с помощью буфера содержащего иммуноглобулин раствора.

Термин «уравновешивать» обычно относится к возможности достижения колонкой или подложкой специального состояния буфера, например, специального уровня pH и/или ионной силы.

Термин «несвязанная фракция» обычно относится к фильтрату, полученному или собранному после приведения в контакт содержащего иммуноглобулин раствора и подложки, содержащей заряженные группы, или фильтрат, полученный или собранный после приведения в контакт содержащего иммуноглобулин раствора/фракции и подложку для хроматографии.

В одном варианте осуществлен