Антикластериновые антитела и антигенсвязывающие фрагменты и их использование для уменьшения объема новообразований

Антикластериновые антитела и антигенсвязывающие фрагменты и их использование для уменьшения объема новообразований

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к анти-кластериновым антителам и к их использованию для уменьшения объема новообразований. Более конкретно, изобретение относится к гуманизированным антителам, гибридным антителам и антигенсвязывающему фрагменту, связывающемуся с кластерином и их использованию для уменьшения объема опухоли, для ингибирования роста опухоли и метастазов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Наиболее частые злокачественные образования у людей - карциномы - происходят из эпителиальных клеток. Прогрессирование эпителиального рака начинается с разрушения межклеточных контактов и приобретения миграционного фенотипа (мезенхимального типа). Этот феномен, называемый эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП), считается ключевым на поздних стадиях прогрессирования опухоли и метастазирования.

Секретируемый белок TGF-β (трансформирующий фактор роста) вначале подавляет выраженный рост опухоли вследствие его ингибирующего действия на клетки эпителиального происхождения, а на поздних стадиях ускоряет прогрессирование опухоли и метастазирование. Один из механизмов, по которому TGF-β может стимулировать прогрессирование опухоли - индукция ЭМП.

Вследствие двойной роли TGF-β в развитии рака, использование прямых ингибиторов TGF-β может быть рискованным, поскольку, хотя они могут оказывать благоприятное действие на поздних стадиях опухолей, но, в то же время, они могут способствовать развитию предраковых поражений. Более подходящим был бы препарат, который ингибирует про-онкогенное ЭМП-стимулирующее действие TGF-β, но не ингибирует супрессивное воздействие на рост опухоли, оказываемое TGF-β. Чтобы разработать такой ингибитор, необходимо определить точку, при которой происходит раздвоение сигнального пути TGF-β, в одной ветви которого медиаторы участвуют в ЭМП-ответе, но не участвуют в ингибировании роста опухоли, оказываемом TGF-β. Лекарственные препараты, ингибирующие медиаторы, которые действуют исключительно в ветви ЭМП-ответа TGF-β сигнального пути, будут уменьшать метастазирование, не способствуя образованию предраковых поражений.

До настоящего времени не было выявлено специфических компонентов TGF-β сигнального пути, ускоряющих или опосредующих ЭМП-действие TGF-β, которые бы не участвовали в ингибировании роста, оказываемом TGF-β.

Наоборот, был установлен эндогенный белок (ядерный фактор YY1), который способен воздействовать (обратно ускорению) на онкогенное действие ЭМП, оказываемое TGF-β, не затрагивая подавление опухоли (ингибирование роста) (Kurisaki et al., 2004).

Известны ингибиторы, направленные на лиганды TGF-β, его рецепторы и сигнальные белки Smad. Растворимые эктодомены рецепторов, антитела и иные связывающие белки способны оказывать антагонистическое воздействие при взаимодействии с лигандами TGF-β и их секвестировании из рецепторов, расположенных на поверхности клеток. Известны небольшие молекулы, которые ингибируют киназную активность TGF-β рецептора I типа, а также эндогенные ингибиторы сигнальных белков Smad. Поскольку все эти компоненты сигнального пути вовлечены как в прокарциногенное так и в антикарциногенное воздействия TGF-β, эти ингибиторы могут оказывать благоприятное влияние при новообразованиях поздних стадий, но, в то же время, могут способствовать образованию предраковых поражений.

В международной патентной заявке PCT/CA2006/001505, поданной 13 сентября 2006 и опубликованной 22 марта 2007 WO2007/030930, описаны анти-кластериновые антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые направлены против специфического эпитопа кластерина и способные ингибировать эпителиально-мезенхимальный переход клеток карциномы. В данной патентной заявке более конкретно описана способность анти-кластериновых антител ингибировать ЭМП карциномы предстательной железы и карциномы молочной железы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, в одном аспекте, к антителу, способному к специфическому связыванию с кластерином и содержащему гуманизированный вариабельный регион легкой цепи и/или гуманизированный вариабельный регион тяжелой цепи.

Более конкретно, настоящее изобретение предоставляет гуманизированные антитела нечеловеческого происхождения, способные специфически связываться с кластерином, а также гибридные антитела и антигенсвязывающий фрагмент.

Гуманизированные или гибридные антитела по настоящему изобретению включают вариабельный регион легкой цепи и вариабельный регион тяжелой цепи, которые могут содержать нечеловеческие аминокислотные последовательности области, определяющей комплементарность и человеческие аминокислотные последовательности каркасной области натурального человеческого антитела.

Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающему фрагменту, который включает вариабельный регион легкой цепи и вариабельный регион тяжелой цепи, которые могут содержать нечеловеческие аминокислотные последовательности области, определяющей комплементарность и человеческие аминокислотные последовательности каркасной области.

Антитела и антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут использоваться для ингибирования эпителиально-мезенхимального перехода, индуцируемого кластерином.

В ином аспекте настоящее изобретение относится к анти-кластериновому антителу (поликлональному антителу, моноклональному антителу, химерному антителу, гуманизированному антителу, изолированному человеческому антителу, гибридному антителу или их фрагменту), используемому для уменьшения объема опухоли и к способам его получения.

Также настоящее изобретение охватывает изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельный регион легкой цепи и/или вариабельный регион тяжелой цепи гуманизированного антитела, гибридного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе или изолированного антитела, описанного в данном документе.

Также изобретение охватывает вектор или конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе. В соответствии с данным изобретением, вектор может являться, к примеру, но не ограничиваясь перечисленным, вектором экспрессии млекопитающего, бактериальным вектором экспрессии и т. д.

Изобретение также относится к клеткам, содержащим или экспрессирующим антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно данному изобретению или содержащим нуклеиновые кислоты или векторы согласно данному изобретению.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет набор, включающий флакон или флаконы, которые могут содержать, к примеру, гуманизированное антитело, описанное в данном документе, гибридное антитело, описанное в данном документе, антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, изолированное антитело, описанное в данном документе, изолированную нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе, либо вектор, описанный в данном документе.

В ином аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая может содержать, к примеру, гуманизированное антитело, описанное в данном документе, гибридное антитело, описанное в данном документе, антигенсвязывающий регион, описанный в данном документе, изолированное антитело, описанное в данном документе и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте, изобретение относится к комбинированной терапии, включающей фармацевтическую композицию, описанную в данном документе и химиотерапевтический препарат.

Помимо этого, изобретение охватывает способы получения гуманизированных или гибридных анти-кластериновых антител или антигенсвязывающих фрагментов, а также способы лечения болезней, ассоциированных с экспрессией или секрецией кластерина при помощи гуманизированных или гибридных анти-кластериновых антител или антигенсвязывающих фрагментов.

Охват, применимость и преимущества настоящего изобретения следуют из нелимитирующего детального описания, приведенного ниже. Необходимо понимать, что данное детальное описание, показывая приблизительные воплощения изобретения, приведено лишь в качестве примера, со ссылкой на сопутствующие фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Гомологическая 3D-модель вариабельного региона мышиного анти-кластеринового антитела 16B5. Помечены определяющие комплементарность области (L1, L2, L3 в легкой цепи, H1, H2, H3 в тяжелой цепи). Мышиные каркасные остатки, замещенные на человеческие каркасные остатки, показаны в виде сферических моделей.

Фигура 2. Выравнивание последовательности мышиного 16B5, гуманизированного 16B5 и выбранной каркасной человеческой области (с указанными ссылками на базу данных NCBI). Нумерация Kabat обозначена сверху. Выделены области, определяющие комплементарность. Остатки, представляющие интерес для обратных мутаций выделены ниже выравнивания последовательности в соответствии с близостью к определяющим комплементарность областям (5: в пределах 5 ангстрем), нахождением на поверхности (B: скрытые) и контактом с парными вариабельными регионами.

Фигура 3. Кинетический анализ мышиных антител 16B5 и гуманизированных анти-кластериновых антител.

Фигура 4. Блокирование h16B5 миграции раковых клеточных линий. В анализе способом царапины на клетках мышиной карциномы молочной железы h16B5 обладает, по меньшей мере, такой же активностью, что и мышиный 16B6. На фигуре ниже показана способность антител в различных конфигурациях блокировать миграцию клеток in vitro.

Фигура 5. Уменьшение инвазивности клеток рака предстательной железы человека при ингибировании, оказываемом h16B5. Нижняя часть 12-луночных планшетов была покрыта 200 мкл матригеля, обедненного факторами роста (Becton Dickinson). Клетки (2,5×10⁴) были ресуспендированы в 200 мкл матригеля, помещенного сверху, затем сверху матригеля добавили 500 мкл питательной среды для роста клеток. В каждый слой матригеля и в среду добавили h16B5 в концентрации 8 мкг/мл. Планшеты были инкубированы при 37°C в течение 3 недель, питательную среду (+/- h16B5) обновляли еженедельно. Стрелками показаны области роста клеток эпителиального типа.

Фигура 6. Уменьшение роста опухолей и увеличение их чувствительности к химиотерапии при обработке опухолей предстательной железы антителами h16B5. Клетки рака предстательной железы DU145 (2×10⁶) были имплантированы подкожно мышам с ТКИН, опухоли выращивали до достижения объема, равного, примерно, 100 мм3. Размеры опухолей измеряли два раза в неделю при помощи цифрового штангенциркуля, объемы опухолей рассчитывали по формуле L×W×H (длина×ширина×высота). В каждой группе было по 8 животных, проходивших рандомизацию до начала процедур. Результаты выражались в мм³ ± стандартная погрешность средней величины. p-величины определялись по t-тесту Стьюдента.

Фигура 7. Гомологическая 3D-модель вариабельного регионамышиного анти-кластеринового антитела 21B12. Помечены определяющие комплементарность области (L1, L2, L3 в легкой цепи, H1, H2, H3 в тяжелой цепи). Мышиные каркасные остатки, замещенные на человеческие каркасные остатки, показаны в виде сферических моделей.

Фигура 8. Выравнивание последовательности мышиного 16B5, гуманизированного 21B12 и выбранной каркасной человеческой области (с указанными ссылками на базу данных NCBI). Нумерация Kabat обозначена сверху. Выделены области, определяющие комплементарность. Остатки, представляющие интерес для обратных мутаций выделены ниже выравнивания последовательности в соответствии с близостью к определяющим комплементарность областям (5: в пределах 5 ангстрем), нахождением на поверхности (B: скрытые) и контактом с парными вариабельными фрагментами.

Фигура 9. Кинетический анализ мышиных антител 21B12 и гуманизированных анти-кластериновых антител.

Фигура 10. Ингибирование, оказываемое h16B5 на рост опухолей предстательной железы РС-3. Клетки рака предстательной железы ЗС-3 (2×10⁶) были имплантированы подкожно мышам с ТКИН, опухоли выращивали до достижения объема, равного, примерно, 100 мм³. Размеры опухолей измеряли два раза в неделю при помощи цифрового штангенциркуля, объемы опухолей рассчитывали по формуле L×W×H (длина×ширина×высота). В каждой группе было по 8 животных, проходивших рандомизацию до начала процедур. Результаты выражались в мм³ ± стандартная погрешность средней величины.

Фигура 11. Экспрессия кластерина опухолями поджелудочной железы человека. У мышей с ТКИН были выращены опухоли, происходящие из клеточных линий рака поджелудочной железы (как показано), далее они были отобраны, зафиксированы в формалине, были изготовлены срезы, которые изучались иммуногистохимическим способом с использованием h16B5. Положительное окрашивание было визуализировано стандартными способами с использованием вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена. В аналогичных условиях проводились эксперименты отрицательного контроля с использованием контролируемых по изотипу антител.

Фигура 12. Блокирование h16B5 миграции клеточных линий рака поджелудочной железы. Клетки PANC-1 были высеяны на среду без сыворотки в верхнюю камеру 24-луночного планшета Transwell, содержащую барьер матригеля. Нижние лунки были заполнены средой, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки в качестве хемоаттрактанта. После 24-часовой инкубации в присутствии и отсутствии TGFβ и/или h16B5 (как указано), клетки в слое матригеля были окрашены и подсчитаны.

Фигура 13. Поглощение раковыми клетками секретируемого кластерина. Рекомбинантный человеческий кластерин экспрессировался в клетках 293-6E, очищался и помечался Alexa Fluor 488 при помощи доступного в продаже набора для внедрения меток (Invitrogen). Клетки мышиной карциномы молочной железы BRI-JM01 были высеяны на покровные стекла и обработаны 250 нг/мл меченного секретированного кластерина. С установленными временными интервалами, клетки промывались ледяным фосфатно-солевым буферным раствором и фиксировались в 2% параформальдегиде. Стекла устанавливали на Antifade Gold, делали снимки флуоресцентным микроскопом.

Фигура 14. Ингибирование интернализации секретируемого кластерина раковыми клетками при помощи H16B5. Эксперимент проводился так, как описано в подписи к фигуре 13. H16B5 добавлялся в концентрации 10 мкг/мл.

Фигура 15. Показана область гомологии человеческого кластерина (NP_001822) и мышиного кластерина (NP_038520).

Фигура 16. Показано связывание h16B5 (помеченного AB-16B5 на фигуре) с мышиным кластерином, экспрессированы в зафиксированных замороженных срезах, полученных из опухолей молочной железы мыши 4T1. Эксперимент проводился с использованием иммуногистохимического способа, детектирование осуществлялось с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в одном аспекте к антителам, способным к специфическому связыванию с кластерином и содержащим гуманизированный вариабельный регион легкой цепи и/или гуманизированный вариабельный регион тяжелой цепи.

Последовательность человеческого кластерина доступна по номеру доступа RefSeq; NM_001831.2 (ID белка=NP_001822), последовательность мышиного кластерина доступна по номеру доступа RefSeq; NM_013492.2 (ID белка = NP_038520).

Антитела или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть способны к связыванию с мышиной и/или человеческой формой кластерина. Антитела или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению может, также, быть способен связываться с природным вариантом и синтетическими вариантами кластерина, имеющими, по меньшей мере, 75% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) идентичность в аминокислотной последовательности с человеческим или мышиным кластерином.

Настоящее изобретение предоставляет гуманизированные антитела нечеловеческого происхождения, способные специфически связываться с кластерином или его антигенсвязывающим фрагментом, а также гибридные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты.

В соответствии с воплощением изобретения, гуманизированное или гибридное антитело может ингибировать (понижать) рост опухолевой клетки, экспрессирующей или секретирующей кластерин.

В соответствии с последующим воплощением изобретения, гуманизированное или гибридное антитело может уменьшать объем опухоли, содержащей клетки, экспрессирующие или секретирующие кластерин.

В соответствии с иным воплощением изобретения, гуманизированное или гибридное антитело может ингибировать (понижать) миграцию или инвазию опухолевых клеток, экспрессирующих или секретирующих кластерин.

В соответствии с еще одним воплощением изобретения, гуманизированное или гибридное антитело может ингибировать (понижать) метастазирование опухолевых клеток, экспрессирующих или секретирующих кластерин.

В ином аспекте, настоящее изобретение относится к способу уменьшения объема опухоли, содержащей кластерин-экспрессирующие клетки, который может включать введение анти-кластеринового антитела (поликлонального антитела, моноклонального антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела, изолированного человеческого антитела, гибридного антитела или его фрагмента) млекопитающему, испытывающему в этом необходимость. Более конкретно, способ включает введение химерных, гуманизированных или гибридных антител.

В одном воплощении гибридное антитело или его фрагмент могут содержать, к примеру, вариабельный регион легкой цепи гуманизированного антитела и вариабельный регион тяжелой цепи гуманизированного антитела.

В ином воплощении гибридное антитело или его фрагмент могут содержать, к примеру, вариабельный регион легкой цепи нечеловеческого антитела и вариабельный регион тяжелой цепи гуманизированного антитела.

Термин «антитело» относится к интактному антителу, моноклональному, (полностью или частично) гуманизированному, гибридному, химерному или поликлональному антителу, а также к изолированным человеческим антителам. Термин «антитело», также, охватывает мультиспецифические антитела, например, биспецифические. Человеческие антитела, как правило, состоят из двух легких и двух тяжелых цепей, каждая из которых содержит вариабельные и постоянные участки. Вариабельный участок легкой цепи содержит 3 области, определяющих комплементарность (CDR), обозначенных в данном документе как CDRL1, CDRL2 и CDRL3, фланкированных каркасными областями. Вариабельный участок тяжелой цепи содержит 3 области, определяющих комплементарность (CDR), обозначенных в данном документе как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, фланкированных каркасными областями.

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, содержащему от одной до шести областей, определяющих комплементарность, включающих нечеловеческие аминокислотные последовательности областей, определяющих комплементарность и у которых значительная часть каркасных областей тяжелой и/или легкой цепей соответсвует человеческим антителам. В некоторых случаях, каркасные области тяжелой и/или легкой цепей гуманизированных антител полностью идентичны с областями антител, закодированных в человеческом спектре антител (натуральных природных антител). В иных случаях, каркасные области тяжелой и/или легкой цепей гуманизированных антител могут содержать от одной до тридцати аминокислот гуманизируемого нечеловеческого антитела, с остальной частью последовательности, происходящей от натурального человеческого антитела. В других случаях, гуманизированное антитело может содержать от 1 до 6 полностью нечеловеческих определяющих комплементарность областей, часто шесть определяющих комплементарность областей полностью происходят от нечеловеческих антител. В иных случаях «гуманизированное антитело» может содержать постоянную область человеческого или иного (например, от млекопитающего) происхождения.

Термин «гибридное антитело» относится к антителу, в котором одна из вариабельных областей тяжелой или легкой цепей (тяжелая или легкая цепь) гуманизирована или происходит от натурального природного антитела (имеющего аффинность к кластерину), а другой вариабельный регион тяжелой или легкой цепи (тяжелая или легкая цепь) остается нечеловеческим.

Термин «химерное антитело» относится к антителу с нечеловеческими вариабельными областями и человеческой постоянной областью.

Термин «натуральное человеческое антитело» относится к антителу, закодированному в человеческом спектре антител, например, в последовательности антител эмбрионального типа.

При использовании в данном документе, изолированное человеческое антитело «происходит из» конкретной зародышевой последовательности, если антитело получено из системы с использованием человеческих последовательностей иммуноглобулинов, например, путем иммунизации трансгенных мышей, несущих человеческие гены иммуноглобулинов или путем скрининга библиотеки генов человеческих иммуноглобулинов. Изолированное человеческое антитело, «происходящее из» последовательности человеческого зародышевого иммуноглобулина, может быть идентифицировано путем сравнивания аминокислотной последовательности человеческого антитела с аминокислотной последовательностью человеческих зародышевых иммуноглобулинов. Выбранное человеческое антитело, как правило, по меньшей мере, на 90% идентично по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном зародышевого иммуноглобулина и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют антитело как человеческое при сравнении с аминокислотными последовательностями зародышевых иммуноглобулинов иных видов (например, мышиными зародышевыми последовательностями). В определенных случаях аминокислотная последовательность человеческого антитела может быть, по меньшей мере, на 95% или даже, по меньшей мере, на 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном зародышевого иммуноглобулина. Как правило, у человеческого антитела, происходящего от конкретной человеческой зародышевой последовательности, будет не более 10 аминокислотных отличий от аминокислотной последовательности, кодируемой человеческим геном зародышевого иммуноглобулина. В некоторых случаях, у человеческого антитела, происходящего от конкретной человеческой зародышевой последовательности, может быть не более 4, 3, 2, 1 аминокислотных отличия от аминокислотной последовательности, кодируемой геном зародышевого иммуноглобулина.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент», при использовании в данном документе, относится к одному и более фрагментов антитела, сохраняющих способность связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами неизмененного антитела. Примерами связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела служат: (i) фрагмент Fab - моновалентный фрагмент, состоящий из фрагментов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) фрагмент F(ab’)₂ - бивалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из фрагментов V_H и C_H1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из фрагментов V_L и V_H единой спейсерной группы антитела, а также (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящий из фрагмента V_H. Далее, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются различными генами, они могут быть соединены, при помощи рекомбинантных способов, синтетическим сшивающим агентом, благодаря чему они могут быть получены в виде единой полипептидной цепочки, в которой области V_L и V_H спарены с образованием моновалентных молекул (известны как одинарные цепи Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; а также Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Подобные антитела с одинарной цепью также охватываются термином «антигенсвязывающий фрагмент антитела». Далее, антигенсвязывающие фрагменты включают иммуноглобулиновые слитые белки фрагментов связывания, содержащие (i) полипептид фрагмента связывания (например, вариабельный регион тяжелой цепи, вариабельный регион легкой цепи, вариабельный регион тяжелой цепи, слитую с вариабельной областью легкой цепи через сшивающий пептид), слитый с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина CH2, слитую с шарнирной областью, (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина CH3, слитую с константной областью CH2. Шарнирная область может быть модифицирована путем замены одного и более цистеиновых остатков на сериновые остатки, чтобы предотвратить димеризацию. Подобные слитые белки связывающих фрагментов иммуноглобулинов описаны в патентных заявках США US 2003/0118592 и US 2003/0133939. Эти фрагменты антител были получены по обычным методикам, известным в отрасли, фрагменты были проверены на пригодность аналогично целым антителам.

Антигенсвязывающий сайт, обычно, состоит из вариабельных регионов, образованных при спаривании легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина. Структура вариабельных областей антител весьма постоянна и сходна. Данные вариабельные области, как правило, состоят из относительно гомологичных каркасных областей (FR), перемежающихся гипервариабельными областями, называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR). Совокупная связывающая активность антигенсвязывающего фрагмента часто определяется последовательностью области, определяющей комплементарность. Однако, зачастую каркасные области необходимы для правильного расположения и упорядочивания в пространстве областей, определяющих комплементарность, чтобы обеспечить наилучшее связывание антигена.

Гуманизированное или гибридное антитело по настоящему изобретению может включать вариабельный регион тяжелой цепи, который может содержать нечеловеческие аминокислотные последовательности области, определяющей комплементарность и человеческие аминокислотные последовательности каркасной области натурального человеческого антитела и комплементарную легкую цепь.

Гуманизированное или гибридное антитело по настоящему изобретению может включать вариабельный регион легкой цепи, который может содержать нечеловеческие аминокислотные последовательности области, определяющей комплементарность и человеческие аминокислотные последовательности каркасной области натурального человеческого антитела и комплементарную тяжелую цепь.

Гуманизированное или гибридное антитело по настоящему изобретению могут ингибировать метастазирование, миграцию или инвазию опухолевых клеток или ингибировать рост кластерин-экспрессирующих, включая, к примеру, клетки карциномы. Заявителем было сделано неожиданное открытие, заключающееся в том, что анти-кластериновые антитела, включая гуманизированные или гибридные антитела по настоящему изобретению, уменьшают объем опухоли in vivo. Альтернативно, гуманизированное или гибридное антитело по настоящему изобретению может использоваться для выявления кластерин-экспрессирующих клеток.

Натуральное человеческое антитело, выбранное для гуманизирования нечеловеческого родительского антитела, может содержать вариабельный участок, содержащий трехмерную структуру, сходную (совпадающую) с (моделированным) вариабельным участком нечеловеческого родительского антитела. Таким образом, у гуманизированного или гибридного антитела есть больше шансов иметь трехмерную структуру, аналогичную нечеловеческому родительскому антителу.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению имеет высокую аффинность к кластерину. Было показано, что гуманизированное антитело связывается с рекомбинантным мономерным кластерином с аффинностью 4,49×10^-9 M±8,5×10^-10 и больше.

В соответствии с настоящим изобретением, человеческие аминокислотные последовательности легкой цепи гуманизированного или гибридного антитела происходят из каркасной области легкой цепи натурального человеческого антитела. Каркасная область легкой цепи натурального человеческого антитела, выбранного для гуманизирования, может обладать, к примеру, по меньшей мере, 70%-й идентичностью с каркасной областью легкой цепи нечеловеческого родительского антитела. Предпочтительно, чтобы натуральное человеческое антитело, выбранное для гуманизирования, имело такое же или практически такое же число аминокислот в определяющем комплементарность фрагменте легкой цепи, что и у определяющего комплементарность фрагмента легкой цепи нечеловеческого родительского антитела.

В иных воплощениях изобретения человеческие аминокислотные последовательности легкой цепи гуманизированного или гибридного антитела происходят из каркасной области легкой цепи натурального человеческого антитела, обладающей, по меньшей мере, 75, 80, 83% идентичностью (и более) с каркасной областью легкой цепи нечеловеческого родительского антитела.

Также, в соответствии с настоящим изобретением, аминокислотные остатки человеческой каркасной области тяжелой цепи гуманизированного или гибридного антитела происходят из каркасной области тяжелой цепи натурального человеческого антитела, обладающей, по меньшей мере, 70% идентичностью с каркасной областью тяжелой цепи нечеловеческого родительского антитела. Предпочтительно, чтобы натуральное человеческое антитело, выбранное для гуманизирования, имело такое же или практически такое же число аминокислот в определяющем комплементарность фрагменте тяжелой цепи, что и у определяющего комплементарность фрагмента тяжелой цепи нечеловеческого родительского антитела.

В иных воплощениях изобретения аминокислотные остатки человеческой каркасной области тяжелой цепи гуманизированного или гибридного антитела происходят из каркасной области тяжелой цепи натурального человеческого антитела, обладающей, по меньшей мере, 73, 75, 80% идентичностью с каркасной областью тяжелой цепи нечеловеческого родительского антитела.

В одном воплощении изобретения вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного или гибридного антитела может содержать, по меньшей мере, один нечеловеческий определяющий комплементарность регион.

Альтернативно, в иных воплощениях изобретения вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного или гибридного антитела может содержать, по меньшей мере, два или даже три нечеловеческих определяющих комплементарность регионов.

В дополнительном воплощении изобретения вариабельный участок легкой цепи может содержать, по меньшей мере, один нечеловеческий определяющий комплементарность регион.

Альтернативно, в дополнительных воплощениях изобретения вариабельный участок легкой цепи может содержать, по меньшей мере, два или даже три нечеловеческих определяющих комплементарность регионов.

Гуманизированное антитело может, предпочтительно, содержать все шесть определяющих комплементарность регионов нечеловеческого антитела. В случае двухвалентного гуманизированного антитела, все двенадцать определяющих комплементарность регионов могут происходить из нечеловеческого антитела.

Кластерин-экспрессирующие клетки, которые могут выявляться гуманизированными или гибридными антителами, включают клетки карциномы. Гуманизированные или гибридные антитела также могут использоваться для ингибирования роста клеток кластерин-экспрессирующей карциномы и, особенно, клеток человеческой карциномы.

Было показано, что кластерин секретируют или экспрессируют несколько типов человеческих клеток карциномы, среди которых: клетки эндометриальной карциномы, карциномы молочной железы, печеночно-клеточной карциномы, карциномы предстательной железы, почечно-клеточной карциномы, карциномы яичника, колоректального рака, карциномы поджелудочной железы и т. д.

Примеры воплощений изобретения включают, к примеру, гуманизированное или гибридное антитело, содержащее аминокислотные остатки каркасной области тяжелой цепи натурального человеческого антитела, как описано в данном документе и определяющую комплементарность область тяжелой цепи (CDRH), выбранную из группы, состоящей из: CDRH1, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1, CDRH2, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:2 и CDRH3, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:3 и их комбинаций с определяющей комплементарность областью тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из CDRH1, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:11, CDRH2, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:12 и CDRH3, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:13 и их комбинаций.

В ином приблизительном воплощении изобретения гуманизированное или гибридное антитело может содержать аминокислотные остатки каркасной области тяжелой цепи натурального человеческого антитела, как описано в данном документе и, по меньшей мере, две определяющие комплементарность области тяжелой цепи (CDRH), выбранные из группы, состоящей из: CDRH1, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1, CDRH2, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:2 и CDRH3, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:3 или, по меньшей мере, две определяющие комплементарность области тяжелой цепи, выбранные из группы, состоящей из CDRH1, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:11, CDRH2, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:12 и CDRH3, обладающей аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:13 и их комбинаций.

Альтернативно, в другом приблизительном воплощении изобретения гуманизированное или гибридное антитело согласно данному изобретению, может содержать аминокислотные остатки каркасной области тяжелой цепи натурального человеческого антитела, как описано в данном документе и CDRH1, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1, CDRH2, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:2 и CDRH3, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:3 или CDRH1, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:11, CDRH2, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:12 и CDRH3, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:13.

В более специфическом воплощении изобретения гуманизированное или гибридное антитело (или любой антигенсвязывающий фрагмент, полученный из них), может включать вариабельный регион легкой цепи, содержащий SEQ ID NO.:26 (h16B5 VL consensus1):

DIVMXQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQXPKLLIYWASTRESGVPDRFXGSGSGTDFTLTISSXQAEDXAVYYCKQSYNLWTFGXGTKLEXK; причем, по меньшей мере, одна из аминокислот, обозначенных буквой X, заменена в сравнении с соответствующей аминокислотой полипептидного набора SEQ ID NO.:25 (мышиный 16B5 VL). Аминокислотная замена может быть консервативной или неконсервативной. В соответствии с изобретением, аминокислотная замена может быть консервативной.

Гуманизированное или гибридное антитело (или любой антигенсвязывающий фрагмент, полученный из них) может включать вариабельный регион легкой цепи, содержащий SEQ ID NO.:27 (16B5 VL consensus2):

DIVMX_a1QSPX_a2SLAVSX_a3GEX_a4X_a5TX_a6X_a7CKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQX_a8PKLLIYWASTRESGVPDRFX_a9GSGSGTDFTLTISSX_a10QAEDX_a11AVYYCKQSYNLWTFGX_a12GTKLEX_a13K;

Где X_a1 может являться нейтральной гидрофильной аминокислотой, например, T или S;

Где X_a2 может являться, например, D или S;

Где X_a3 может являться гидрофобной аминокислотой, например, L или A;

Где X_a4 может являться основной аминокислотой, например, R или K;

Где X_a5 может являться гидрофобной аминокислотой, например, A или V;

Где X_a6 может являться гидрофобной аминокислотой, например, I или M;

Где X_a7 может являться, например, N или S;

Где X_a8 может являться, например, P или S;

Где X_a9 может являться нейтральной гидрофильной аминокислотой, например, S или T;

Где X_a10 может являться гидрофобной аминокислотой, например, L или V;

Где X_a11 может являться гидрофобной аминокислотой, например, V или L;

Где X_a12 может являться, например, Q или G;

Где X_a13 может являться, например, I или F; и

где вариабельный участок легкой цепи может содержать, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в сравнении с SEQ ID NO.:25.

Гуманизированное или гибридное антитело (или любой антигенсвязывающий фрагмент, полученный из них) может включать вариабельный регион легкой цепи, содержащий SEQ ID NO.:28 (16B5 VL consensus3):

DIVMX_a1QSPX_a2SLAVSX_a3GEX_a4X_a5