Il-1 альфа и бета биспецифические иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение

Il-1 альфа и бета биспецифические иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на связанную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявка США с серийным № 61/425671, зарегистрированной 21 декабря 2010 года, содержание которой включено в настоящий документ.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к поливалентным и полиспецифическим связывающим белкам, способам их получения, а особенно их применениям в диагностике, предотвращении и/или лечении острых и хронических воспалительных заболеваний, злокачественных опухолей и других заболеваний.

Уровень техники, предшествующий изобретению

В данной области известны сконструированные белки, такие как полиспецифические антитела, которые связывают два или более антигенов. Такие полиспецифические связывающие белки можно получать с использованием слияния клеток, химической конъюгации или технологии рекомбинантной ДНК.

Биспецифические антитела получали с использованием квадромной технологии (см. Milstein and Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40) на основе соматического слияния двух различных гибридомных клеточных линий, экспрессирующих моноклональные антитела (mAb) мыши с желаемой специфичностью биспецифического антитела. Вследствие случайного спаривания тяжелых и легких цепей двух различных иммуноглобулинов (Ig) в полученной гибрид-гибридомной (или квадромной) клеточной линии образуются до десяти различных видов молекул Ig, из которых только одна представляет собой функциональное биспецифическое антитело. Наличие неправильно спаренных побочных продуктов и значительно сниженные выходы продуктов означают необходимость сложных процедур очистки.

Биспецифические антитела также можно получать посредством химической конъюгации двух различных mAb (см. Staerz et al. (1985) Nature 314(6012):628-31). Этот подход не приводит к получению гомогенного препарата. В других подходах использовали химическую конъюгацию двух различных mAb или более мелких фрагментов антител (см. Brennan et al. (1985) Science 229(4708):81-3).

Другой способ, применяемый для получения биспецифических антител, представляет собой связывание двух исходных антител гетеробифункциональным кросслинкером, но получаемые в результате биспецифические антитела страдают значительной молекулярной гетерогенностью вследствие отсутствия сайт-специфичности реакции кросслинкера с исходными антителами. Для получения более гомогенных препаратов биспецифических антител два различных фрагмента Fab сайт-специфическим способом химически сшивали по их шарнирным остаткам цистеина (см. Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139(7):2367-75). Но этот способ приводил к получению фрагментов Fab'₂, являющихся не совсем молекулами IgG.

Разработан широкий спектр других форматов рекомбинантных биспецифических антител (см. Kriangkum et al. (2001) Biomol. Eng. 18(2):31-40). Среди них наиболее широко используются тандемные молекулы одноцепочечных Fv и диатела и их различные производные. В соответствии с предписанием конструирование этих молекул начинают с двух фрагментов одноцепочечных Fv (scFv), распознающих различные антигены (см. Economides et al. (2003) Nat. Med. 9(l):47-52). Тандемные молекулы scFv (taFv) представляют собой прямолинейный формат, просто соединяющий две молекулы scFv дополнительным пептидным линкером. Два фрагмента scFv, присутствующие в этих тандемных молекулах scFv, формируют отдельно сворачивающиеся структуры. Для связывания двух фрагментов scFv можно использовать различные линкеры и линкеры с длиной до 63 остатков (см. Nakanishi et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19:423-74). Несмотря на то, что, как правило, исходные фрагменты scFv можно экспрессировать в бактериях в растворимой форме, при этом часто наблюдают, что тандемные молекулы scFv формируют в бактериях нерастворимые агрегаты. Таким образом, для получения растворимых тандемных молекул scFv, как правило, применяют протоколы рефолдинга и использование экспрессирующих систем млекопитающих. Недавно опубликовано исследование экспрессии у трансгенных кроликов и крупного рогатого скота in vivo тандемных scFv к CD28 и ассоциированному с меланомой протеогликану (см. Gracie et al. (1999) J. Clin. Invest. 104(10):1393-401). В этой конструкции две молекулы scFv связывали линкером CH1 и выявляли концентрации биспецифического антитела в сыворотке до 100 мг/л. Для обеспечения экспрессии растворимых форм в бактериях использовали различные стратегии, включая вариации порядка доменов или использование промежуточных линкеров с варьирующей длиной или гибкостью. В настоящее время опубликовано несколько исследований с экспрессией растворимых тандемных молекул scFv в бактериях (см. Leung et al. (2000) J. Immunol. 164(12):6495-502; Ito et al. (2003) J. Immunol. 170(9):4802-9; Kami et al. (2002) J. Neuroimmunol. 125(1-2):134-40) с использованием или очень короткого линкера Ala3, или длинных богатых глицином/серином линкеров. В недавнем исследовании для обогащения молекулами, продуцируемыми в бактериях в растворимой и активной форме, использовали фаговый дисплей репертуара тандемных scFv, содержащих случайные промежуточные линкеры с длиной 3 или 6 остатков. Этот подход привел к выделению молекулы тандемных scFv c линкером из 6 аминокислотных остатков (см. Arndt and Krauss (2003) Methods Mol. Biol. 207:305-21). Остается неясным, представляет ли эта линкерная последовательность общее решение для экспрессии растворимых форм молекул тандемных scFv. Однако это исследование продемонстрировало, что фаговый дисплей молекул тандемных scFv в комбинации с направленным мутагенезом является эффективным способом для обогащения этими молекулами, которые можно экспрессировать в бактериях в активной форме.

В биспецифических диателах (Db) для экспрессии используют формат диатела. Диатела получают из фрагментов scFv, уменьшая длину линкера, связывающего домены VH и VL, приблизительно до 5 остатков (см. Peipp and Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-11). Это уменьшение размера линкера способствует димеризации двух полипептидных цепей посредством перекрестного спаривания доменов VH и VL. Биспецифические диатела получают посредством экспрессии в одной клетке двух полипептидных цепей со структурами или VHA-VLB и VHB-VLA (конфигурация VH-VL), или VLA-VHB и VLB-VHA (конфигурация VL-VH). В прошлом получено большое разнообразие различных биспецифических диател, и большинство из них экспрессируют в растворимой форме в бактериях. Однако недавнее сравнительное исследование демонстрирует, что ориентация вариабельных доменов может влиять на экспрессию и формирование активных участков связывания (см. Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15):7021-5). Однако экспрессия растворимых форм в бактериях представляет собой важное преимущество над молекулами тандемных scFv. Однако так как две различные полипептидные цепи экспрессируют в одной клетке, совместно с активными гетеродимерами можно получать неактивные гомодимеры. Это делает необходимым для получения гомогенных препаратов биспецифических диател применение дополнительных этапов очистки. Одним из подходов для форсированного получения биспецифических диател является получение антител с выступами во впадины (см. Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14):6444-8.18). Это продемонстрировано для биспецифического диатела к HER2 и CD3. В домен VH вносили большой выступ посредством замены Val37 на Phe и Leu45 на Trp и получали комплементарную впадину в домене VL посредством мутации Phe98 в Met и Tyr87 в Ala в любом из вариабельных доменов антител к HER2 или к CD3. С применением этого подхода получение биспецифических диател можно увеличить с 72% исходного антитела до более 90% у диатела с выступом во впадину. Важно, что выходы продукции в результате этих мутаций всего лишь незначительно снижаются. Однако для некоторых конструкций наблюдали снижение активности связывания антигена. Таким образом, этот довольно сложный подход для идентификации тех мутаций, которые приводят к получению гетеродимерной молекулы с неизмененной активностью связывания, требует анализа различных конструкций. Кроме того, такой подход требует мутационной модификации последовательности иммуноглобулина в константной области, таким образом, формируя неприродную и неестественную форму последовательности антитела, которая может приводить к увеличенной иммуногенности, плохой стабильности in vivo, а также неподходящей фармакокинетике.

Альтернативной стратегией для улучшения получения подобных биспецифическим диателам молекул являются одноцепочечные диатела (scDb) (см. Holliger and Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4):128-30; Wu et al. (1996) Immunotechnology 2(1):21-36). Биспецифические одноцепочечные диатела получают, связывая две формирующих диатела цепи дополнительным промежуточным линкером с длиной приблизительно 15 аминокислотных остатков. Таким образом, все молекулы с молекулярной массой, соответствующей мономерным одноцепочечным диателам (50-60 кДа), являются биспецифическими. В нескольких исследованиях продемонстрировано, что биспецифические одноцепочечные диатела экспрессируются в бактериях в растворимой и активной форме с большинством очищаемых молекул, представленных в виде мономеров (см. Holliger and Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4):128-30; Wu et al. (1996) Immunotechnol. 2(l):21-36; Pluckthun and Pack (1997) Immunotechnol. 3(2):83-105; Ridgway et al. (1996) Protein Engin. 9(7):617-21). Таким образом, одноцепочечные диатела комбинируют преимущества тандемных scFv (все мономеры являются биспецифическими) и диател (экспрессия растворимых форм в бактериях).

В последнее время диатела сливали с Fc с получением более похожих на Ig молекул, называемых ди-диателами (см. Lu et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(4):2856-65). Кроме того, описаны поливалентные конструкции на основе антител, содержащие два повторяющихся Fab в тяжелой цепи IgG, и связывающие четыре антигенные молекулы (см. публикацию PCT № WO 0177342 и Miller et al. (2003) J. Immunol. 170(9):4854-61).

В данной области существует необходимость в улучшенных поливалентных связывающих белках, связывающих два или более антигенов. В патенте США № 7612181 предоставлено новое семейство связывающих белков, которые с высокой аффинностью связывают два или более антигенов, и которые называют иммуноглобулинами с двойными вариабельными доменами (DVD-Ig™). Настоящее изобретение относится к дополнительным новым связывающим белкам, которые связывают два или более антигенов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к поливалентным связывающим белкам, которые связывают два или более антигенов.

Настоящее изобретение относится к новому семейству связывающих белков, с высокой аффинностью связывающих два или более антигенов.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему полипептидную цепь, где полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, C представляет собой константный домен, X1 представляет собой аминокислоту или полипептид, X2 представляет собой Fc-область, и n представляет собой 0 или 1. В одном из вариантов осуществления VD1 и VD2 в связывающем белке представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей. В другом варианте осуществления вариабельный домен тяжелой цепи выбран из группы, состоящей из вариабельного домена тяжелой цепи мыши, вариабельного домена тяжелой цепи человека, вариабельного домена тяжелой цепи с привитыми CDR и гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи. В другом варианте осуществления VD1 и VD2 связывают один и тот же антиген. В другом варианте осуществления VD1 и VD2 связывают различные антигены. В другом варианте осуществления C представляет собой константный домен тяжелой цепи. Например, X1 представляет собой линкер при условии, что X1 не представляет собой CH1. Например, X1 представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G₄S)₄ (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27) и ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28). В одном из вариантов осуществления X2 представляет собой Fc-область. В другом варианте осуществления X2 представляет собой вариант Fc-области.

В одном из вариантов осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, содержат полипептидную цепь, где полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 представляет собой Fc-область.

В одном из вариантов осуществления VD1 и VD2 в связывающем белке представляют собой вариабельные домены легких цепей. В одном из вариантов осуществления вариабельный домен легкой цепи выбран из группы, состоящей из вариабельного домена легкой цепи мыши, вариабельного домена легкой цепи человека, вариабельного домена легкой цепи с привитыми CDR и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи. В одном из вариантов осуществления VD1 и VD2 связывают один и тот же антиген. В другом варианте осуществления VD1 и VD2 связывают различные антигены.

В одном из вариантов осуществления C представляет собой константный домен легкой цепи. В другом варианте осуществления X1 представляет собой линкер при условии, что X1 не представляет собой CL1. В одном из вариантов осуществления X1 представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G₄S)₄ (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27) и ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28). В одном из вариантов осуществления связывающий белок не содержит X2.

В одном из вариантов осуществления вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат один и тот же линкер. В другом варианте осуществления вариабельные области тяжелых и вариабельные области легких цепей содержат различные линкеры. В другом варианте осуществления вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей содержат короткий (приблизительно 6 аминокислот) линкер. В другом варианте осуществления вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей содержат длинный (более 6 аминокислот) линкер. В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит короткий линкер, а вариабельная область легкой цепи содержит длинный линкер. В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит длинный линкер, а вариабельная область легкой цепи содержит короткий линкер.

В одном из вариантов осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, содержат полипептидную цепь, где указанная полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, C представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 не содержит Fc-область.

В другом варианте осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему две полипептидные цепи, где указанная первая полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 представляет собой Fc-область; и указанная вторая полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, C представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 не содержит Fc-область. В конкретном варианте осуществления связывающий белок с двойными вариабельными доменами (DVD) содержит четыре полипептидные цепи, где первые две полипептидные цепи содержат VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, соответственно, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 представляет собой Fc-область; и вторые две полипептидные цепи содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, соответственно, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, C представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 не содержит Fc-область. Такой связывающий белок с двойными вариабельными доменами (DVD) содержит четыре антигенсвязывающих участка.

В другом варианте осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, связывают одну или несколько мишеней. В одном из вариантов осуществления мишень выбрана из группы, состоящей из цитокинов, белков клеточной поверхности, ферментов и рецепторов. В другом варианте осуществления связывающий белок модулирует биологическую функцию одной или нескольких мишеней. В другом варианте осуществления связывающий белок нейтрализует одну или несколько мишеней. Связывающие белки по изобретению связывают цитокины, выбранные из группы, состоящей из лимфокинов, монокинов, полипептидных гормонов, рецепторов или опухолевых маркеров. Например, DVD-Ig по изобретению способны к связыванию двух или более из следующего: интерлейкин-1 альфа (IL-1α) и интерлейкин-1 бета (IL-1β).

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 3) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 52 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 53.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 2) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 56; и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 57. В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 2) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 54 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 55. В другом варианте осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 2) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 56 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 57.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 1) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 60; и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 61. В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 1) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 58 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 59. В другом варианте осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 1) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 60 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 61.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 3) и IL-1β (посл. 2), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 62 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 63.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 4) и IL-1β (посл. 2), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 64 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 65.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 4) и IL-1β (посл. 3), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 66 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 67.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 4) и IL-1β (посл. 4), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 69.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 4) и IL-1β (посл. 5), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 70 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 71.

В другом варианте осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему полипептидную цепь, где указанная полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует. В одном из вариантов осуществления Fc-область в связывающем белке отсутствует.

В другом варианте осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему полипептидную цепь, где указанная полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует. В одном из вариантов осуществления (X2)n в связывающем белке отсутствует.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению содержит первую и вторую полипептидные цепи, где указанная первая полипептидная цепь содержит первую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; и где указанная вторая полипептидная цепь содержит вторую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует. В другом варианте осуществления связывающий белок содержит две первые полипептидные цепи и две вторые полипептидные цепи. В еще одном варианте осуществления (X2)n во втором полипептиде отсутствует. В еще одном варианте осуществления Fc-область, если присутствует в первом полипептиде, выбрана из группы, состоящей из Fc-области с природной последовательностью и Fc-области с вариантом последовательности. В еще одном варианте осуществления Fc-область выбрана из группы, состоящей из Fc-области из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE и IgD.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению представляет собой DVD-Ig, связывающий два антигена, содержащий четыре полипептидные цепи, где каждая из первой и третьей полипептидных цепей содержат VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где,VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; и где каждая из второй и четвертой полипептидных цепей содержат VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует.

Изобретение относится к способу получения связывающего белка DVD-Ig посредством предварительного выбора исходных антител. В одном из вариантов осуществления способ получения иммуноглобулина с двойными вариабельными доменами, связывающего два антигена, включает этапы a) получения первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части, связывающего первый антиген; b) получения второго исходного антитело или его антигенсвязывающей части, связывающего второй антиген; c) конструирования первой и третьей полипептидных цепей, каждая из которых содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из указанного первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из указанного второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; d) конструирования второй и четвертой полипептидных цепей, каждая из которых содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из указанного первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из указанного второго исходного антитела или его антигенсвязывающей часть, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; и e) экспрессии указанных первой, второй, третьей и четвертой полипептидных цепей так, что получают молекулу DVD-Ig, связывающую указанный первый и указанный второй антигены.

В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения молекулы DVD-Ig, связывающей два антигена с желаемыми свойствами, включающему этапы a) получения первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части, связывающего первый антиген и обладающего по меньшей мере одним желаемым свойством, проявляемым молекулой DVD-Ig; b) получения второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, связывающего второй антиген и обладающего по меньшей мере одним желаемым свойством, проявляемым молекулой DVD-Ig; c) конструирования первой и третьей полипептидных цепей, содержащих VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из указанного первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из указанного второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; d) конструирования второй и четвертой полипептидных цепей, содержащих VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из указанного первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из указанного второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; e) экспрессии указанных первой, второй, третьей и четвертой полипептидных цепей так, что получают иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами, связывающий указанный первый и указанный второй антигены, с желаемыми свойствами.

В одном из вариантов осуществления VD1 первой и второй полипептидных цепей, описываемых в настоящем документе, получают из одного и того же исходного антитела или его антигенсвязывающей части. В другом варианте осуществления VD1 первой и второй полипептидных цепей, описываемых в настоящем документе, получают из различных исходных антител или их антигенсвязывающих частей. В другом варианте осуществления VD2 первой и второй полипептидных цепей, описываемых в настоящем документе, получают из одного и того же исходного антитела или его антигенсвязывающей части. В другом варианте осуществления VD2 первой и второй полипептидных цепей, описываемых в настоящем документе, получают из различных исходных антител или их антигенсвязывающих частей.

В одном из вариантов осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть являются одним и тем же антителом. В другом варианте осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть являются различными антителами.

В одном из вариантов осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген, а второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген. В конкретном варианте осуществления первый и второй антигены являются одним и тем же антигеном. В другом варианте осуществления исходные антитела связывают различные эпитопы на одном антигене. В другом варианте осуществления первый и второй антигены являются различными антигенами. В другом варианте осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген с активностью, отличной от активности, с которой второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген. В еще одном варианте осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть, связывает первый антиген с аффинностью, отличной от аффинности, с которой второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген.

В другом варианте осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть выбраны из группы, состоящей из антитела человека, антитела с привитыми CDR и гуманизированного антитела. В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающие части выбраны из группы, состоящей из фрагмента Fab, фрагмента F(ab')₂, бивалентного фрагмента, содержащего два фрагмента Fab, связанные в шарнирной области дисульфидным мостиком; фрагмента Fd, состоящего из доменов VH и CH1; фрагмента Fv, состоящего из доменов VL и VH одного плеча антитела, фрагмента dAb, выделенной определяющей комплементарность области (CDR), одноцепочечного антитела и диател.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению обладает по меньшей мере одним желаемым свойством, проявляемым первым исходным антителом или его антигенсвязывающей частью или вторым исходным антителом или его антигенсвязывающей частью. Альтернативно, первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере одним желаемым свойством, проявляемым иммуноглобулином с двойными вариабельными доменами. В одном из вариантов осуществления желаемое свойство выбрано из одного или нескольких параметров антитела. В другом варианте осуществления параметры антитела выбраны из группы, состоящей из следующего: антигенная специфичность, аффинность к антигену, активность, биологическая функция, распознавание эпитопа, стабильность, растворимость, эффективность продукции, иммуногенность, фармакокинетика, биодоступность, тканевая перекрестная реактивность и связывание ортологичных антигенов. В одном из вариантов осуществления связывающий белок является поливалентным. В другом варианте осуществления связывающий белок является полиспецифическим. Поливалентные и/или полиспецифические связывающие белки, описываемые в настоящем документе, обладают желательными свойствами особенно с терапевтической точки зрения. Например, поливалентный и/или полиспецифический связывающий белок может (1) интернализоваться (и/или катаболизироваться) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связываются антитела, быстрее, чем бивалентное антитело; (2) являться антителом-агонистом и/или (3) индуцировать гибель и/или апоптоз клеток, экспрессирующих антиген, с которым связывается поливалентное антитело. "Исходное антитело", обеспечивающее по меньшей мере одну специфичность связывания антигена поливалентных и/или полиспецифических связывающих белков, может представлять собой антитело, которое интернализуется (и/или катаболизируется) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связывается антитело; и/или может являться антителом-агонистом, индуцирующим гибель клеток и/или индуцирующим апоптоз антителом, и поливалентный и/или полиспецифический связывающий белок, как описано в настоящем документе, может демонстрировать улучшение(я) одного или нескольких из этих свойств. Кроме того, у исходного антитела может отсутствовать любые одно или несколько из этих свойств, но оно может приобретать их при конструировании в виде поливалентного связывающего белка, как описано в настоящем документе.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению обладает константой ассоциации (K_on) в отношении одной или нескольких мишеней, выбранной из группы, состоящей из: по меньшей мере приблизительно 10² M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10³ M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁴ M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁵ M^-1сек^-1; и по меньшей мере приб