Липопротеиновые комплексы и их получение и применения

Липопротеиновые комплексы и их получение и применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет согласно 35 U.S.С. §119 (е) в отношении предварительной заявки № 61/440371, поданной 7 февраля 2011, предварительной заявки № 61/452630, поданной 14 марта 2011, и предварительной заявки № 61/487263, поданной 17 мая 2011, где содержания всех этих документов полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

2. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

В настоящем изобретении предложены липопротеиновые комплексы, фармацевтические композиции, содержащие эти комплексы, способы получения и очистки аполипопротеинов для таких комплексов, способы получения этих комплексов и способы применения этих комплексов для лечения или предупреждения сердечно-сосудистых заболеваний, расстройств и/или состояний, связанных с ними.

3. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

3.1. Обзор

Циркулирующий в крови холестерин переносится липопротеинами плазмы, представляющими собой комплексные частицы, состоящие из липида и белка, которые осуществляют транспорт липидов в крови. Четыре основных класса липопротеиновых частиц циркулируют в плазме и вовлечены в систему транспорта жиров: хиломикроны, липопротеин очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеин низкой плотности (ЛПНП) и липопротеин высокой плотности (ЛПВП). Хиломикроны составляют короткоживущий продукт всасывания жиров в кишечнике. ЛПОНП и, в частности, ЛПНП ответственны за доставку холестерина из печени (где он синтезируется или получен из пищевых источников) во внепеченочные ткани, включая стенки кровеносных сосудов. ЛПВП, напротив, опосредуют обратный транспорт холестерина (RCT), удаление холестериновых липидов, в частности, из внепеченочных тканей в печень, где он запасается, претерпевает катаболизм, подвергается элиминации или рециркуляции. ЛПВП также играют благоприятную роль при воспалении, транспорте окисленных липидов и интерлейкина, что может, в свою очередь, уменьшать воспаление в стенках кровеносных сосудов.

Липопротеиновые частицы имеют гидрофобное ядро, состоящее из холестерина (обычно в форме сложного эфира холестерина) и триглицеридов. Это ядро окружено поверхностной оболочкой, включающей фосфолипиды, неэтерифицированный холестерин и аполипопротеины. Аполипопротеины опосредуют транспорт липидов, и некоторые из них могут взаимодействовать с ферментами, вовлеченными в метаболизм липидов. Идентифицировано по меньшей мере десять аполипопротеинов, включающих: АроА-I, АроА-II, АроА-IV, ApoA-V, ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE, ApoJ и АроН. Также обнаружено, что с липопротеинами связаны некоторые белки, такие как LCAT (лецитин:холестерин ацилтрансфераза), СЕТР (транспортный белок холестериновых эфиров), PLTP (транспортный белок фосфолипидов) и PON (параоксоназа).

Сердечно-сосудистые заболевания, такие как коронарная болезнь сердца, болезнь коронарных артерий и атеросклероз, в подавляющем большинстве случаев связаны с повышенными уровнями сывороточного холестерина. Например, атеросклероз представляет собой медленно прогрессирующее заболевание, характеризующееся аккумуляцией холестерина внутри стенок артерий. Убедительные доказательства подтверждают теорию, что липиды, депонируемые в атеросклеротических повреждениях, имеют происхождение главным образом от ЛПНП плазмы; поэтому ЛПНП стали общеизвестны как "плохой" холестерин. Напротив, уровни сывороточных ЛПВП имеют обратную корреляцию с коронарной болезнью сердца. Действительно, высокие уровни ЛПВП рассматривают как отрицательный фактор риска. Выдвинута гипотеза, что высокие уровни ЛПВП плазмы не только обладают защитным действием против болезни коронарных артерий, но могут действительно индуцировать регрессию атеросклеротической бляшки (см., например, Badimon et al., 1992, Circulation 86 (Suppl. III):86-94; Dansky and Fisher, 1999, Circulation 100:1762-63; Tangirala et al., 1999, Circulation 100(17):1816-22; Fan et al., 1999, Atherosclerosis 147(1):139-45; Deckert et al., 1999, Circulation 100(11):1230-35; Boisvert et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.l9(3):525-30; Benoit et al., 1999, Circulation 99(1):105-10; Holvoet et al., 1998, J. Clin. Invest. 102(2):379-85; Duverger et al., 1996, Circulation 94(4):713-17; Miyazaki et al., 1995, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 15(11):1882-88; Mezdour et al., Atherosclerosis 113(2):237-46; Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35(12):2263-67; Plump et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91(20):9607-11; Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest. 94(2):899-903; She et al, 1992, Chin. Med. J. (Engl). 105(5):369-73; Rubin et al., 1991, Nature 353(6341):265-67; She et al., 1990, Ann. NY Acad. Sci. 598:339-51; Ran, 1989, Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih (also translated as: Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi) 18(4):257-61; Quezado et al., 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther. 272(2):604-I 1; Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(12):1424-29; Kopfler et al., 1994, Circulation; 90(3):1319-27; Miller et al., 1985, Nature 314(6006):109-11; На et al., 1992, Biochim. Biophys. Acta 1125(2):223-29; Beitz et al., 1992, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 47(2):149-52). Вследствие этого ЛПВП стали общеизвестны как "хороший" холестерин (см., например, Zhang, et al., 2003 Circulation 108:661-663).

"Защитная" роль ЛПВП подтверждена в ряде исследований (например, Miller et al., 1977, Lancet 1 (8019):965-68; Whayne et al., 1981, Atherosclerosis 39:411-19). В этих исследованиях оказалось, что ЛПНП связаны с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, тогда как высокие уровни ЛПВП, по-видимому, создают защиту от сердечно-сосудистых заболеваний. В исследованиях in vivo дополнительно продемонстрирована защитная роль ЛПВП, причем показано, что инфузии ЛПВП кроликам могут затруднять развитие индуцированных холестерином повреждений артерий (Badimon et al., 1989. Lab. Invest. 60:455-61) и/или индуцировать их регрессию (Badimon et al., 1990. J. Clin. Invest. 85:1234-41).

3.2. Обратный транспорт холестерина, ЛПВП и аполипопротеин A-I

Биохимический путь обратного транспорта холестерина (RCT) функционирует для удаления холестерина из большинства внепеченочных тканей и принципиально важен для поддержания структуры и функции большинства клеток в организме. Путь RCT состоит, в основном, из трех следующих стадий: (а) эффлюкс холестерина, то есть первоначальное удаление холестерина из различных пулов периферических клеток; (b) этерификация холестерина под действием лецитин:холестерин ацилтрансферазы (LCAT), предотвращающая обратное поступление выведенного холестерина в клетки; и (с) захват ЛПВП-холестерина и холестериновых эфиров клетками печени для гидролиза с последующей рециркуляцией, запасанием, выделением с желчью или катаболизмом до желчных кислот.

LCAT, представляющая собой ключевой фермент в пути RCT, продуцируется печенью и циркулирует в плазме в связи с фракцией ЛПВП. LCAT преобразует холестерин клеточного происхождения в холестериновые эфиры, которые изолируются в ЛПВП, предназначенных для удаления (см. Jonas 2000, Biochim. Biophys. Acta 1529(I-3):245-56). Транспортный белок холестериновых эфиров (СЕТР) и транспортный белок фосфолипидов (PLTP) вносят вклад в дальнейшее ремоделирование циркулирующей совокупности ЛПВП. Белок СЕТР перемещает холестериновые эфиры, образуемые LCAT, на другие липопротеины, в частности, АроВ-содержащие липопротеины, такие как ЛПОНП и ЛПНП. PLTP поставляет лецитин в ЛПВП. Триглицериды ЛПВП катаболизируются внеклеточной печеночной триглицеридлипазой, и холестерин липопротеинов удаляется печенью посредством нескольких механизмов.

Функциональные характеристики частиц ЛПВП определяются, в основном, их основными аполипопротеиновыми компонентами, такими как АроА-I и АроА-II. Также наблюдали, что с ЛПВП связаны минорные количества АроС-I, АроС-II, ApoC-III, ApoD, ApoA-IV, ApoE и ApoJ. ЛПВП существуют в широком разнообразии различных размеров и различных смесей вышеупомянутых компонентов в зависимости от состояния ремоделирования в процессе метаболического каскада или биохимического пути RCT.

Каждая частица ЛПВП обычно включает по меньшей мере одну молекулу, и обычно от двух до 4 молекул АроА-I. Частицы ЛПВП могут также включать только ApoE (частицы гамма-LpE), которые также известны как ответственные за эффлюкс холестерина, как описано Prof Gerd Assmann (см., например, von Eckardstein et al., 1994, Curr Opin Lipidol. 5(6):404-16). ApoA-I синтезируется печенью и тонком кишечником в виде препроаполипопротеина А-I, который секретируется в виде проаполипопротеина A-I (proApoA-I) и быстро расщепляется с образованием плазматической формы ApoA-I, одной полипептидной цепи, состоящей из 243 аминокислот (Brewer et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:623-30). Препро-АроА-I, который экспериментально инъецируют непосредственно в кровоток, также расщепляется до плазматической формы АроА-I (Klon et al., 2000, Biophys. J. 79(3):1679-85; Segrest et al., 2000, Curr. Opin. Lipidol. 11(2):105-15; Segrest et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 (45):31755-58).

ApoA-I включает от 6 до 8 различных 22-аминокислотных альфа-спиралей или функциональных повторов, разделенных линкерной группировкой, часто представляющей собой пролин. Повторяющиеся звенья находятся в амфипатической спиральной конформации (Segrest et al., 1974, FEBS Lett. 38:247-53) и придают ApoA-I основные биологические активности, то есть связывание липидов и активацию лецитин:холестерин ацилтрансферазы (LCAT).

ApoA-I образует три типа стабильных комплексов с липидами: небольшие, бедные липидами комплексы, называемые пре-бета-1 ЛПВП; сплюснутые дисковидные частицы, содержащие полярные липиды (фосфолипид и холестерин), называемые пре-бета-2 ЛПВП; и сферические частицы, содержащие как полярные, так и неполярные липиды, называемые сферическими или зрелыми ЛПВП (ЛПВП3 и ЛПВП2). Большинство ЛПВП в циркулирующей совокупности содержит как ApoA-I, так и АроА-II ("фракция AI/AII-ЛПВП"). Тем не менее, фракция ЛПВП, содержащая только ApoA-I ("фракция AI-ЛПВП") оказалась более эффективной в RCT. Некоторые эпидемиологические исследования подтверждают гипотезу о том, что фракция АроА-I-ЛПВП является антиатерогенной (Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-07; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307).

Частицы ЛПВП составляют несколько совокупностей частиц, имеющих различные размеры, липидную композицию и композицию аполипопротеинов. Их можно разделить в соответствии с их свойствами, включающими их гидратированную плотность, композицию аполипопротеинов и характеристики заряда. Например, фракция пре-бета-ЛПВП характеризуется более низким поверхностным зарядом, чем зрелые частицы альфа-ЛПВП. В связи с различием их заряда пре-бета-ЛПВП и зрелые альфа-ЛПВП обладают различными электрофоретическими подвижностями в агарозном геле (David et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12):8959-8965).

Метаболизм пре-бета-ЛПВП и зрелых альфа-ЛПВП также различается. Пре-бета-ЛПВП имеют два пути метаболизма: либо удаление из плазмы и катаболизм почками, либо ремоделирование до ЛПВП среднего размера, которые преимущественно разлагаются печенью (Lee et al., 2004, J. Lipid Res. 45(4):716-728).

Хотя механизм транспорта холестерина из клеточной поверхности (то есть эффлюкса холестерина) неизвестен, считают, что бедный липидами комплекс, пре-бета-1 ЛПВП, является предпочтительным акцептором холестерина, переносимого из периферической ткани, вовлеченного в RCT (см. Davidson et al., J. Biol. Chem. 269:22975-82; Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1699-1709; Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1091-97; и Kawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-28; Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-25). Во время этого процесса рекрутмента холестерина из клеточной поверхности пре-бета-1 ЛПВП быстро преобразуются в пре-бета-2 ЛПВП. PLTP может увеличить скорость образования диска пре-бета-2 ЛПВП, но данные, указывающие на роль PLTP в RCT, отсутствуют. LCAT взаимодействует преимущественно с дисковидными, мелкими (пре-бета) и сферическими (то есть зрелыми) ЛПВП, перенося 2-ацильную группу лецитина или других фосфодипидов на свободный гидроксильный остаток холестерина с образованием холестериновых эфиров (удерживаемых в ЛПВП) и лизолецитина. Для этой реакции LCAT требуется АроА-I в качестве активатора; то есть АроА-I является природным кофактором LCAT. Преобразование холестерина, изолированного в ЛПВП, в его сложный эфир предотвращает обратное поступление холестерина в клетку, и конечным результатом является удаление холестерина из клетки.

Холестериновые эфиры в зрелых частицах ЛПВП во фракции частиц ApoAI-ЛПВП (то есть содержащих АроА-I и не содержащих АроА-II) удаляются печенью и претерпевают процессинг в желчи более эффективно, чем частицы, имеющие происхождение от ЛПВП, содержащих и АроА-I, и АроА-II (фракции AI/AII-ЛПВП). Это может быть отчасти связано с более эффективным связыванием ApoAI-ЛПВП с мембраной гепатоцита. Выдвинута гипотеза о существовании рецептора ЛПВП, и фагоцитарный рецептор класса В типа I (SR-BI) идентифицирован как рецептор ЛПВП (Acton et al., Science 271:518-20; Xu et al., 1997, Lipid Res. 38:1289-98). SR-BI более обильно экспрессируется в стероидогенных тканях (например, в надпочечниках) и в печени (Landschulz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-95; Rigotti et at., 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-49). Обзор рецепторов ЛПВП см. в Broutin et al., 1988, Anal. Biol. Chem. 46:16-23.

Первоначальное липидирование АТФ-связывающего кассетного переносчика AI, по-видимому, является критическим для образования плазматических частиц ЛПВП и для способности частиц пре-бета-ЛПВП к осуществлению эффлюкса холестерина (Lee and Parks, 2005, Curr. Opin. Lipidol. 16(1):19-25). Согласно этим авторам, это первоначальное липидирование обеспечивает более эффективное функционирование пре-бета-ЛПВП в качестве акцептора холестерина и предотвращает быструю ассоциацию АроА-I с предсуществующими плазматическими частицами ЛПВП, что приводит в результате к большей доступности частиц пре-бета-ЛПВП для эффлюкса холестерина.

СЕТР может также играть роль в RCT. Изменения в активности СЕТР или его акцепторах, ЛПОНП и ЛПНП, играет роль в "ремоделировании" совокупности ЛПВП. Например, в отсутствие СЕТР, ЛПВП становятся расширенными частицами, которые не претерпевают клиренс. (Обзор RCT и ЛПВП см. в статьях Fielding and Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-28; Barrans et al., 1996, Biochem. Biophys. Acta 1300:73-85; Hirano et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(6):1053- 59).

ЛПВП также играют роль в обратном транспорте других липидов и неполярных молекул, а также в детоксикации, то есть в транспорте липидов из клеток, органов и тканей в печень для катаболизма и выведения. Такие липиды включают сфингомиелин (SM), окисленные липиды и лизофосфатидилхолин. Например, авторами Robins и Fasulo (1997, J. Clin. Invest. 99:380-84) показано, что ЛПВП стимулируют транспорт растительного стерина печенью в секреции желчи.

Основной компонент ЛПВП, АроА-I, может связываться с SM in vitro. При восстановлении in vitro комплекса АроА-I с SM головного мозга коров (BBSM) максимальная скорость восстановления наблюдается при температуре 28°С, приближенной к температуре фазового перехода для BBSM (Swaney, 1983, J. Biol. Chem. 258(2), 1254-59). При соотношениях BBSM:ApoA-I, составляющих 7,5:1 или менее (масс./масс.), образуется единая гомогенная восстановленная частица ЛПВП, содержащая три молекулы АроА-I на частицу и имеющая молярное отношение BBSM:ApoA-I, составляющее 360:1. Эта частица под электронным микроскопом выглядит как дисковидный комплекс, подобный комплексу, наблюдаемому при рекомбинации ApoA-I с фосфатидилхолином при повышенных соотношениях фосфолипид/белок. При соотношениях BBSM:ApoA-I, составляющих 15:1 (масс./масс.), тем не менее, образуются дисковидные комплексы большего диаметра, имеющие более высокое молярное отношение фосфолипид:белок (535:1). Эти комплексы имеют значительно больший размер, более стабильны и более устойчивы к денатурации, чем комплексы ApoA-I, образованные с фосфатидилхолином.

Содержание сфингомиелина (SM) повышено в ранних акцепторах холестерина (пре-бета-ЛПВП и гамма-мигрирующем АроЕ-содержащем липопротеине), что позволяет предположить, что SM может усиливать способность этих частиц к стимуляции эффлюкса холестерина (Dass and Jessup, 2000, J. Pharm. Pharmacol. 52:731-61; Huang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1834-38; Fielding and Fielding 1995, J. Lipid Res. 36:211-28).

3.3 Защитный механизм ЛПВП и ApoA-I

Исследования защитного механизма(ов) ЛПВП сосредоточены на аполипопротеине A-I (ApoA-I), являющемся основным компонентом ЛПВП. Высокие уровни ApoA-I в плазме связаны с отсутствием или уменьшением повреждений коронарных сосудов (Maciejko et al., 1983, N. Engl. J. Med. 309:385-89; Sedlis et al., 1986, Circulation 73:978-84).

Инфузия ApoA-I или ЛПВП подопытным животным вызывает значительные биохимические изменения, а также снижает степень и тяжесть атеросклеротических повреждений. После первоначального сообщения авторов Maciejko and Мао (1982, Arteriosclerosis 2:407a), Badimon et al., (1989, Lab. Invest. 60:455-61; 1989, J. Clin. Invest. 85:1234-41), обнаруживших, что эти частицы могут значительно снижать степень атеросклеротических повреждений (снижение на 45%) и содержание холестеринового эфира (снижение на 58,5%) у кроликов, которых кормили холестерином, посредством инфузии ЛПВП (d=1,063-1,325 г/мл). Эти авторы также обнаружили, что ЛПВП приводят к регрессии установленных повреждений, от заживления до 50% регрессии. Авторами Esper et al. (1987, Arteriosclerosis 7:523a) показано, что инфузии ЛПВП могут заметно изменить композицию плазматических липопротеинов кроликов линии Watanabe с наследственной гиперхолестеринемией, у которых развиваются ранние артериальные повреждения. У этих кроликов в результате инфузий ЛПВП соотношение между защитными ЛПВП и атерогенными ЛПНП может увеличиться более чем вдвое.

Потенциал ЛПВП по предупреждению артериального заболевания в моделях на животных дополнительно оценен в результате наблюдения того, что АроА-I может осуществлять фибринолитическую активность in vitro (Saku et al., 1985, Thromb. Res. 39:1-8). Автором Ronneberger (1987, Xth Int. Congr. Pharmacol., Sydney, 990) показано, что ApoA-I может повышать фибринолиз у собак породы бигль и у яванских макаков. Подобная активность может быть отмечена in vitro на плазме человека. Ronneberger смог подтвердить уменьшение липидных отложений и образования артериальных бляшек у животных, обработанных ApoA-I.

Исследования in vitro показывают, что комплексы ApoA-I и лецитина могут стимулировать эффлюкс свободного холестерина из культивируемых артериальных гладкомышечных клеток (Stein et al., 1975, Biochem. Biophys. Acta, 380:106-18). За счет данного механизма ЛПВП может также снижать пролиферацию этих клеток (Yoshida et al., 1984, Exp. Mol Pathol. 41:258-66).

Также показано, что инфузионная терапия ЛПВП, содержащими ApoA-I или пептидные миметики ApoA-I регулирует плазматические уровни ЛПВП посредством переносчика АВС1, что приводит к эффективности при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (см., например, Brewer et al., 2004, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24:1755-1760).

Выделено два природных полиморфизма ApoA-I человека, в которых остаток аргинина заменен цистеином. В аполипопротеине A-I_Milano (АроА-I_M) данная замена происходит в остатке 173, тогда как в аполипопротеине A-I_Paris (ApoA-I_P) данная замена происходит в остатке 151 (Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900; Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13; Bruckert et al., 1997, Atherosclerosis 128:121-28; Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22; Klon et al., 2000, Biophys. J. 79(3):1679-85). Кроме того, выделен еще один природный полиморфизм ApoA-I человека, в котором лецитин заменен аргинином в остатке 144. Данный полиморфизм назван Apolipoprotein A-I_Zaragoza (ApoA-I_Z) и связан с тяжелой гипоальфа-липопротеинемией и повышенным эффектом обратного транспорта холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (Recalde et al., 2001, Atherosclerosis 154(3):613-623; Fiddyment et al., 2011, Protein Expr. Purif. 80(1):110-116).

Восстановленные частицы ЛПВП, включающие гомодимеры либо АроА-IM, либо ApoA-Ip, связанных дисульфидными связями, подобны восстановленным частицам ЛПВП, включающим АроА-I дикого типа, по их способности к клиренсу эмульсий димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) и по их способности к стимуляции эффлюкса холестерина (Calabresi et al., 1997b, Biochemistry 36:12428-33; Franceschini et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19:1257-62; Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22). При обеих мутациях гетерозиготные индивидуумы обладают пониженными уровнями ЛПВП, но, что парадоксально, обладают повышенным риском атеросклероза (Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900; Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13; Bruckert et al., 1997, Atherosclerosis 128:121-28). Восстановленные частицы ЛПВП, включающие любой из вариантов, способны к активации LCAT, хотя с пониженной эффективностью по сравнению с частицами ЛПВП, включающими АроА-I дикого типа (Calabresi et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:345-49; Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22).

Мутация АроА-I_M передается как аутосомно-доминантный признак; идентифицировано восемь поколений носителей внутри семьи (Gualandri et al., 1984, Am. J. Hum. Genet. 37:1083-97). Состояние индивидуума-носителя АроА-I_M характеризуется заметным снижением уровня ЛПВП-холестерина. Несмотря на это, у индивидуумов-носителей явным образом не показан какой-либо повышенный риск артериального заболевания. Действительно, в результате исследования родословных оказалось, что эти субъекты могут быть "защищены" от атеросклероза (Sirtori et al., 2001, Circulation, 103:1949-1954; Roma et al., 1993, J. Clin. Invest. 91(4):1445-520).

По-видимому, возможный механизм защитного эффекта АроА-I_M у носителей мутации связан с модификацией в структуре мутантного АроА-I_M с утратой одной альфа-спирали и повышенной доступностью гидрофобных остатков (Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:1632-35). Утрата плотно уложенной структуры множественных альфа-спиралей приводит к повышенной гибкости молекулы, которая легче связывается с липидами по сравнению с нормальным АроА-I. Кроме того, липопротеиновые комплексы в большей степени склонны к денатурации, что, таким образом, позволяет предположить, что в случае мутанта доставка липидов также улучшается.

Авторами Bielicki et al. (1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(9):1637-43) показано, что АроА-I_M обладает ограниченной способностью рекрутировать мембранный холестерин по сравнению с АроА-I дикого типа. Кроме того, вновь образованные ЛПВП в результате связывания с АроА-I_M с мембранными липидами преимущественно представляли собой частицы, имеющие размер 7,4 нм, вероятнее, чем комплексы большего размера от 9 до 11 нм, образованные АроА-I дикого типа. Эти наблюдения указывают на то, что замена Arg₁₇₃->Cys₁₇₃ в первичной последовательности АроА-I препятствовала нормальному процессу рекрутмента клеточного холестерина и сборки вновь образованных ЛПВП. Эта мутация явным образом связана с пониженной эффективностью удаления холестерина из клеток. Следовательно, его антиатерогенные свойства могут быть не связаны с RCT.

Наиболее резким структурным изменением, свойственным замене Arg₁₇₃->Cys₁₇₃ является димеризация АроА-I_M (Bielicki et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(9):1637-43). АроА-I_M могут образовать гомодимеры друг с другом и гетеродимеры с АроА-II. Исследования фракций крови, содержащих смесь аполипопротеинов, показывают, что присутствие димеров и комплексов в кровообращении может быть ответственным за повышенный период полувыведения аполипопротеинов. Такой повышенный период полувыведения наблюдали в клинических исследованиях носителей этой мутации (Gregg et al., 1988, NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone S G). В других исследованиях показано, что димеры АроА-I_M (ApoA-I_M/ApoA-I_m) действуют как фактор ингибирования при взаимном преобразовании частиц ЛПВП in vitro (Franceschini et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:12224-31).

3.4 Современные терапии дислипидемии и родственных расстройств

Дислипидемические расстройства представляют собой заболевания, связанные с повышенными уровнями холестерина и триглицеридов в сыворотке и сниженными отношениями ЛПВПЛПНП в сыворотке, и включают гиперлипидемию, в частности, гиперхолестеринемию, коронарную болезнь сердца, болезнь коронарных артерий, васкулярные и периваскулярные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания, такие как атеросклероз. Эти расстройства также включают синдромы, обусловленные атеросклерозом, такие как преходящая ишемическая атака или перемежающаяся хромота, вызванные артериальной недостаточностью. В настоящее время доступен ряд терапий для снижения повышенных уровней холестерина и триглицеридов в сыворотке, обусловленных дислипидемическими расстройствами. Тем не менее, каждая из них имеет свои недостатки и ограничения в отношении эффективности, побочных эффектов и качества жизни пациентов.

Смолы, связывающие желчные кислоты, представляют собой класс лекарственных средств, препятствующих рециркуляции желчных кислот из кишечника в печень; например, холестирамин (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb), колестипол гидрохлорид (Colestid®, The Upjohn Company) и колесевелам гидрохлорид (Welchol®, Daiichi-Sankyo Company). При пероральном приеме эти положительно заряженные смолы связываются с отрицательно заряженными желчными кислотами в кишечнике. Поскольку эти смолы не могут всасываться из кишечника, они выводятся, унося с собой желчные кислоты. Тем не менее, применение таких смол в лучшем случае снижает сывороточные уровни холестерина лишь приблизительно на 20% и сопровождается желудочно-кишечными побочными эффектами, включая констипацию и дефицит некоторых витаминов. Кроме того, поскольку эти смолы связывают другие лекарственные средства, другие пероральные лекарственные средства необходимо принимать по меньшей мере за час или спустя от четырех до шести часов после приема смолы; таким образом, это осложняет схемы лечения пациентов с сердечными заболеваниями.

Статины представляют собой агенты, снижающие уровни холестерина, которые блокируют синтез холестерина посредством ингибирования HMGCoA редуктазы, являющейся ключевым ферментом, вовлеченным в путь биосинтеза холестерина. Статины, например, ловастатин (Mevacor®), симвастатин (Zocor®), правастатин (Pravachol®), флувастатин (Lescol®) и аторвастатин (Lipitor®), иногда применяют в комбинации со смолами, связывающими желчные кислоты. Статины значительно снижают сывороточные уровни холестерина-ЛПНП и замедляют прогрессирование коронарного атеросклероза. Тем не менее, сывороточные уровни холестерина-ЛПВП только умеренно повышаются. В механизм снижения уровней ЛПНП могут быть вовлечены как снижение концентрации ЛПОНП, так и индукция клеточной экспрессии ЛПНП-рецептора, приводя к сниженному продуцированию и/или повышенному катаболизму ЛПНП. Применение этих лекарственных средств сопровождается побочными эффектами, включающими дисфункцию печени и почек (The Physicians Desk Reference, 56^th Ed., 2002, Medical Economics).

Ниацин (никотиновая кислота) представляет собой водорастворимый комплекс витамина В, применяемый в качестве пищевой добавки и гиполипидемического агента. Ниацин уменьшает продуцирование ЛПОНП и эффективен при снижении ЛПНП. В некоторых случаях его применяют в комбинации со смолами, связывающими желчные кислоты. Ниацин может повысить содержание ЛПВП при применении в адеквантых дозах, тем не менее, его польза ограничена серьезными побочными эффектами при применении в таких высоких дозах. Niaspan® представляет собой форму ниацина пролонгированного высвобождения, которая дает меньше побочных эффектов, чем чистый ниацин. Ниацин/ловастатин (Nicostatin®) представляет собой препарат, содержащий как ниацин, так и ловастатин, который объединяет полезные эффекты каждого из этих лекарственных средств.

Фибраты представляют собой класс лекарственных средств, которые снижают уровни липидов, применяемых для лечения различных форм гиперлипидемии (то есть повышенных сывороточных уровней триглицеридов), которые могут также сопровождаться гиперхолестеринемией. Фибраты, по-видмому, снижают фракцию ЛПОНП и умеренно снижают ЛПВП, Тем не менее, эффект этих лекарственных средств в отношении сывороточного холестерина варьирует. В США фибраты, такие как клофибрат (Atromid-S®), фенофибрат (Tricor®) и безафибрат (Bezalip®), одобрены для применения в качестве антилипидемических лекарственных средств, но не получили подтверждения в качестве агентов против гиперхолестеринемии. Например, клофибрат представляет собой антилипидемический агент, действующий (посредством неизвестного механизма) как снижающий сывороточные уровни триглицеридов посредством снижения фракции ЛПОНП. Хотя холестерин может снижаться в некоторых подгруппах пациентов, биохимический ответ на это лекарственное средство варьирует, и не всегда возможно предсказать, какие пациенты получат благоприятные результаты. Atromid-S® не показан как эффективный для предупреждения коронарной болезни сердца. Химически и фармацевтически родственное лекарственное средства, гемфиброзил (Lopid®) представляет собой агент, регулирующий липиды, который умеренно снижает уровни триглицеридов и холестерина-ЛПОНП в сыворотке, а также умеренно повышает субфракции холестерина-ЛПВП холестерин-ЛПВП2 и -ЛПВП3, а также как АроА-I, так и А-II (то есть фракцию AI/АМТ-ЛПВП). Тем не менее, липидный ответ является гетерогенным, в частности, среди различных групп пациентов. Кроме того, хотя у пациентов-мужчин в возрасте от 40 до 55 лет, не имеющих анамнеза или симптомов существующей коронарной болезни сердца, наблюдали предупреждение коронарной болезни сердца, неясно, до какой степени эти наблюдения могут быть экстраполированы на другие группы пациентов (например, женщин, мужчин старшего или более молодого возраста). Действительно, у пациентов с установленной коронарной болезнью сердца эффективности не наблюдали. Применение фибратов сопровождается серьезными побочными эффектами, включающими токсичность, например, злокачественные опухоли (в частности, рак желудочно-кишечного тракта), заболевание мочевого пузыря и повышенную смертность, не связанную с коронарной болезнью сердца.

Заместительная терапия пероральными эстрогенами может быть рассмотрена в случае умеренной гиперхолестеринемии у женщин в период постменопаузы. Тем не менее, повышение уровней ЛПВП может сопровождаться повышением уровней триглицеридов. Конечно, лечение эстрогенами ограничено определенной группой пациентов (женщинами в период постменопаузы) и сопровождается серьезными побочными эффектами, включающими индукцию злокачественных новообразований, заболевание мочевого пузыря, тромбоэмболическое заболевание, аденому печени, повышенное кровяное давление, нарушение толерантности к глюкозе и гиперкальцемию.

Другие средства, полезные для лечения гиперлипидемии, включают эзетиниб (zetia®; Merck), который блокирует или ингибирует всасывание холестерина. Тем не менее, показано, что ингибиторы эзетиниба проявляют некоторые токсичности.

Как ЛПВП, так и рекомбинантные формы АроА-I в комплексе с фосфолипидами могут служить в качестве поглотителей/акцепторов для неполярных или амфипатических молекул, например, холестерина и его производных (оксистеринов, окисленных стеринов, растительных стеринов и т.д.), холестериновых эфиров, фосфолипидов и их производных (окисленных фосфолипидов), триглицеридов, продуктов окисления и липополисахаридов (ЛПС) (см., например, Casas et al., 1995, J. Surg. Res. Nov 59(5):544-52). ЛПВП могут также служить в качестве акцептора для TNF-альфа и других лимфокинов. ЛПВП могут также служить в качестве носителя для сывороточных параоксоназ человека, например, PON-1, -2, -3. Параоксоназа, представляющая собой эстеразу, ассоциированную с ЛПВП, важна для защиты клеточных компонентов от окисления. Окисление ЛПНП, происходящее во время окислительного стресса, по-видимому, прямо связано с атеросклерозом (Aviram, 2000, Free Radic. Res. 33 Suppl:S85-97). Параоксоназа, по-видимому, играет роль в склонности к атеросклерозу и сердечно-сосудистому заболеванию (Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86). Сывороточная Параоксоназа человека (PON-1) связана с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП). Ее активность обратно связана с атеросклерозом. PON-1 гидролизует фосфорорганические соединения и может защищать от атеросклероза посредством ингибирования окисления ЛПВП и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) (Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86). Экспериментальные исследования позволяют предположить, что эта защита обусловлена способностью PON-1 гидролизовать определенные липидные пероксиды в окисленных липопротеинах. Вмешательства, сохраняющие или усиливающие активность PON-1, могут помочь замедлить возникновение атеросклероза и коронарной болезни сердца.

Кроме того, ЛПВП играет роль в качестве антитромботического агента и редуцирующего агента фибриногена, а также в качестве средства при геморрагическом шоке (Cockerill et al., WO 01/13939, опубликованная 1 марта 2001). Показано, что ЛПВП, и, в частности, АроА-I способствует обмену липополисахарида, продуцируемого в результате сепсиса, до липидных частиц, включающих АроА-I, приводя в результате к функциональной нейтрализации липополисахарида (Wright et al., WO 9534289, опубликованная 21 декабря 1995; Wright et al., патент US №5928624, опубликованный 27 июля 1999; Wright et al., патент US №5932536, опубликованный 3 августа 1999).

Существует ряд способов, доступных для получения липопротеиновых комплексов in vitro. В патентах US №№6287590 и 6455088 раскрыт способ, включающий совместную лиофилизацию аполипопротеина и липидных растворов в органическом растворителе (или в смеси растворителей) и образование заряженных липопротеиновых комплексов во время гидратации лиофилизированного порошка. Липопротеиновые комплексы могут быть также образованы способом детергентного диализа; например, смесь липида, липопротеина и детергента, такого как холат, подвергают диализу и восстанавливают с образованием комплекса (см., например, Jonas et al., 1986, Methods Enzymol. 128:553-82). В Примере 1 публикации US 2004/0067873 раскрыт способ холатной дисперсии, при котором липидную дисперсию объединяют с холатом в условиях образования мицелл, и эти мицеллы, в свою очередь, инкубируют с раствором аполипопротеина с образованием комплекса. Наконец, холат, который является токсичным, необходимо удалить, например, с помощью диализа, ультрафильтрации или адсорбции/абсорбции на аффинных гранулах или на аффинной смоле. В патенте US №6306433 раскрыто образование липопротеинового комплекса, при котором жидкую смесь белка и липида подвергают воздействию гомогенизации высокого давления. Тем не менее, белки, чувствительные к высоким сдвигающим усилиям, могут утрачивать активность под действием гомогенизации высокого давления.

Таким образом, доступные в настоящее время способы получения приводят в результате к потерям исходных веществ, например, разрушению белка, и/или требуют очистки полученного в результате продукта, например, удаления токсичного агента, и, следовательно, являются неэффективными и дорогостоящими. Кроме того, препараты липопротеиновых комплексов могут быть гетерогенными, содержать смесь комплексов, варьирующих по размеру и по композиции. См., например, патент US №5876968. Соответственно, существует необходимость в разработке новых способов получения липопротеиновых комплексов, которые являются эффективными и образуют комплексы, имеющие большую гомогенность, предпочтительно имеющие высокую степень чистоты. Такие способы могли бы дать возможность более экономичного получения в широком масштабе, образуя при этом более однородный фармацевтически приемлемый препарат при меньших рисках побочных эффектов вследствие загрязнений.

Кроме того, терапевтическое применение АроА-I, АроА-I_M, ApoA-I_P и других вариантов, а также восстановленных ЛПВП, тем не менее, в настоящее время ограничено большим количеством аполипопротеина, требующимся для терапевтического введения, и затратами на получение белка с учетом низкого общего выхода продукции и встречаемости разрушения белка в культурах для рекомбинантной экспрессии белков. (См., например, Mallory et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(9):4241-4247; Schmidt et al., 1997, Protein Expression & Purification 10:226-236). В результате ранних клинических исследований предположили, что диапазон дозы составляет от 1,5 до 4 г белка на инфузию для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Число инфузий, необходимое для полного курса лечения, неизвестно. (См., например, Eriksson et al., 1999, Circulation 100(6):594-98; Carlson, 1995, Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 5:85-91; Nanjee et al., 2000, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 20(9):2148-55; Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19(4):979-89; Nanjee et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(9): 1203-14).

Рекомбинантный ApoA-I человека экспрессирован в гетерологичных хозяевах, тем не менее, выход зрелого белка является недостаточным для широкомасштабных клинических применений, в частности, в сочетании с методами очистки, которые дополнительно снижают выходы и приводят в результате к продукту с примесями.

Авторами Weinberg et al., 1988, J. Lipid Research 29:819-824, описано разделение аполипопротеинов A-I, A-II и A-IV и их изоформ, очищенных из плазмы человека, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой.

В документе WO 2009/025754 описано разделение и очистка белков альфа-1-антитрипсина и ApoA-I из плазмы человека.

Авторами Hunter et al., 2009, Biotechnol. Prog. 25(2):446-453, описана широкомасштабная очистка варианта АроА-I Milano, рекомбинантно экспрессируемого в Е.coli.

Авторами Caparon et al., 2009, Biotechnol. And Bioeng. 105(2):239-249, описана экспрессия и очистка ApoA-I Milano из клеток-хозяев E.Coli, в которых генно-инженерными методами было делетировано два клеточных белка, чтобы снизить уровни этих белков в очищенном продукте, представляющем собой аполипопротеин.

В патенте US №6090921 описана очистка ApoA-I или аполипопротеина Е (АроЕ) из фракции плазмы человека, содержащей ApoA-I и АроЕ, с использованием анионообменной хроматографии.

Авторами Brewer et al., 1986, Meth. Enzymol. 128:223-246, описано выделение и характеризация аполипопротеинов из крови человека с использованием хроматографических методов.

Авторами Weisweiler et al., 1987, Clinica Chimica Acta 169:249-254, описано выделение ApoA-I и ApoA-II из ЛПВП человека с использованием жидкостной экспресс-хроматографии белков.

Авторами deSilva et al., 1990, J. Biol. Chem. 265(24):14292-14297, описана очистка аполипопротеина J с помощью иммуноаффинной