Экзотоксин а pseudomonas с менее иммуногенными т-и/или в-клеточными эпитопами

Экзотоксин а pseudomonas с менее иммуногенными т-и/или в-клеточными эпитопами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Данная заявка на патент испрашивает приоритет на основе предварительной заявки на патент США №61/495, 085, поданной 9 июня 2011, и предварительной заявки на патент США №61/535, 668, поданной 16 сентября 2011, каждая из которых включена здесь посредством ссылки в полном объеме.

Включение посредством ссылки материалов, представленных в электронном виде

В настоящий документ включен посредством ссылки во всей своей полноте машиночитаемый список нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, представленный с настоящей заявкой, и определенный следующим образом: один ASCII (текстовый) файл 53884 байтов с именем «710339_ST25.TXT» от 2 июня 2012.

Уровень техники

Экзотоксин A Pseudomonas (РЕ) является бактериальным токсином с цитотоксической активностью, который может быть эффективным для уничтожения или ингибирования роста нежелательных клеток, например, раковых клеток. Соответственно, РЕ может быть полезен для лечения или профилактики заболеваний, таких как, например, рак. Тем не менее, РЕ может иметь высокую иммуногенность. Соответственно, введение РЕ может стимулировать иммунный ответ на РЕ, включая, например, выработку антител к РЕ и/или Т-клеток против него, что нежелательно нейтрализует цитотоксическую активность РЕ. Такая иммуногенность может уменьшить количество РЕ, которое может быть дано пациенту, что может, в свою очередь, снизить эффективность РЕ для лечения заболевания, например, рака. Таким образом, существует потребность в улучшенном РЕ.

Краткое описание изобретения

Один вариант осуществления изобретения обеспечивает экзотоксин А Pseudomonas (РЕ), включающий аминокислотную последовательность, содержащую замены одного или более аминокислотных остатков из L294, L297, Y298, L299 и R302, при условии, что, когда аминокислотная последовательность содержит замену на аланин в аминокислотном остатке R302, по крайней мере один из аминокислотных остатков L294, L297, Y298 и L299 заменен, где аминокислотные остатки L294, L297, Y298, L299 и R302 определены относительно SEQ ID NO:1, необязательно с заменами одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1 и/или с заменами одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более Т-клеточных эпитопах в пределах аминокислотных остатков R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 в SEQ ID NO:1.

Еще один вариант воплощения изобретения относится к РЕ, представленному аминокислотной последовательностью, имеющей формулу I:

где:

m, n, и р - независимо представляют собой 0 или 1;

FCS включает последовательность аминокислотных остатков, расщепляемую фурином, причем последовательность расщепляется фурином;

R¹ включает один или более последовательных аминокислотных остатков из остатков 285-293 из SEQ ID NO:1;

R² включает X₁VAX₂X₃X₄AAX₅LSW (SEQ ID NO:2), где X₁, X₂, и Х₄ независимо представляют собой лейцин, аланин, глицин, серин или глутамин; Х₃ представляет собой тирозин, аланин, глицин, серин, или глутамин, и X₅ представляет собой аргинин, аланин, глицин, серин или глутамин, при условии, что РЕ не содержит LVALYLAARLSW (SEQ ID NO:3) и, когда X₅ представляет собой аланин, по крайней мере один из Х₁, X₂, Х₃, и Х₄ представляет собой аланин, глицин, серин или глутамин;

R³ включает 1 или более последовательных аминокислотных остатков из остатков 306-394 из SEQ ID NO:1; и

функциональный домен III РЕ включает остатки 395-613 из SEQ ID NO:1,

необязательно с заменами одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1 и/или с заменами одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более Т-клеточных эпитопах в пределах аминокислотных остатков R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, 1450, 463-519, R551, L552, Т554, 1555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1.

Еще один вариант изобретения обеспечивает РЕ, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую замену одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1; при условии, что

когда аминокислотный остаток в положении Q485 или L516 заменен на аланин, по крайней мере, один дополнительный аминокислотный остаток в позиции R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1 является замененным, и

когда аминокислотный остаток в положении R427, R467, R490, R505, R513 или R551 заменен на аланин, глицин, серин или глутамин, или когда аминокислотный остаток в положении R490 заменен на валин, лейцин, или изолейцин, по крайней мере, один аминокислотный остаток в позиции R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1 дополнительно заменен, что не включает замену на аланин, глицин, серин или глутамин для аминокислотных остатков в положениях R427, R467, R490, R505, R513 или R551 или замену на валин, лейцин или изолейцин для аминокислотного остатка в положении 490,

где аминокислотные остатки R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 определены относительно SEQ ID NO:1.

Еще один вариант воплощения изобретения предусматривает экзотоксин A Pseudomonas (РЕ), включающий аминокислотную последовательность РЕ, имеющую замену одного или нескольких аминокислотных остатков из D463, Y481 и L516, определенных относительно SEQ ID NO:1, при условии, что, когда аминокислотный остаток в положении 516 заменен аланином, по крайней мере один из аминокислотных остатков D463 и Y481 также заменен, причем РЕ необязательно имеет дополнительные замены одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более В-клеточных эпитопах и/или дополнительные замены одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких Т-клеточных эпитопах и/или делеции одного или более последовательных аминокислотных остатков из 1-273 и 285-394 в SEQ ID NO:1.

Дополнительные варианты воплощения изобретения обеспечивают родственные химерные молекулы, а также родственные нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева, популяции клеток и фармацевтические композиции.

Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу лечения или профилактики рака у млекопитающего, включающему введение млекопитающему РЕ согласно изобретению, химерной молекулы согласно изобретению, нуклеиновой кислоты согласно изобретению, рекомбинантного экспрессионного вектора согласно изобретению, клетки-хозяина согласно изобретению, популяции клеток согласно изобретению или фармацевтической композиции согласно изобретению, в количестве, эффективном для лечения или профилактики рака у млекопитающего.

Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу ингибирования роста клеток-мишеней, включающему контактирование клетки с РЕ согласно изобретению, химерной молекулой согласно изобретению, нуклеиновой кислотой согласно изобретению, рекомбинантным экспрессионным вектором согласно изобретению, клеткой-хозяином согласно изобретению, популяцией клеток согласно изобретению, или фармацевтической композицией согласно изобретению, в количестве, эффективном для ингибирования роста клетки-мишени.

Дополнительные варианты воплощения настоящего изобретения обеспечивают способы получения РЕ согласно изобретению и способы получения химерной молекулы согласно изобретению.

Краткое описание фигур

Фигура 1 представляет собой график, показывающий частоту аллелей (ось y) различных аллелей главного комплекса гистосовместимости II класса DR бета 1 (DRB1) (ось x) в мировой популяции (незакрашеные столбцы) и группе доноров (закрашенные столбцы).

Фигура 2А представляет собой график, показывающий количество образующих пятна клеток (SFC) на 1×10⁶ клеток (ось y), указывающий на реакцию Т-клеток наивного донора 031810aph после размножения in vitro и инкубации со средой (М) (без пептида), пептидным пулом 3, пептидным пулом 16 или пептидным пулом 22 (ось х), измеренное методом ELISpot с интерлейкином (IL)-2.

Фигура 2 В представляет собой график, показывающий количество SFC на 1×10⁶ клеток (ось y), указывающий на реакцию Т-клеток наивного донора 031810aph после инкубации без пептида, с пептидным пулом 3, пептидным пулом 16 или пептидным пулом 22 (ось х) без размножения in vitro, измеренную с помощью IL-2 ELISpot.

Фигура 3 представляет собой график, показывающий общее количество SFC на 1×10⁶ клеток (ось y) для Т-клеток от каждого из доноров 1-50 при отсутствии пептида или для каждого из пептидных пулов 1-22 (ось х) после 14 дней размножения in vitro. Пунктирная линия показывает величину, в три раза превышающую фоновое значение.

На Фигуре 4 определены конкретные пептиды и области в пептидах (выделенные серым цветом участки) из пептидного пула 3, которые стимулируют ответ Т-клеток различной интенсивности у различных доноров.

Фигура 5 представляет собой график, показывающий цитотоксическую активность (% от контроля) (ось y) в зависимости от концентрации НА22 дикого типа (Fv фрагмент антитела к CD22, стабилизированный дисульфидными связями, конъюгированный с РЕ38) (кружки), L297A НА22 (квадраты), или R302A НА22 (ромбы) (нг/мл) (ось х) на СА46 клетках.

Фигура 6А представляет собой график, показывающий ответ Т-клеток донора 010710 (SFC на 1×10⁶ клеток) (ось y) после повторной стимуляции без пептида, пептидом дикого типа (WT15) или R302A (ось y) после культивирования в течение 14 дней с НА22 дикого типа (закрашенные столбцы) или R302A НА22 (незакрашенные столбцы).

Фигуре 6 В представляет собой график, показывающий ответ Т-клеток донора 111909 (SFC на 1×10⁶ клеток) (ось y) после повторной стимуляции без пептида, пептидом дикого типа (WT15) или R302A (ось y) после культивирования в течение 14 дней с НА22 дикого типа (закрашенные столбцы) или R302A НА22 (незакрашенные столбцы).

Фигура 7А представляет собой график, показывающий ответ Т-клеток донора 031510 (SFC на 1×10⁶ клеток) (ось y) на стимуляцию НА22 (содержащим РЕЗВ) (закрашенные столбцы) или LR RIT (LR) (содержащим аминокислотные остатки 274-284 и 395-613 из SEQ ID NO:1) (незакрашеные столбцы) и повторную стимуляцию одним из пептидных пулов 1-22 (ось х). Контроль включает клетки, выращенные в присутствии цефтазидима (CEFT), клетки без стимуляции антигеном в день 0 и без стимуляции антигеном в день 14 («М линии»), и клетки со стимуляцией LMB9 в день 0 и без стимуляции антигеном в день 14 («без пептида»).

Фигура 7В представляет собой график, показывающий ответ Т-клеток донора 021610 (SFC на 1×10⁶ клеток) (ось y) на стимуляцию НА22 (содержащим РЕ38) (закрашенные столбцы) или LR RIT (LR) (содержащим аминокислотные остатки 274-284 и 395-613 из SEQ ID NO:1) (незакрашенные столбцы) и повторную стимуляцию одним из пептидных пулов 1-22 (ось х). Контроль включает клетки, выращенные а присутствии цефтазидима (CEFT), клетки без стимуляции антигеном в день 0 и без стимуляции антигеном в день 14 («М линии»), и клетки со стимуляцией LMB9 в день 0 и без стимуляции антигеном в день 14 («без пептида»).

Фигура 7С представляет собой график, показывающий ответ Т-клеток донора 101509 (SFC на 1×10⁶ клеток) (ось y) на стимуляцию НА22 (содержащим РЕ38) (закрашенные столбцы) или LR RIT (LR) (содержащим аминокислотные остатки 274-284 и 395-613 из SEQ ID NO:1) (незакрашенные столбцы) и повторную стимуляцию одним из пептидных пулов 1-22 (ось х). Контроль включает клетки, выращенные а присутствии цефтазидима (CEFT), клетки без стимуляции антигеном в день 0 и без стимуляции антигеном в день 14 («М линии»), и клетки со стимуляцией LMB9 в день 0 и без стимуляции антигеном в день 14 («без пептида»).

На Фигуре 8 определены конкретные пептиды (выделенные серым цветом участки) пептидов SEQ ID NO:102-111, которые стимулируют ответ Т-клеток, измеренный по образованию IL-2 для различных доноров.

Фигура 9 представляет собой график, показывающий суммарный процент общего ответа доноров для 50 доноров для каждой из SEQ ID NO:31-141.

Фигура 10 представляет собой график, показывающий реактивность фага анти-РЕ38 (домен III) против НА22 с точечными заменами. Черные ячейки означают реактивность менее 10%, пустые ячейки означают реактивность более 10%, и серые ячейки указывают на отсутствие проверки. Замены отсортированы по их расположению от М-конца (слева) к С-концу (справа).

Фигуры НА и 11 В представляют собой графики, показывающие результаты сравнительных экспериментов, определяющих концентрацию каждого из замещенных иммунотоксинов НА22 («НА», закрашенные кружки), HA22-LR («LR», не закрашенные кружки), HA22-L05 («L05», закрашенные треугольники), HA22-L06 («L06», не закрашенные треугольники), HA22-LR-8M («LR8M» закрашенные квадраты), и HA22-L010 («L010», не закрашенные квадраты), которая уменьшает уровень антител, реагирующих с НА22, на 50% (пунктирная линия) в сыворотке первого (фигура 11А) и второго (фигура 11В) пациентов, проходящих клинические испытания с НА22.

На Фигуре 12 приведен график, показывающий процент связывания антител с НА22, HA22-LR-8M, HA22-L010 (HA22-LRL010) или HA22-LRL010R в сыворотке пациентов, получающих лечение РЕ38.

Подробное описание изобретения

Экзотоксин A Pseudomonas («РЕ») является бактериальным токсином (молекулярная масса 66 кДа), секретируемым синегнойной палочкой Pseudomonas aeruginosa. Нативная последовательность РЕ дикого типа (SEQ ID NO:1) приведена в патенте США 5602095, который включен здесь посредством ссылки. Нативный РЕ дикого типа включает три структурных домена, которые опосредуют цитотоксичность. Домен la (аминокислоты 1-252) опосредует связывание с клеткой, домен II (аминокислоты 253-364) опосредует перемещение в цитозоль и домен III (аминокислоты 400-613) опосредует ADP-рибозилирование фактора элонгации 2. Хотя считается, что структурная граница домена III РЕ начинается с остатка 400, предполагается, что домену III может требоваться фрагмент домена Ib, чтобы сохранить ADP-рибозилирующую активность. Соответственно, функциональный домен III определяется как остатки 395-613 РЕ. Функция домена Ib (аминокислоты 365-399) остается неопределенной. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией или механизмом, полагают, что цитотоксическая активность РЕ происходит через ингибирование синтеза белка в эукариотических клетках, например, путем инактивации ADP-рибозилированием фактора элонгации 2 (EF-2).

Замены в РЕ определены здесь по отношению к аминокислотной последовательности РЕ. Таким образом, замены РЕ описаны здесь в виде аминокислотного остатка, присутствующего в определенном положении, после которого указана аминокислота, на которую указанный остаток был заменен в конкретной обсуждаемом случае. В связи с этим позиции аминокислотной последовательности конкретного варианта воплощения РЕ упоминаются здесь как позиции аминокислотной последовательности конкретного варианта воплощения или как позиции, определяемые по SEQ ID NO:1. Когда позиции определены по SEQ ID NO:1, то фактические позиции аминокислотной последовательности конкретного варианта воплощения РЕ определяются относительно соответствующих положений в SEQ ID NO:1 и могут иметь номера позиций остатков, отличные от номеров позиций остатков из SEQ ID NO:1. Так, например, при замене, относящейся к замене аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности конкретного варианта воплощения РЕ, соответствующей указанной позиции 613 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, следует понимать, что фактические позиции в соответствующих аминокислотных последовательностях могут быть различными. Например, если позиции определены по SEQ ID NO:1, термин «R490» относится к аргинину, обычно присутствующему в положении 490 в SEQ ID NO:1, «R490A» означает, что обычно присутствующий аргинин в положении 490 в последовательности SEQ ID NO:1 заменен на аланин, a «K590Q» означает, что обычно присутствующий в положении 590 в SEQ ID NO:1 лизин заменен на глутамин. В случае множественных замен в двух или более позициях две или более замены могут быть одинаковыми или различными, т.е. каждый аминокислотный остаток из двух или нескольких замененных аминокислотных остатков может быть заменен одинаковыми или разными аминокислотными остатками, если явно не указано иное.

Термины «экзотоксин Pseudomonas» и «РЕ», используемые в данном изобретении, включают РЕ, который был изменен относительно нативного белка, чтобы уменьшить или устранить иммуногенность. Такие модификации могут включать устранение домена 1а, различные аминокислотные делеции в областях Ib, II, и III, отдельные аминокислотные замены и добавление одной или нескольких последовательностей на карбоксильный конец, таких как DEL и REDL (SEQ ID NO:7), но не ограничиваются ими. Смотри Siegall et al., J. Biol. Chem., 264: 14256-14261 (1989). Такие модифицированные РЕ могут быть дополнительно модифицированы, чтобы включать любую замену (замены) согласно изобретению одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких Т-клеточных и/или В-клеточных эпитопах, описанных здесь. В одном из вариантов модифицированный РЕ может быть цитотоксическим фрагментом нативного РЕ дикого типа. Цитотоксические фрагменты РЕ могут включать те, которые являются цитотоксическими при последующем протеолитическом или другом процессинге в клетке-мишени или без него (например, как белок или белок-предшественник). В предпочтительном варианте воплощения цитотоксический фрагмент РЕ сохраняет по меньшей мере около 20%, предпочтительно по меньшей мере примерно 40%, более предпочтительно около 50%, еще более предпочтительно 75%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 90%, иеще более предпочтительно 95% цитотоксичности нативного РЕ. В особенно предпочтительных вариантах воплощения цитотоксический фрагмент имеет по меньшей мере цитотоксичность нативного РЕ, и предпочтительно увеличенную цитотоксичность по сравнению с нативным РЕ.

Модифицированный РЕ с уменьшенной или устраненной иммуногенностью включает, например, РЕ4Е, РЕ40, РЕ38, РЕ25, PE38QQR, PE38KDEL и РЕ35. В одном варианте воплощения РЕ может быть любым из РЕ4Е, РЕ40, РЕ38, РЕ25, PE38QQR (в котором РЕ38 имеет последовательность QQR, добавленную на С-конец), PE38KDEL (в котором РЕ38 имеет KDEL последовательность (SEQ ID NO:5), добавленную на С-конец), PE-LR (устойчивый к деградации лизосомами) и РЕ35.

В одном варианте РЕ был изменен, чтобы уменьшить иммуногенность, путем удаления домена la, как описано в патенте США 4892827, который включен здесь посредством ссылки. РЕ могут быть также модифицированы путем замены определенных остатков домена Ia. В одном варианте воплощения изобретения РЕ может представлять собой РЕ4Е, который является РЕ с заменами, в котором домен 1а присутствует, но в котором основные остатки домена 1а в положениях 57, 246, 247, и 249 заменены кислотными остатками (например, глутаминовой кислотой), как описано в патенте США 5512658, который включен здесь посредством ссылки.

РЕ40 является усеченным производным РЕ (Pai et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 88: 3358-62 (1991) и Kondo et al„ Biol. Chem., 263: 9470-9475 (1988)). PE35 является 35 кДа карбокси-концевым фрагментом РЕ, в котором аминокислотные остатки 1-279 удалены и молекула начинается с Met в положении 280 с последующими аминокислотами 281-364 и 381-613 нативного РЕ. PE35 и РЕ40 раскрыты, например, в патентах США 5602095 и 4892827, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки. РЕ25 содержит 11-аминокислотный фрагмент домена II и весь домен III. В некоторых вариантах осуществления РЕ содержит только домен III.

В предпочтительном варианте воплощения РЕ представляет собой РЕ38. РЕ38 содержит транслоцирующий и ADP-рибозилирующий домены РЕ, но не часть, связывающуюся с клеткой (Hwang J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987)). РЕ38 представляет собой усеченный белок-предшественник РЕ, состоящий из аминокислот 253-364 и 381-613 (SEQ ID NO:144), который активируется в его цитотоксическую форму после процессинга в клетке (см., например, патент США 5608039, который включен здесь посредством ссылки, и Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta, 1333: C1-C6 (1997)).

В другом предпочтительном варианте воплощения РЕ представляет собой PE-LR. PE-LR содержит делецию домена II за исключением последовательности, расщепляемой фурином (FCS), соответствующей аминокислотным остаткам 274-284 в SEQ ID NO:1 (RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO:8)) и делецию аминокислотных остатков 365-394 домена Ib. Таким образом, PE-LR содержит аминокислотные остатки 274-284 и 395-613 из SEQ ID NO:1. PE-LR описан в международной патентной заявке WO 2009/032954, которая включена здесь посредством ссылки. PE-LR может, при необходимости, дополнительно содержать соединительный пептид GGS между FCS и аминокислотными остатками 395-613 в SEQ ID NO:1.

Как отмечалось выше, альтернативно или дополнительно, часть или весь домен Ib может быть удален, а остальные части соединены линкером или непосредственно пептидной связью. Альтернативно или дополнительно, некоторые части домена II могут быть удалены. Альтернативно или дополнительно, С-конец может содержать нативную последовательность остатков 609-613 (REDLK) (SEQ ID NO:6), или может содержать вариации, которые могут поддерживать способность РЕ к транслокации в цитозоль, такие как KDEL (SEQ ID NO:5) или REDL (SEQ ID NO:7), и повторы этих последовательностей. См., например, патенты США 5854044; 5821238; и 5602095 и международную патентной заявку WO 1999/051643, которые включены здесь посредством ссылки. Любая форма РЕ, в котором иммуногенность была устранена или уменьшена, может быть использована в сочетании с любой из замен согласно изобретению одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более Т-клеточном и/или В-клеточном эпитопах, описанных здесь, до тех пор, пока он остается цитотоксичным для клеток-мишеней, например, путем транслокации и рибозилирования EF-2 в клетках-мишенях.

Вариант воплощения изобретения обеспечивает экзотоксин А Pseudomonas (РЕ), включая любую из модификаций нативного белка РЕ, описанного здесь, представленный аминокислотной последовательностью, имеющей замену одного или нескольких аминокислотных остатков из L294, L297, Y298, L299 и R302, при условии, что когда аминокислотная последовательность содержит замену остатка R302 на аминокислоту аланин, по крайней мере, еще один дополнительный аминокислотный остаток заменен, где аминокислотные остатки L294, L297, Y298, L299 и R302 определены относительно SEQ ID NO:1, необязательно с замещением одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1 и/или с замещением одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более Т-клеточных эпитопах в аминокислотных остатках R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1. Предпочтительно, замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более Т-клеточных эпитопах представляет собой замену одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, Y470, 1471, А472, Р475, А476, L477, 1493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, Р509, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558.

Еще один вариант воплощения изобретения относится к экзотоксину А Pseudomonas (РЕ), включая любую из модификаций нативного белка РЕ, описанного здесь, представленному аминокислотной последовательностью, имеющей замену одного или нескольких аминокислотных остатков из L294, L297, Y298, L299 и R302, при условии, что когда аминокислотная последовательность содержит замену остатка R302 на аминокислоту аланин, по меньшей мере один из аминокислотных остатков L294, L297, Y298, и L299 является замещенным, где аминокислотные остатки L294, L297, Y298, L299 и R302 определены относительно SEQ ID NO:1, необязательно с заменой одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1 и/или заменой одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких Т-клеточных эпитопах в аминокислотных остатках R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1. Было обнаружено, что аминокислотные остатки L294, L297, Y298, L299 и R302 расположены в пределах одного или нескольких Т-клеточных эпитопов РЕ. Таким образом, замена одного или нескольких аминокислотных остатков из L294, L297, Y298, L299 и R302 может, предпочтительно, удалять один или несколько Т-клеточных эпитопов. Соответственно, РЕ согласно изобретению могут быть, предпочтительно, менее иммуногенными, чем незамещенные РЕ (например, дикого типа).

Заменой одного или более аминокислотных остатков из L294, L297, Y298, L299 и R302 может быть замена любого одного или более аминокислотных остатков из L294, L297, Y298, L299 и R302. В одном из вариантов воплощения изобретения, один или несколько аминокислотных остатков из L294, L297, Y298, L299 и R302 заменяют на аланин, глицин, серин или глутамин вместо одного или нескольких аминокислотных остатков из L294, L297, Y298, L299 и R302.

В одном из вариантов воплощения изобретения РЕ содержит X₁VAX₂X₃X₄AAX₅LSW РЕ (SEQ ID NO:2), где X₁, Х₂, и Х₄ независимо представляют собой лейцин, аланин, глицин, серин или глутамин; Х₃ представляет собой тирозин, аланин, глицин, серин или глутамин; и Х₅ представляет собой аргинин, аланин, глицин, серин или глутамин, при условии, что РЕ не содержит LVALYLAARLSW (SEQ ID NO:3) и, когда Х₅ представляет собой аланин, по крайней мере один из Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляет собой аланин, глицин, серин или глутамин.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к экзотоксину А Pseudomonas (РЕ), представленному аминокислотной последовательностью РЕ, имеющей замену одного или более аминокислотных остатков из D463, Y481 и L516, определенных относительно SEQ ID NO:1, при условии, что, когда аминокислотный остаток в положении 516 заменен на аланин, по крайней мере один из аминокислотных остатков D463 и Y481 также заменен, где РЕ необязательно имеет дополнительные замены одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более В клеточных эпитопах и/или также замены одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более Т-клеточных эпитопах и/или делеции одного или более последовательных аминокислотных остатков, выбранных из остатков 1-273 и 285-394 в SEQ ID NO:1. Предпочтительно, замены одного или более аминокислотных остатков D463, Y481 и L516 являются, независимо, заменами на аланин, глицин, серин или глутамин одного или более аминокислотных остатков из D463, Y481 и L516. Было обнаружено, что аминокислотные остатки D463, Y481 и L516 расположены в пределах одного или нескольких В-клеточных эпитопов РЕ. Таким образом, замещение одного или более аминокислотных остатков из D463, Y481 и L516 может, предпочтительно, удалять один или несколько Т-клеточных и/или В-клеточных эпитопов. Соответственно, РЕ согласно изобретению могут, предпочтительно, быть менее иммуногенными, чем незамещенный РЕ (например, дикого типа).

В варианте воплощения изобретения дополнительным замещением аминокислот в одном или нескольких В-клеточных эпитопах является замена одного или более из аминокислотных остатков Е282, Е285, Р290, R313, N314, Р319, D324, Е327, Е331, Q332, D403, D406, R412, R427, Е431, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, Е522, R538, Е548, R551, R576, Q592 и L597, определенных относительно последовательности SEQ ID NO:1. Предпочтительно, дальнейшее замещение аминокислот в одном или нескольких В-клеточных эпитопах представляет собой замену, независимо, на аланин, глицин или серин одного или нескольких аминокислотных остатков из R427, R458, R467, R490, R505 и R538. В особенно предпочтительном варианте заменами одного или нескольких аминокислотных остатков из D463, Y481 и L516 является замена на аланин аминокислотного остатка D463 и дальнейшее замещение аминокислот в одном или нескольких В-клеточных эпитопах: (а) замена аминокислотного остатка R427 на аланин, (б) замена аминокислотного остатка R458 на аланин, (в) замена аминокислотного остатка R467 на аланин, (г) замена аминокислотного остатка R490 на аланин; (д) замена аминокислотного остатка R505 на аланин и (е) замена аминокислотного остатка R538 на аланин относительно SEQ ID NO:1.

В дополнение к замене (заменам) одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или более Т-клеточных и/или В-клеточных эпитопах РЕ, описанных здесь, РЕ согласно изобретению может, по желанию, также содержать дополнительную замену (замены) одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1. В связи с этим, в одном из вариантов воплощения изобретения РЕ имеет замену одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения замещение одной или более аминокислот в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1 включает замену на аланин, глицин, серин или глутамин одной или нескольких аминокислот в одном или более В-клеточных эпитопах из SEQ ID NO:1. Замена (замены) в пределах одного или нескольких В-клеточных эпитопов может, предпочтительно, еще больше снизить иммуногенность путем удаления одного или более В-клеточных эпитопов. Замена (замены) могут быть расположены в любом подходящем В-клеточном эпитопе РЕ. Примеры В-клеточных эпитопов раскрыты, например, в международной патентной заявке WO 2007/016150, WO 2009/032954 и WO 2011/032022, каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки. В предпочтительном варианте воплощения замена одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1 представляет собой замену на аланин, глицин, серин или глутамин, независимо, одного или нескольких из аминокислотных остатков из Е282, Е285, Р290, R313, N314, Р319, D324, Е327, Е331, Q332, D403, D406, R412, R427, Е431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, Е522, R538, Е548, R551, R576, К590, Q592 и L597, где аминокислотные остатки Е282, Е285, Р290, R313, N314, Р319, D324, Е327, Е331, Q332, D403, D406, R412, R427, Е431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, Е522, R538, Е548, R551, R576, К590, Q592 и L597 определены относительно SEQ ID NO:1. В особенно предпочтительном варианте замены аминокислот в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1 представляет собой замены на аланин, глицин или серин одного или нескольких аминокислотных остатков из D406, R432, R467, R490, R513, Е548, К590 и Q592. В особенно предпочтительном варианте замены аминокислот в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO представляют собой:1: (а) замену аминокислотного остатка D406 на аланин, (б) замену аминокислотного остатка R432 на глицин, (в) замену аминокислотного остатка R467 на аланин, (г) замену аминокислотного остатка R490 на аланин; (д) замену аминокислотного остатка R513 на аланин; (е) замену аминокислотного остатка Е548 на серин; (ж) замену аминокислотного остатка К590 на серин и (з) замену аминокислотного остатка Q592 на аланин.

В одном из вариантов воплощения изобретения РЕ представлен аминокислотной последовательностью, имеющей замену одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1, отдельно или в сочетании с любыми другими заменами, описанными здесь. В одном из вариантов воплощения изобретения замена одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1 представляет собой замену одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, Y470, 1471, А472, Р475, А476, L477, I493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, Р509, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558.

Замена одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1 может быть заменой на любой аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях из R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO: 1. Замена одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO: 1 может включать, например, замену на аланин, глицин, серин или глутамин одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 421, 422, 423, 425, 427, 429, 439, 440, 443, 444, 446, 447, 450, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 551, 552, 554, 555, 556 и 558 из SEQ ID NO: 1. В предпочтительном варианте воплощения изобретения замена одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO: 1 представляет собой замену на аланин, глицин, серин или глутамин одного или более аминокислотных остатков из R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, Y470, I471, А472, Р475, А476, L477, I493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, Р509, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558. Одна или несколько замен в одном или нескольких Т-клеточных эпитопах, расположенных в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 в РЕ, определенных относительно SEQ ID NO: 1, могут еще больше уменьшить иммуногенность РЕ. В одном варианте воплощения аминокислотная последовательность не имеет замен одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 427, 467, 485,490, 505, 513, 516 и 551.

В другом варианте воплощения изобретения РЕ представлен аминокислотной последовательностью, имеющей замену одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO: 1, при условии, что, когда аминокислотный остаток в положении Q485 или L516 заменен аланином, по крайней мере, один дополнительный аминокислотный остаток также заменен, и когда аминокислотный остаток в положении R427, R467, R490, R505, R513 или R551 заменен на аланин, глицин, серин или глутамин, или когда аминокислотный остаток в положении R490 заменен на валин, лейцин или изолейцин, по крайней мере, один дополнительный аминокислотный остаток также заменен, что не включает в себя замену на аланин, глицин, серин или глутамин аминокислотного остатка в положении 282, 285, 290, 313, 314, 319, 324, 327, 331, 332, 403, 406, 412, 427, 431, 432, 458, 461, 467, 490, 505, 513, 522, 538, 548, 551, 576, 590, 592 или 597, или замену на валин, лейцин или изолейцин аминокислотного остатка в положении 490, где аминокислотные остатки 282, 285, 290, 302, 313, 314, 319, 324, 327, 331, 332, 403, 406, 412, 427, 431, 432, 458, 461, 463-519, 522, 538, 548, 551, 576, 590, 592 и 597 определены относительно SEQIDNO:1.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения РЕ представлен аминокислотной последовательностью, имеющей замену одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1, при условии, что, когда аминокислотный остаток в положении Q485 или L516 заменен на аланин, по крайней мере один дополнительный аминокислотный остаток в позиции R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1 также заменен, и, когда аминокислотный остаток в положении R427, R467, R490, R505, R513 или R551 заменен аланином, глицином, серином или глутамином, или когда аминокислотный остаток в положении R490 заменен на валин, лейцин или изолейцин, то, по крайней мере, один дополнительный аминокислотный остаток в позиции R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 из SEQ ID NO:1 также заменен, что не включает в себя замену на аланин, глицин, серин или глутамин аминокислотного остатка в положении R427, R467, R490, R505, R513 или R551, или замену на валин, лейцин или изолейцин аминокислотного остатка в положении R490, где аминокислотные остатки R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, 1450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558 определены относительно SEQ ID NO:1.

Предпочтительно, РЕ содержит одну или несколько замен, которые повышают цитотоксичность, как раскрыто, например, в международной патентной заявке WO 2007/016150, которая включена здесь посредством ссылки. В этом отношении вариант воплощения настоящего изобретения обеспечивает РЕ с заменой аминокислоты в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1, где заменой аминокислоты в одном или нескольких В-клеточных эпитопах SEQ ID NO:1 является замена на валин, лейцин или изолейцин аминокислотного остатка R490, где аминокислотный остаток R490 определен относительно SEQ ID NO:1. В одном варианте воплощения изобретения замена одного или нескольких аминокислотных остатков в положениях 313, 327, 331, 332, 431, 432, 505, 516, 538 и 590, определенных относительно SEQ ID NO:1, на аланин или глутамин может обеспечить РЕ с повышенной цитотоксичностью, как раскрыто, например, в международной патентной заявке WO 2007/ 016150, которая включена здесь посредством ссылки. Повышение цитотоксической активности и снижение иммуногенности могут происходить одновременно, и не являются взаимоисключающими. Замены, которые и увеличивают цитотоксическую активность, и уменьшают иммуногенность, такие как замена R490 на глицин или, более предпочтительно, аланин, являются особенно предпочтительными.

В одном варианте воплощения изобретения РЕ представлен аминокислотной последовательностью, имеющей формулу I:

где:

m, n, и р независимо равны 0 или 1;

FCS представляет собой аминокислотную последовательность расщепления фурином, которая