Способ определения свободно-радикального окисления в модельной системе

Способ определения свободно-радикального окисления в модельной системе

Реферат

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к лабораторным способам определения скорости перекисного окисления липидов, и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности растительного сырья, в частности, для разработки способов лечения окислительного стресса у животных.

В настоящее время считается, что целый ряд патологий и патологических состояний сопровождается развитием окислительного стресса, характеризующегося патологически высоким уровнем свободнорадикального окисления и снижением ниже нормы антиоксидантной защиты.

Для изыскания средств и разработки способов антиоксидантной защиты на их основе необходимо убедиться в их антиоксидантной активности, для чего используются модельные системы перекисного окисления липидов.

Известны модельные системы перекисного окисления липидов (ПОЛ), уровень свободнорадикального окисления в которых определяют по показателю малонового диальдегида (МДА). Изучение антиоксидантной активности химических соединений проводят с использованием в качестве субстрата ПОЛ липосомальных дисперсий, приготовленных инжекторным способом. Для получения липосом в основном используют яичный лецитин [Зайцев В.Г. Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиоксидантного действия лекарственных препаратов. Дисс. к-та биол. наук. - Волгоград. - 2001. - С. 104] и соевый лецитин [Ярован Н.И., Комиссарова Н.А. Разработка препаратов с антиоксидантной защитой для птиц на основе сабельника болотного (Comarum palustre L.), Вестник ОрелГАУ - 2014. - С. 36-40].

Наиболее близким техническим решением к заявляемому решению является способ оценки антиоксидантной активности растительного сырья из сабельника болотного (Comarum palustre L.), заключающийся в определении антиоксидантной активности в водных настоях сабельника болотного по снижению уровня свободнорадикального окисления, который определяют по уровню малонового диальдегида (МДА) методом взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой в модельной системе перекисного окисления липидов, представленной полученными из лецитина липосомами (патент РФ №2535139) [1].

В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм.

Недостатком использования известных модельных систем являются длительность окисления липосом и недостаточная точность определения уровня свободнорадикально окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА).

Кроме того, недостаточно изученным остается вопрос о возможности использования лецитинов различного происхождения в системе перекисного окисления липидов.

Образцы лецитина сои содержат большее количество триглицеридов, свободных жирных кислот и фосфатидилэтаноламина, однако меньшее количество фосфатидных кислот и фосфатидилхолина, чем лецитин подсолнечника, играющего определяющую роль в перекисном окислении липидов (НИИ медико-биологических проблем ГУ «ДМА» МОЗ Украины. Днепропетровск ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины», Киев BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 1, 2014) [2].

Жирные кислоты триацилглицеринов нейтрального масла, содержащегося в соевых лецитинах, более ненасыщенны по сравнению с жирными кислотами триацилглицеринов нейтрального масла, содержащегося в подсолнечных лецитинах, а жирные кислоты, содержащиеся в фосфолипидах соевых лецитинов, более насыщенны по сравнению с жирными кислотами, содержащимися в фосфолипидах подсолнечных лецитинов (Корнена Е.П. Химический состав, строение и свойства фосфолипидов подсолнечных и соевых масел. Дис. … д-ра техн. наук. Краснодар, 1987. 386 с. ) [3].

Задачей предлагаемого способа является уменьшение времени окисления липосом и повышение точности определения свободнорадикально окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА) за счет уточнения условий проведения основных этапов анализа и использования лецитина из подсолнечника.

Техническим результатом изобретения является повышение чувствительности и точности определения концентрации малонового диальдегида.

Поставленная задача и указанный технический результат достигаются благодаря тому, что в способе получения модельной системы на основе лецитина из подсолнечника для определения свободнорадикального окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА), включающем получение 10% спиртового раствора лецитина, из 0,25 мл полученного раствора лецитина и 5 мл дистиллированной воды инжекционным способом готовят суспензию липосом, в полученную суспензию липосом добавляют 0,2 мл 0,05 н. соляной кислоты и впрыскивают 0,125 мл 3 мМ перекиси водорода, нагревают при температуре 38°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Дополнительное введение кислоты в суспензию липосом объясняется необходимостью подкисления среды, поскольку процессы окисления в липосомах наиболее активно протекают в более кислой среде, что способствует большему образованию свободных радикалов и позволит сократить на 30 часов (по сравнению с прототипом) проведение анализа.

Окисление суспензии липосом проводят при температуре 38°C с целью повышения скорости протекания процесса.

Перед проведением исследования на фотоэлектроколориметре пробы подвергают центрифугированию для получения прозрачных растворов с целью повышения точности анализа.

Данная система позволяет проводить широкомасштабные исследования растительного сырья на антиоксидантную активность и повышает точность определения.

Реализация способа состоит в следующем: готовят 2 модельные системы перекисного окисления липидов: контрольную (1) - на основе соевого лецитина и опытную (2) - на основе лецитина из подсолнечника.

Пример

Экспериментальные исследования проводились в химических лабораториях ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный Университет».

Готовились 2 модельные системы перекисного окисления липидов: 1 - на основе соевого лецитина и 2 - на основе лецитина из подсолнечника (с добавлением кислоты, проведением окисления суспензии липосом при повышении температуры до 38°C с одновременным перемешиванием и центрифугированием перед фотоэлектроколориметрированием).

1 система - на основе соевого лецитина.

1 этап. Приготовление липосом. Для приготовления 10% раствора лецитина вводили лецитина в 5 мл 96%-го спирта, нагревали до 30-40°С и интенсивно перемешивали до однородного состояния. Липосомы готовили инжекционным способом: в 5 мл дистиллированной воды при постоянном интенсивном помешивании шприцом с тонкой иглой быстро впрыскивали 0,25 мл раствора 10%-ного раствора лецитина.

Окисление липосом. В приготовленную суспензию липосом впрыскивали 0,125 мл 3 мМ перекиси водорода (Н₂О₂) и нагревали при температуре 37°С в течение 6 часов. Далее 2 суток выдерживали при комнатной температуре.

2 этап. Определение концентрации МДА в модельной системе. В модельную систему к 0,5 мл суспензии липосом добавляли 0,5 мл 0,92 М раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 49 мМ 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Нагревали 15 минут на кипящей водяной бане, после чего исследовали полученный раствор на фотоколориметре при длине волны 532 нм против дистиллированной воды.

В модельной системе перекисного окисления липидов исследовали уровень свободнорадикального окисления липидов по показателю МДА, МДА определяли по реакции с ТБК.

2 система - на основе соевого лецитина.

1 этап. Приготовление липосом. Для приготовления 10% раствора лецитина вводили лецитин в 5 мл 96%-го спирта, нагревали до 30-40°С и интенсивно перемешивали до однородного состояния. Липосомы готовили инжекционным способом: в 5 мл дистиллированной воды при постоянном интенсивном помешивании шприцом с тонкой иглой быстро впрыскивали 0,25 мл раствора 10%-го раствора лецитина. Далее в суспензию липосом добавляли 0,2 мл 0,05 и соляной кислоты с целью достижения оптимальной для протекания реакции пероксидации кислотности (рН).

Окисление липосом. В приготовленную суспензию липосом модельной системы впрыскивали 0,125 мл 3 мМ перекиси водорода (Н₂О₂) и нагревали при температуре 38°С в течение 30 мин при постоянном интенсивном перемешивании.

2 этап. Определение концентрации МДА в модельной системе. В контрольную модельную систему к 0,5 мл суспензии липосом добавляли 0,5 мл 0,92 М раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 49 мМ 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Нагревали 5 минут на кипящей водяной бане с последующим охлаждением в ледяной воде в течение 5 мин, после чего пробы подвергали центрифугированию в течение 5 мин при 9000 об/мин и исследовали полученный раствор на фотоколориметре. Оптическую плотность измеряли при 532 нм против дистиллированной воды с использованием кюветы с толщиной рабочего слоя 5 мм.

Результаты определения уровня перекисного окисления липидов в известной и предложенной модельных системах представлены в таблице.

Полученные результаты показали, что в предлагаемом способе уменьшается время окисления липосом и повышается точность определения уровня свободнорадикально окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА) за счет уточнения условий проведения основных этапов анализа.

Способ получения модельной системы на основе лецитина из подсолнечника для определения свободнорадикального окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА), включающий получение 10% спиртового раствора лецитина, из 0,25 мл полученного раствора лецитина и 5 мл дистиллированной воды инжекционным способом готовят суспензию липосом, в полученную суспензию липосом добавляют 0,2 мл 0,05 н. соляной кислоты и впрыскивают 0,125 мл 3 мМ перекиси водорода, нагревают при температуре 38°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании.