Способ и конструкт для синтетического двунаправленного растительного промотора scbv

Способ и конструкт для синтетического двунаправленного растительного промотора scbv

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США, серийный номер 61/582148, поданной 30 декабря 2011. По данной заявке также испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США, серийный номер 61/641956, поданной 3 мая 2012.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение в основном относится к области молекулярной биологии растений, в частности, к области стабильной экспрессии разнообразных генов в трансгенных растениях.

Предпосылки создания изобретения

Многие виды растений обладают способностью трансформироваться с трансгенами из других видов для привнесения желаемых, с агрономической точки зрения, свойств или характеристик, например, улучшения качества пищевой ценности, повышения урожайности, придания устойчивости к сельскохозяйственным вредителям или заболеваниям, повышения устойчивости к засухе и стрессу, улучшения плодовых качеств (таких как пигментация и рост), придания устойчивости к гербицидам, обеспечивая производство полезных в промышленности соединений и/или веществ из растений, и/или обеспечивая производство фармацевтических средств. Введение трансгенов в клетки растений и последующее выявление плодоносящих трансгенных растений, которые содержат стабильно интегрированную копию трансгена, может быть использовано для получения трансгенных растений, обладающих заданными свойствами.

Контроль и регуляция экспрессии гена могут происходить посредством различных механизмов. Инициация транскрипции гена является доминирующим механизмом контроля экспрессии гена. Инициация транскрипции в основном контролируется полинуклеотидными последовательностями, локализованными в 5’-фланкирующей или расположенной выше области транскрибируемого гена. Эти последовательности в совокупности называют промоторами. Промоторы, как правило, содержат сигналы для РНК-полимеразы начать транскрипцию для синтеза матричной РНК (мРНК). На зрелой мРНК происходит трансляция рибосомой с образованием, таким образом, белков. ДНК-связывающие белки взаимодействуют специфически с промоторными ДНК-последовательностями для стимуляции образования транскрипционного комплекса и инициации процесса экспрессии гена. Существует большое разнообразие эукариотических промоторов, выделенных и охарактеризованных из растений, которые являются функциональными для управления экспрессией трансгена в растениях. Были выделены и охарактеризованы промоторы, влияющие на экспрессию гена в ответ на стимулы окружающей среды, усвояемость питательных веществ или неблагоприятные условия, включая тепловой шок, анаэробиоз или наличие тяжелых металлов. Существуют также промоторы, которые контролируют экспрессию генов во время развития или в ткани, или органоспецифическим образом. Кроме того, были выделены и охарактеризованы прокариотические промоторы из бактерий и вирусов, которые являются функционально активными в управлении экспрессией трансгена в растениях.

Конкретный эукариотический промотор состоит из минимального промотора и других цис-элементов. Минимальный промотор является по существу ТАТА-боксобластью, где РНК-полимераза II (polII), ТАТА-связывающий белок (TBP) и ТВР-ассоциированные факторы (TAF) могут связываться для инициации транскрипции. Однако, в большинстве случаев, элементы последовательности, отличные от ТАТА-мотива, необходимы для точной транскрипции. Было обнаружено, что такие элементы последовательности (например, энхансеры) повышают общий уровень экспрессии расположенных поблизости генов часто способом, не зависящим от расположения и/или ориентации. Другие последовательности рядом с сайтом начала транскрипции (например, INR-последовательности) некоторых генов polII могут предоставлять альтернативный сайт связывания для факторов, которые также вносят вклад в активацию транскрипции, альтернативно, даже предоставляя основные сайты связывания промотора для транскрипции в промоторах, у которых отсутствуют функциональные ТАТА-элементы. См., например, Zenzie-Gregory et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2823-30.

Другие регуляторные элементы гена включают последовательности, которые взаимодействуют со специфическими ДНК-связывающими факторами. Эти мотивы последовательностей в некоторых случаях называют цис-элементами, и они, как правило, зависят от расположения и ориентации, хотя они могут быть обнаружены с 5' или 3' стороны кодирующей последовательности гена или в интроне. Такие цис-элементы, с которыми связываются тканеспецифичные или специфичные для развития транскрипционные факторы, индивидуально или в комбинации, могут определять пространственно-временной паттерн экспрессии промотора на транскрипционном уровне. Расположение в определенном порядке идущих против хода транскрипции цис-элементов вслед за минимальным промотором, как правило, задает полярность определенного промотора. Промоторы в растениях, которые были клонированы и широко использованы как для фундаментальных исследований, так и в биотехнологическом масштабе, как правило, являются однонаправленными, управляя только одним геном, который был соединен с их 3'-концом (то есть, по ходу транскрипции). См., например, Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9; патент США 6388170.

Множество цис-элементов (или "расположенные против хода транскрипции регуляторные последовательности") было идентифицировано в промоторах растений. Эти цис-элементы широко варьируют по типу контроля, который они осуществляют на функционально связанные гены. Некоторые элементы увеличивают транскрипцию функционально связанных генов в ответ на стимулы окружающей среды (например, температура, влажность и повреждение). Другие цис-элементы могут отвечать на сигналы развития (например, зарождение, созревание семени и цветение) или пространственную информацию (например, тканевую специфичность). См., например, Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23. Тип контроля специфических элементов промотора, как правило, является внутренним качеством промотора; то есть, гетерологичный ген под контролем такого промотора, по-видимому, экспрессируется в соответствии с контролем нативного гена, из которого был выделен элемент промотора. Также эти элементы, как правило, могут быть заменены другими элементами и поддерживать их характерный внутренний контроль над экспрессией гена.

Часто необходимо вводить множество генов в растения для метаболической инженерии и создания характерной многоуровневой структуры, гены которой часто контролируются идентичными или гомологичными промоторами. Однако основанное на гомологии подавление экспрессии гена (HBGS), по-видимому, возникает в том случае, когда множество введенных трансгенов имеют гомологичные промоторы, управляющие ими. См., например, Mol et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94. По литературным данным HBGS активно происходит в трансгенных растениях. См., например, Vaucheret and Fagard (2001) Trends Genet. 17:29-35. Было предложено несколько механизмов, объясняющих феномен HBGS, все из которых затрагивают характерное свойство гомологии последовательностей в промоторе запускать клеточные механизмы распознавания, приводящие к выключению транскрипции повторенных генов. См., например, Matzke and Matzke (1995) Plant Physiol. 107:679-85; Meyer and Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63; Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-2; and Steimer et al. (2000) Plant Cell 12:1165-78.

Способы предотвращения HBGS в трансгенных растениях часто включают создание синтетических промоторов, которые функционально эквивалентны, но имеют минимальную гомологию последовательности. Когда такие синтетические промоторы используются для экспрессирующихся в сельскохозяйственных культурах трансгенов, они могут помочь предотвратить или снизить уровень HBGS. См., например, Mourrain et al. (2007) Planta 225(2):365-79; Bhullar et al. (2003) Plant Physiol. 132:988-98. Такие промоторы могут быть созданы путем введения известных цис-элементов в новую или синтетическую нить ДНК или, альтернативно, путем "доменной замены", где домены одного промотора заменяют функционально эквивалентными доменами из других гетерологичных промоторов.

Таким образом, существует необходимость в создании конструктов и способов эффективной стабильной экспрессии множества трансгенов с минимальным риском рекомбинации или потери трансгенов вследствие селекции или многократного воспроизведения у трансгенных растений.

Описание изобретения

В настоящем описании описаны определенные синтетические промоторы, включающие минимальный промотор Ubi1. В вариантах осуществления изобретения синтетический промотор, включающий минимальный промотор Ubi1, дополнительно содержит по меньшей мере один элемент последовательности промотора SCBV или его функциональный элемент. В некоторых примерах, такой синтетический промотор ("синтетический промотор SCBV") может представлять собой промотор, обладающий способностью контролировать транскрипцию функционально связанной нуклеотидной последовательности в растительной клетке. В других примерах синтетический промотор SCBV может представлять собой синтетический двунаправленный промотор SCBV, например, нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидные последовательности элемента минимального промотора Ubi1, ориентированные в противоположном направлении относительно элементов промотора SCBV, который обладает способностью контролировать транскрипцию в растительной клетке двух функционально связанных нуклеотидных последовательностей, фланкирующих промотор. Дополнительные элементы, которые могут быть сконструированы для включения в синтетический двунаправленный промотор SCBV, включают интроны (например, интрон алькогольдегидрогеназы (ADH), экзоны и/или всю или часть расположенной против хода транскрипции области промотора. В определенных примерах синтетический двунаправленный промотор может содержать более чем один из любых вышеперечисленных элементов.

Конкретные варианты осуществления изобретения включают клетки (например, растительные клетки), содержащие синтетический промотор SCBV или его функциональный элемент. Например, конкретные варианты осуществления могут включать клетку, содержащую синтетический двунаправленный промотор SCBV или его функциональный элемент. Растительные клетки, согласно конкретным вариантам осуществления, могут присутствовать в клеточной культуре, ткани, части растения и/или целом растении. Таким образом, растение (например, однодольное или двудольное растение), содержащее клетку, имеющую синтетический промотор SCBV или его функциональный элемент, включено в некоторые варианты осуществления изобретения.

Другие варианты изобретения включают способы инициации транскрипции двух, представляющих интерес функционально связанных нуклеотидных последовательностей. Средства инициации транскрипции двух, представляющих интерес функционально связанных нуклеотидных последовательностей включают синтетический двунаправленный промотор SCBV, имеющий последовательность SEQ ID NO:5.

Также представлены конструкты и способы экспрессии множества генов в растительных клетках и/или растительных тканях. Представленные конструкты включают по меньшей мере один двунаправленный промотор, связанный с экспрессионными кассетами множества генов, где двунаправленный промотор содержит нуклеотидную последовательность функционального промотора из промотора бациллярного вируса сахарного тростника (SCBV). В некоторых вариантах осуществления в представленных конструктах и способах используют двунаправленный промотор, основанный на элементе минимального корового промотора из гена убиквитина-1 Zea mays или его функциональном эквиваленте и элементах нуклеотидной последовательности из промотора бациллярного вируса сахарного тростника. В некоторых вариантах осуществления представленные конструкты и способы обеспечивают экспрессию от трех до двадцати генов.

В одном аспекте предоставлен синтетический полинуклеотид, содержащий элемент минимального корового промотора из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians и нуклеотидную последовательность функционального промотора из промотора бациллярного вируса сахарного тростника. В одном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична SEQ ID NO:1 или ее комплементарной цепи. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID NO:1 и 16-40. В дополнительном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит SEQ ID NO:1 или ее комплементарную цепь. В дополнительном варианте осуществления элемент минимального корового промотора состоит по существу из SEQ IN NO:1 или ее комплементарной цепи. В другом варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид дополнительно содержит экзон из гена убиквитина-1 и интрон из гена убиквитина-1. В дополнительном варианте осуществления экзон получают из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians. В другом варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид дополнительно содержит интрон из гена алкогольдегидрогеназы. В другом варианте осуществления изобретения представленный синтетический полинуклеотид дополнительно содержит расположенную против хода транскрипции регуляторную последовательность из промотора бациллярного вируса сахарного тростника. В другом варианте осуществления нуклеотидная последовательность функционального промотора из полинуклеотидной последовательности промотора бациллярного вируса сахарного тростника и гена алкогольдегидрогеназы по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична SEQ ID NO:6 или ее комплементарной цепи. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления функциональная нуклеотидная последовательность промотора из промотора бациллярного вируса сахарного тростника и гена алкогольдегидрогеназы содержит SEQ ID NO:6 или ее комлементарную цепь. В дополнительном варианте осуществления функциональная нуклеотидная последовательность промотора из промотора бациллярного вируса сахарного тростника и гена алкогольдегидрогеназы состоит по существу из SEQ ID NO:6 или ее комлементарной цепи.

В одном варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид дополнительно содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из списка, включающего расположенную против хода транскрипции регуляторную последовательность (URS), энхансерный элемент, экзон, интрон, сайт старта транскрипции, TATA-бокс, консенсусный элемент теплового шока, нуклеотидную последовательность начала и/или окончания трансляции. В другом варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид дополнительно включает элемент, выбранный из группы, состоящей из расположенной против хода транскрипции регуляторной последовательности (URS), энхансерного элемента, экзона, интрона, сайта начала транскрипции, ТАТА-бокса, консенсусного элемента теплового шока, нуклеотидной последовательности начала и/или окончания трансляции, и их комбинаций. В другом варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид дополнительно содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанную с элементом минимального корового промотора. В другом варианте осуществления элемент минимального корового промотора из гена убиквитина-1кукурузы обыкновенной и нуклеотидная последовательность функционального промотора из промотора бациллярного вируса сахарного тростника расположены в обратной комплементарной ориентации относительно друг друга в полинуклеотиде.

В другом варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид содержит экзон из гена убиквитина-1, интрон из гена убиквитина-1, интрон из гена алкогольдегидрогеназы. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид содержит вторую представляющую интерес кодирующую нуклеотидную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью функционального промотора из промотора бациллярного вируса сахарного тростника. В дополнительном варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид включает полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична SEQ IN NO:5 или ее комплементарной цепи. В дополнительном варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид содержит SEQ ID NO:5 или ее комплементарную цепь. В дополнительном варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид состоит по существу из SEQ ID NO:5 или ее комплементарной цепи. В дополнительном варианте осуществления экзон или интрон получают из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians.

В дополнительном варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид содержит представляющую интерес первую кодирующую нуклеотидную последовательность, функционально связанную с элементом минимального корового промотора из гена убиквитина-1 Zea mays. В другом дополнительном варианте осуществления представленный синтетический полинуклеотид содержит представляющую интерес вторую кодирующую нуклеотидную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью функционального промотора из промотора бациллярного вируса сахарного тростника.

В другом аспекте предоставлен способ получения трансгенной клетки, включающий трансформацию клетки полинуклеотидом, представленном в настоящем описании. В одном варианте осуществления клетка представляет собой растительную клетку. В другом аспекте предоставлена растительная клетка, содержащая полинуклеотид, представленный в настоящем описании. В другом аспекте предоставлено растение, содержащее растительную клетку, представленную в настоящем описании.

В другом аспекте предоставлен способ экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в растительной клетке, включающий введение в растительную клетку представляющей интерес нуклеотидной последовательности, функционально связанной со структурами для инициации транскрипции двух функционально связанных представляющих интерес нуклеотидных последовательностей. В одном варианте осуществления предоставленный способ включает введение в растительную клетку нуклеиновой кислоты, содержащей (а) представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанную со структурами для инициации транскрипции двух функционально связанных представляющих интерес нуклеотидных последовательностей; и (b) представляющую интерес вторую нуклеотидную последовательность, функционально связанную со структурами для инициации транскрипции двух представляющих интерес функционально связанных нуклеотидных последовательностей.

В одном варианте осуществления средства инициации транскрипции двух представляющих интерес функционально связанных нуклеотидных последовательностей включают SEQ IN NO:5 или ее комплементарную цепь. В другом варианте осуществления средства инициации транскрипции двух представляющих интерес функционально связанных нуклеотидных последовательностей включает SEQ ID NO:5. В другом варианте осуществления средства инициации транскрипции двух представляющих интерес функционально связанных нуклеотидных последовательностей включает обратную комплементарную SEQ ID NO:5 нить. В другом варианте осуществления нуклеиновую кислоту вводят в растительную клетку с тем, чтобы воздействовать на предопределенный сайт в ДНК растительной клетки представляющей интерес нуклеотидной последовательности, функционально связанной со структурами для инициации транскрипции двух представляющих интерес функционально связанных нуклеотидных последовательностей. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанную со средствами инициации транскрипции двух представляющих интерес функционально связанных нуклеотидных последовательностей, направляют на предопределенный сайт, используя рекомбинацию, опосредованную нуклеазой "цинковые пальцы".

В некоторых вариантах осуществления экзон получают из гена убиквитина-1 Zea spp. В некоторых вариантах осуществления интрон получают из гена убиквитина-1 Zea spp. В некоторых вариантах осуществления Zea spp. представляет собой Zea mays или Zea luxurians.

В другом аспекте предоставлен конструкт нуклеиновой кислоты для экспрессии множества генов в растительных клетках и/или тканях. Конструкт нуклеиновой кислоты включает (а) двунаправленный промотор, где двунаправленный промотор содержит нуклеотидную последовательность функционального промотора из промотора бациллярного вируса сахарного тростника (SCBV); и (b) две генные экспрессионные кассеты на противоположных концах двунаправленного промотора; где по меньшей мере одна из генных экспрессионных кассет включает два или более генов, соединенных через переключатель трансляции.

В одном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит по меньшей мере один энхансер. В другом варианте осуществления двунаправленный промотор не содержит энхансер. В другом варианте осуществления конструкт нуклеиновой кислоты содержит бинарный вектор для опосредованной Agrobacterium трансформации. В одном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит элемент, выбранный из группы, состоящей из расположенной против хода транскрипции регуляторной последовательности (URS), энхансерного элемента, экзона, интрона, сайта начала транскрипции, TATA-бокса, консенсусного элемента теплового шока и их комбинаций. В другом варианте осуществления двунаправленный промотор содержит элемент минимального корового промотора из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians. В другом варианте осуществления изобретения элемент минимального корового промотора из гена убиквитина-1 и промоторная нуклеотидная последовательность из промотора бациллярного вируса сахарного тростника (SCBV) расположены в обратной комплементарной ориентации относительно друг друга. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичную SEQ ID NO:1 или ее комплементарной цепи. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID NO:1 и 16-40. В дополнительном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ IN NO:1 и 16-35. В дополнительном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID NO:1 и 16-30. В дополнительном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID NO:1 и 16-25. В дополнительном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID NO:1 и 16-20. В дополнительном варианте осуществления элемент минимального корового промотора содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1.

В дополнительном или альтернативном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит экзон из гена убиквитина-1 и/или интрона из гена убиквитина. В другом варианте осуществления двунаправленный промотор содержит интрон из гена алкогольдегидрогеназы. В одном варианте осуществления трансгенные растения стабильно трансформированы конструктом нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления изобретения растения представляют собой односемядольные растения. В другом варианте осуществления растения являются двудольными растениями. В другом варианте осуществления растения не являются односемядольными растениями. В другом варианте осуществления растения не являются двудольными растениями.

В дополнительном или альтернативном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит расположенную против хода транскрипции регуляторную последовательность из гена убиквитина или промотора бациллярного вируса сахарного тростника (SCBV). В дополнительном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит расположенную против хода транскрипции регуляторную последовательность из гена убиквитина. В другом варианте осуществления двунаправленный промотор содержит расположенную против хода транскрипции регуляторную последовательность из гена убиквитина или промотора бациллярного вируса сахарного тростника (SCBV).

В дополнительном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит полинуклеотид, который по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичен SEQ ID NO:5 или ее комплементарной цепи. В дополнительном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит полинуклеотид SEQ ID NO:5 или ее комплементарную цепь. В дополнительном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит полинуклеотид, который по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичен SEQ IN NO: 6 или ее комплементарной цепи. В дополнительном варианте осуществления двунаправленный промотор содержит полинуклеотид SEQ ID NO:6 или ее комплементарную цепь.

В одном варианте осуществления обе генные экспрессионные кассеты содержат два или более генов, соединенных посредством переключателя трансляции. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления переключатель трансляции выбран из группы, состоящей из участка внутренней посадки рибосомы (IRES), альтернативного сайта сплайсинга, сайта расщепления рибозимом, полинуклеотидной последовательности, кодирующей пептид 2А, полинуклеотидной последовательности, кодирующей 2А-подобный пептид, полинуклеотидной последовательности, кодирующей интеин, полинуклеотидной последовательности, кодирующей сайт расщепления протеазой или их комбинаций. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления переключатель трансляции содержит цис-действующий гидролазный элемент (CHYSEL). В дополнительном варианте осуществления CHYSEL представляет собой 2А или 2А-подобную пептидную последовательность. В другом варианте осуществления ген, расположенный против хода транскрипции относительно переключателя трансляции, не содержит стоп кодон трансляции. В другом варианте осуществления конструкт нуклеиновой кислоты обеспечивает или дает возможность экспрессии по меньшей мере четырех генов. В дополнительном варианте осуществления все четыре гена являются трансгенами. В другом варианте осуществления конструкт нуклеиновой кислоты обеспечивает экспрессию от трех до двадцати генов. В другом варианте осуществления конструкт нуклеиновой кислоты обеспечивает экспрессию от четырех до восьми генов. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления гены являются трансгенами. В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна генная экспрессионная кассета содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую химерный белок. В дополнительном варианте осуществления химерный белок содержит от трех до пяти генов.

В некоторых вариантах осуществления экспрессия генов с двунаправленного промотора по меньшей мере в четыре раза выше по сравнению с экспрессией с однонаправленного промотора. В некоторых вариантах осуществления экспрессия генов с двунаправленного промотора в три-десять раз выше по сравнению с экспрессией с однонаправленного промотора. В некоторых вариантах осуществления экспрессия генов с двунаправленного промотора в четыре-восемь раз выше по сравнению с экспрессией с однонаправленного промотора. В некоторых вариантах осуществления маркерный ген селекции расположен на дальнем конце от промотора (то есть, на 3’-конце генной экспрессионной кассеты по ходу транскрипции другого гена).

В другом аспекте предоставлен способ получения трансгенного растения, включающий трансформацию растительной клетки конструктом нуклеиновой кислоты, представленным в настоящем описании. В другом аспекте предоставлена растительная клетка, содержащая конструкт нуклеиновой кислоты, представленный в настоящем описании. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления растительная клетка стабильно трансформирована конструктом нуклеиновой кислоты. В другом аспекте представлено трансгенное растение, содержащее конструкт нуклеиновой кислоты, представленный в настоящем описании. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления клетки трансгенного растения стабильно трансформированы конструктом нуклеиновой кислоты. В другом аспекте предоставлен способ экспрессии множества генов в растительных клетках и/или тканях, включающий введение в растительные клетки и/или ткани конструкта нуклеиновой кислоты, представленного в настоящем описании. В дополнительном или альтернативном варианте осуществления растительные клетки и/или ткани стабильно трансформированы конструктом нуклеиновой кислоты, представленном в настоящем описании. В другом аспекте предоставлен бинарный вектор для трансформации, опосредованной Agrobacterium. В одном варианте осуществления бинарный вектор содержит конструкт нуклеиновой кислоты, представленный в настоящем описании. В другом варианте осуществления бинарный вектор содержит синтетический полинуклеотид, представленный в настоящем описании. В другом аспекте, предоставлено применение двунаправленного промотора, представленного в настоящем описании, для экспрессии множества трансгенов в растениях.

Краткое описание фигур и последовательностей

На фиг. 1 показан конкретный (не в масштабе) промотор Ubi1 кукурузы (ZmUbi1), который содержит приблизительно 900 п.о. идущего против хода транскрипции элемента, расположенного с 5'-конца сайта инициации транскрипции (TSS). Идущий против хода транскрипции элемент содержит ТАТА-бокс (расположенный приблизительно на расстоянии -30 п.о. относительно TSS) и два перекрывающихся консенсусных элемента теплового шока (расположенных приблизительно на расстоянии -200 п.о. относительно TSS). Этот промотор также содержит приблизительно 1100 п.о., расположенных с 3'-конца участка TSS. 3'-участок содержит прилегающую лидерную последовательность (экзон ZmUbi1) и интрон.

На фиг. 2 показан пример осуществления представленного в настоящем описании синтетического двунаправленного промотора Ubi1, который содержит элемент минимального корового промотора minUbi1P, клонированный в участке, предшествующем промотору ZmUbi1.

На фиг. 3 показано конкретное схематическое изображение экспрессионных кассет генов YFP и GUS, каждая из которых функционально связана с синтетическим двунаправленным промотором Ubi1.

На фиг. 4 показана репрезентативная карта плазмиды pDAB105801.

На фиг. 5 показано схематическое изображение конкретного двунаправленного промотора бациллярного вируса сахарного тростника (SCBV), который содержит элемент минимального корового промотора minUbi1P, клонированный в участке, предшествующем промотору SCBV.

На фиг. 6 показана репрезентативная карта плазмиды pDAB105806.

На фиг. 7 показано конкретное схематическое изображение экспрессионных кассет генов YFP и GUS, каждая из которых функционально связана с синтетическим двунаправленным промотором SCBV.

На фиг. 8 показано конкретное схематическое представление мультигенных конструктов, представленных в настоящем описании. Переключатели трансляции изображены, используя специальный (вертикальный гантелеобразный) символ.

На фиг. 9 показаны репрезентативные карты плазмид pDAB108708 и pDAB101556.

На фиг. 10А показана SEQ ID NO:1, которая содержит участок длиной 215 п.о. элемента минимального корового промотора убиквитина 1 Zea mays (minUbi1P). На фиг.10В показана SEQ ID NO:2, которая содержит обратную комплементарную цепь полинуклеотида, содержащую элемент минимального корового промотора minUbi1P Z. mays (подчеркнут); лидерную последовательность Ubi1 Z. Mays (экзон ZmUbi1; жирный шрифт) и интрон Ubi1 Z. Mays (строчный шрифт).

На фиг. 11 показана SEQ ID NO:3, которая содержит конкретный синтетический двунаправленный промотор Ubi1, в котором обратная цепь первого minUbi1Р и второй minUbi1Р подчеркнуты.

На фиг. 12 показана SEQ ID NO:4, которая содержит конкретную нуклеиновую кислоту, включающую экспрессионные кассеты генов YFP и GUS, управляемые синтетическим двунаправленным промотором Ubi1.

На фиг. 13 показана SEQ ID NO:5, которая содержит конкретный двунаправленный промотор SCBV, содержащий элемент минимального корового промотора minUbi1P, где обратная комплементарная цепь minUbi1P подчеркнута.

На фиг. 14 показана SEQ ID NO:6, которая содержит промотор SCBV, содержащий экзон 6 ADH1 (подчеркнут), интрон 6 (строчный шрифт) и экзон 7 (жирный шрифт).

На фиг. 15 показана SEQ ID NO:7, которая содержит нуклеиновую кислоту, включающую экспрессионные кассеты генов YFP и GUS, управляемые конкретным двунаправленным промотором SCBV.

SEQ ID NO:8 содержит прямой праймер YFP: 5'-GATGCCTCAGTGGGAAAGG-3'. SEQ ID NO:9 содержит обратный праймер YFP: 5'-CCATAGGTGAGAGTGGTGACAA-3'. SEQ ID NO:10 содержит прямой праймер инвертазы: 5'-TGGCGGACGACGACTTGT-3’. SEQ ID NO:11 содержит обратный праймер инвертазы: 5'-AAAGTTTGGAGGCTGCCGT-3'. SEQ ID NO:12 содержит зонд инвертазы: 5'-CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC-3'. SEQ ID NO:13 содержит прямой праймер AAD1: 5'-TGTTCGGTTCCCTCTACCAA-3'. SEQ ID NO:14 содержит обратный праймер AAD1: 5'-CAACATCCATCACCTTGACTGA-3'. SEQ ID NO:15 содержит зонд AAD1: 5'-CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA-3' (см. также таблицу 7).

На фиг. 16 показан Вестерн-блот-анализ для стабильной экспрессии YFP, управляемой двунаправленным конструктом промотора SCBV (pDAB108708) в Т₀ растениях кукурузы. Репрезентативные растения демонстрировали стабильную экспрессию YFP в листе, управляемую элементом минимального корового промотора Min-Ubi1P. Количество продуцируемого белка указано в частях на миллион (ч./млн.).

На фиг. 17 показан Вестерн-блот-анализ для стабильной экспрессии YFP из контрольного конструкта, содержащего промотор ZmUbi1, который управляет только экспрессией YFP (pDAB101556); кодирующая последовательность GUS не содержится в этом конструкте. Количество продуцируемого белка указано в частях на миллион (ч./млн.).

На фиг. 18 показаны конкретные конструкты для четырехгенных кассетных блоков pDAB105849 (AAD1-2A-YFP плюс Cry34-2A-Cry35) и pDAB105865 (YFP-2A-AAD1 плюс Cry34-2A-Cry35). Затемненные стрелки указывают направление транскрипции с двунаправленного промотора. Ubi1-minP содержит последовательность длиной 200 нуклеотидов, расположенную выше сайта инициации транскрипции промотора кукурузы Ubi1. SCBV-URS содержит расположенную против хода транскрипции регуляторную последовательность промотора SCBV, исключая элемент минимального корового промотора (показано в виде стрелки). Ubi1-Int содержит интрон промотора Ubi1 кукурузы.

На фиг. 19 показаны два дополнительных конкретных конструкта четырехгенных кассетных блоков.

На фиг. 20 показаны репрезентативные карты для плазмид pDAB105818 и pDAB105748.

На фиг. 21А-21Е показаны дополнительные элементы минимального корового промотора (min-Ubi1P или Ubi1-minP), имеющих последовательности SEQ ID NO:16-40.

На фиг. 22 показаны репрезентативные карты для плазмид pDAB105841 и pDAB105847.

На фиг. 23 показаны репрезентативные карты для плазмид pDAB105840 и pDAB105849.

На фиг. 24 показаны репрезентативные карты для плазмид pDAB101917 и pDAB108719.

На фиг. 25 показаны репрезентативные карты для плазмид pDAB105844 и pDAB105848.

На фиг. 26 показаны репрезентативные карты для плазмид pDAB105865 и pDAB108720.

На фиг. 27 показана последовательность нуклеиновой кислоты для генных экспрессионных кассет pDAB108719, где показан каждый ген и элемент.

На фиг. 28 показаны конкретные данные по белковой экспрессии среди различных протестированных конструктов для Cry34 (фиг. 28А), AAD-1 (фиг. 28В) и Cry35 (фиг. 28С).

На фиг. 29 показаны две конкретные последовательности для желтых флуоресцентных белков из Phialidium sp. SL-2003 (PhiYFP, SEQ ID NO:51; и PhiYFPv3, SEQ ID NO:52).

На фиг. 30 показаны конкретные варианты осуществления представленных в настоящем описании синтетического двунаправленного промотора Ubi1 и конструктов, включая pDAB108706 (двунаправленный ZMUbi (-200)), pDAB108707 (двунаправленный ZMUbi (-90)), pDAB108708 (двунаправленный SCBV (-200))и pDAB108709 (двунаправленный SCBV (-90)). pDAB101556 (контроль ZmUbi1-YFP), pDAB108715 (SCBV без минимального промотора) и pDAB108716 (ZmUbi1 без минимального промотора) служили в