Рекомбинантная клетка для производства фенольного соединения и способ производства фенольного соединения

Рекомбинантная клетка для производства фенольного соединения и способ производства фенольного соединения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №61/500518, поданной 23 июня 2011, и заявки №61/583325, поданной 5 января 2012 года, содержание которых полностью включено в данную заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к производству ароматических молекул в эукариотических и прокариотических клетках-хозяевах, таких как Е. coli, дрожжи, мицелиальные грибы, водоросли, микроскопические водоросли и другие растительные клетки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

На данный момент существует неудовлетворенная потребность в производстве многих специальных химикатов и жидких видов топлива из возобновляемых ресурсов. Несмотря на значительное отрицательное влияние на окружающую среду, атмосферу и водные запасы земли, большинство химических соединений и транспортных видов топлива все еще получаются из горючих ископаемых, таких как сырая нефть, каменноугольная смола, горючие сланцы и так далее. Особого внимания заслуживают простые фенольные соединения, такие как крезолы, которые извлекаются из каменноугольной смолы в процессе, который имеет такое отрицательное влияние на окружающую среду, что заводы США, специализировавшиеся в производстве крезола, были закрыты в последние годы. Однако это не является общим решением, поскольку проблема может быть просто перенесена в другое географическое расположение. Синтетическая биология предлагает возможные решения проблемы производства некоторых специальных химических веществ, таких как приведены выше.

Поликетиды обычно синтезируются путем конденсации соединений, содержащих два атома углерода, аналогично синтезу жирной кислоты. В общем, синтез подразумевает наличие начального соединения и разбавителя; эти соединения, «содержащие два атома углерода», получаются, например, из ацилтиоэфиров, обычно ацетил, пронионил или метилмалонил кофермент А. Существует четыре класса поликетидсинтазов (ПКС), которые отличаются таким «образом», в котором используются каталитические участки (Watanabe и Ebizuka, 2004). Модульные ПКС типа I являются одиночными белками с многочисленными «модулями», которые содержат каталитические участки, которые используются только в случае линейной организации «конвейерной линии». Итерационные ПКС типа I являются одиночными белками с участками, которые многократно используются для получения окончательного продукта поликетидов. Настоящее изобретение может использовать последовательности кодировки каждого из классов, но в предпочтительных вариантах реализации, используемые ПКС, будут получены в основном из этого класса ПКС, например, синтазы ароматических 6-метилсалициловых кислот или синтазы орселлиновой кислоты или модифицированные версии этих ферментов. Для микробиологического производства поликетидов в разнородных микроорганизмах, таких как грибы и Е. coli, были использованы кодирующие гены полипептидные компоненты ПКС типа I. См., например, патенты США 6033883, 6258566 и 7078233.

ПКС типа II содержат различные белки, каждый из которых имеет один монофункциональный активный участок. Активные участки могут использоваться только один раз или неоднократно. Наконец, ПКС типа III являются одиночными белками с различными модулями, в которых неоднократно используются активные участки.

ПКС действуют аналогично синтазам жирных кислот (СЖК). Жирные кислоты обычно состоят из гидрофобных компонентов и могут также использоваться в качестве источников энергии, таких как биотопливо. Многие эукариоты синтезируют жирные кислоты с использованием обычных или подобных метаболических путей. Жирные кислоты как часть триглицеридов хранятся в семени в качестве источника энергии для дальнейшего проращения. Путь СЖК расположен в пластиде. Ацетил-АПБ (ацил-переносящий белок) образован с помощью конденсирующего фермента, β-кетоацил-АПБ синтаза (КАС) III. Удлинение ацетил-АЦП до более длинных цепочек жирных кислот требует циклического действия конденсации соединений, содержащих 2 атома углерода, из малонил-АПБ для образования более длинного β-кетоацил-АПБ β-кетоацил-АПБ синтаза), уменьшение функции кето-вещества до спирта (β-кетоацил-АПБ редуктаза), дегидратация для образования еноил-АПБ (β-гидроксиацил-АПБ дегидраза), и наконец, уменьшение еноил-АПБ для образования удлиненного насыщенного ацил-АПБ (еноил-АПБ редуктаза). β-кетоацил-АПБ синтаза I (КАС I), главным образом отвечает за удлинение до пальмитоил-АПБ (С 16:0), причем β-кетоацил-АПБ синтаза II (КАС II) главным образом отвечает за окончательное удлинение до стеароил АПБ (С 18:0).

Аналогично, итерационные ароматические ПКС используют конденсацию соединения, содержащего 2 атома углерода, из малонил-АПБ для образования продуктов, таких как 6-метилсалициловая кислота (6-МСК), известная также как 2-гидрокси-6-метилбензойная кислота (ГМБК), и орселлиновая кислота (ССК) по биосинтетическим путям, иллюстрируемых Фигурами 1 и 2. Гибкость этих путей подчеркивается тем фактом, что бактериальные 6-СМСК могут быть предназначены для синтеза ССК простым «выбиванием» каталитической активности из области кеторедуктазы (КР) (Ding et al., Chemistry & Biology 17, 495-503, 2010).

Настоящее изобретение представляет системы для производства молекул и молекул предшественников различного применения в областях бактерицидного, фармацевтического и возобновляемого жидкого топлива. В некоторых вариантах реализации добавление механических устройств для образования пантотеновой кислоты ацил-переносящего белка (т.е. с использованием целой АПБ синтазы, известного также как ППБаза) позволяет производство указанных молекул в широком диапазоне клеток-хозяев, которые не обязательно производят такие молекулы естественным образом.

Ароматические молекулы, прямо или неявно полученные из клеток-хозяев микроорганизмов, таких как крезолы, орсины, гидроксиметилбензойные кислоты и их родственные эфиры, эстеры и лактоны, дают однородные или неоднородные соединения, которые учитываются или могут учитываться для получения соответствия используемых соединений. К таким соединениям относятся бактерициды, фармкомпозиции, витамины, ароматизаторы или возобновляемые источники энергии, такие как топливо, топливные добавки, например, обогащенные кислородом продукты, топливные вспомогательные средства, т.е. высокооктановые агенты смешивания бензинов и т.д.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 иллюстрирует путь биосинтеза 6-МСК (Beck et al., Eur J Biochem 192:487-498 (1990)).

Фигура 2 иллюстрирует путь биосинтеза 6-МСК и ССК (Ding et al., Chemistry and Biology 17:495-503 (2010)).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к производству ароматических молекул в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах, таких как Е. coli, дрожжи, нитчатые грибы, водоросли, микроводоросли, другие растительные клетки и так далее. В одном варианте реализации молекулы получены с использованием функциональных ароматических поликетидсинтазов (ПКС) и окончательное разнообразие молекул превращается в организме для производства специальных химикатов для бактерицидного или фармацевтического использования. Кроме того, настоящее изобретение рассматривает производство предшественников соединений для бактерицидного или фармацевтического использования. В одном варианте реализации предшественники обрабатываются дополнительно для получения высокооктановых ароматических или циклогексановых и циклогексаноловых молекул, которые могут быть предшественниками для дополнительных специальных химикатов и полимеров. Обрабатываемые предшественники могут быть совместимыми с реактивными топливами и топливами на основе бензина и поэтому могут использоваться в качестве возобновляемого источника энергии.

Настоящее изобретение рассматривает рекомбинантные материалы для производства и получения производных поликетидов в разнообразии хозяев и окончательных поликетидов и их производных. Для создания хозяев для производства соединений могут использоваться одиночные или множественные векторы, что известно в области техники. Одиночные векторы позволяют минимальную обработку клеток-хозяев, множественные векторы способствуют дополнительным превращениям в организме и дают большую гибкость при разработке различных новых синтетических путей.

В одном варианте реализации настоящее изобретение рассматривает модифицированную рекомбинантную клетку-хозяина для производства фенольного соединения, которое содержит i) первую систему экспрессии, по меньшей мере, с одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей ароматическую поликетидсинтазу (ПКС) для 6-метилсалициловой кислоты (6-СМСК), которая может быть экспрессирована. В другом варианте изобретения клетка-хозяин дополнительно содержит ii) вторую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую голо-ацил-переносящий белок (АПБ) синтазу, где АПБ пантотенат синтаза содержит указанную ПКС. В дополнительном варианте изобретения клетка-хозяин дополнительно содержит iii) третью систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую декарбоксилазу. В другом варианте изобретения продукт, изолированный от указанной клетки является фенольным соединением. В другом варианте изобретения ароматическая ПКС является синтазой для 6-метилсалициловой кислоты из прокариота. В другом варианте изобретения система экспрессии 6-СМСК из прокариота содержит функциональную декарбоксилазу на одном и том же векторе или на различных векторах. В другом варианте изобретения ароматическая ПКС кодируется с помощью гена ChlB1 из S. antibioticus в форме дикого типа. В дополнительном варианте изобретения фенольное соединение, которое может быть произведено клеткой и может быть изолировано из клетки, является метакрезолом.

В одном варианте изобретения ароматическая ПКС содержит неактивированную область кеторедуктазы (КР). В другом варианте изобретения ароматическая ПКС является синтазой для 6-метилсалициловой кислоты из грибка. В дополнительном варианте изобретения ароматическая ПКС является синтазой орселлиновой кислоты (СОК), закодированной геном AviM из Streptomyces viridochromogenes. В другом варианте изобретения фенольное соединение, которое может быть произведено клеткой и может быть изолировано, является орсином.

В другом варианте изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая декарбоксилазу, выбирается из группы, которая содержит ген декарбоксилазы 6-МСК из P. patulum, ген PatG из Aspergillus clavatus, ген декарбоксилазы ССК из Gliocladium roseum, гены декарбоксилазы 2,3-дигидроксибензойной кислоты из видов леечных грибов аспаргиллов и ген декарбоксилазы 5-карбоксиванильной кислоты из Sphingomonas paucimobilis SYK-6.

В другом варианте изобретения система экспрессии указанной ПКС и система экспрессии указанной голо синтазы АПБ находятся на одном векторе. В других вариантах осуществления система экспрессии указанной ПКС и указанная система экспрессии голо синтазы АПБ находятся на разных векторах. В другом варианте изобретения ПКС и указанная голо синтаза АПБ экспрессированы из дицистронной РНК.

В другом варианте изобретения модифицированная клетка содержит систему экспрессии функциональной декарбоксилазы, которая находится на одном векторе либо с системой экспрессии указанной минимальной ПКС, либо указанной системы экспрессии голо синтазы АПБ или на отдельном векторе. В другом варианте изобретения система экспрессии указанной минимальной ПКС и указанной системы экспрессии голо синтазы АПБ, и указанная система экспрессии функциональной декарбоксилазы находятся на одном векторе. В одном варианте изобретения одна, две или все три из указанных систем экспрессии интегрированы в хромосому клетки-хозяина или экспрессированы из искусственных хромосом дрожжей (ИХД). В других вариантах изобретения, по меньшей мере, две из экспрессированных ПКС, голо синтаза АПБ и декарбоксилаза получены, как производные из мультицистронной РНК. В другом варианте изобретения организм хозяина выбирается из группы, которая содержит виды Pichia pastoris и Aspergillus. В одном варианте изобретения организмом хозяина является Aspergillus niger. В другом варианте изобретения Aspergillus niger не содержит разнородную систему экспрессии голо синтазы АПБ.

В другом варианте настоящее изобретение представляет способ производства фенольного соединения. В одном варианте изобретения способ включает операцию а) представления модифицированной рекомбинантной клетки-хозяина, которая содержит i) первую систему экспрессии, по меньшей мере, с одной нуклеотидной цепочкой, кодирующей ароматическую поликетидсинтазу (ПКС) для 6-метилсалициловой кислоты (6-СМСК), которая может быть экспрессирована; ii) вторую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую голо синтазу ацил-переносящего белка (АПБ), причем АПБ пантотенат синтаза содержит указанную ПКС; и iii) третью систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую декарбоксилазу. В другом варианте изобретения способ дополнительно включает b) производство промежуточного фенольного соединения в рекомбинантной клетке-хозяине. В другом варианте изобретения способ дополнительно включает с) синтезирование фенольного соединения из промежуточного фенольного соединения, в котором рекомбинантная декарбоксилаза катализирует декарбоксилирование промежуточного фенольного соединения для образования фенольного соединения. В одном варианте изобретения промежуточное фенольное соединение является 6-МСК. В другом варианте изобретения фенольное соединение является метакрезолом.

В одном варианте изобретения ароматическая ПКС содержит неактивированную область кеторедуктазы (КР). В другом варианте изобретения ароматическая ПКС представляет собой синтазу орселлиновой кислоты (СОК), закодированную геном AviM из Streptomyces viridochromogenes. В некоторых вариантах осуществления промежуточное фенольное соединение является орселлиновой кислотой (ОК). В других вариантах изобретения фенольное соединение является орсином.

В другом варианте настоящее изобретение представляет способ производства фенольного соединения. В одном варианте осуществления способ включает а) обеспечение модифицированной рекомбинантной клетки-хозяина, которая включает i) первую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую ароматическую поликетидсинатазу (ПКС) для 6-метилсалициловой кислоты (6-СМСК), которая может быть экспрессирована; и ii) вторую систему, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую голо синтазу ацил переносящего белка (АПБ), причем синтаза АПБ содержит пантотеновую кислоту указанной ПКС. В одном варианте изобретения способ дополнительно включает b) изолирование промежуточного фенольного соединения, произведенного в рекомбинантной клетке-хозяине. В одном варианте изобретения способ дополнительно включает с) декарбоксилирующее промежуточное фенольное соединение в операции b) образования фенольного соединения путем нагрева металлическим катализатором (или другим типом катализатора) с последующим растворением. В дополнительном варианте изобретния промежуточное фенольное соединение является 6-МСК. В другом варианте изобретения промежуточное фенольное соединение является метакрезолом. В одном варианте изобретения металлический катализатор представлен в порошкообразной форме. В другом варианте изобретения металлический катализатор является цинковым катализатором.

В другом варианте настоящее изобретение представляет модифицированную рекомбинантную клетку-хозяина для производства алкилированного фенольного соединения. В одном варианте изобретения клетка содержит i) первую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую ароматическую поликетидсинтазу (ПКС) для 6-метилсалициловой кислоты (6-СМСК), которая может быть экспрессирована, и ii) вторую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую голо синтазу ацил переносящего белка (АПБ), причем синтаза АПБ содержит пантотеновую кислоту указанной ПКС, iii) третью систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую декарбоксилазу, и (iv) четвертую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую О-метилтрансферазу (ООМТ). В одном варианте изобретения продукт, который может быть произведен клеткой и изолирован от указанной клетки, является алкалированным фенольным соединением. В одном варианте изобретения алкалированное фенольное соединение является 3-метиланизол.

В одном варианте изобретения ароматическая ПКС содержит неактивированную область кеторедуктазы (КР). В другом варианте изобретения ароматическая ПКС является синтазой орселлиновой кислоты (СОК), закодированной геном AviM из Streptomyces viridochromogenes. В одном дополнительном изобретении алкалированное фенольное соединение является 3,5-диметокситолуолом.

В дополнительном варианте изобретения ООМТ закодирована геном Rosa chinensis, выбранным из группы, которая содержит ООМТ1, ООМТ2, ООМТ3, ООМТ4, СОМТ1.

В другом варианте настоящее изобретение представляет способ производства алкалированного фенольного соединения. В одном варианте изобретения способ включает а) обеспечение модифицированной рекомбинантной клетки-хозяина, которая содержит, i) по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую ароматическую поликеидсинтазу (ПКС) для 6-метилсалициловой кислоты (6-СМСК), которая может быть экспрессирована; ii) вторую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую голо синтазу ацил переносящего белка (АПБ), причем синтаза АПБ содержит пантотеновую кислоту указанной ПКС; и iii) третью систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую декарбоксилазу. В другом варианте изобретения способ дополнительно включает b) изолирование промежуточного фенольного соединения, произведенного в рекомбинантных клетках-хозяевах. В одном варианте изобретения способ дополнительно включает с) алкилирование промежуточного фенольного соединения в операции b) образования алкилированного фенольного соединения путем обработки алкилирующим агентом. В другом варианте изобретения алкилирующим агентом является метанол.

В одном варианте изобретения алкилированное промежуточное фенольное соединение является m-крезолом. В другом варианте изобретения алкилированное фенольное соединение является 3-метиланизолом.

В другом варианте изобретения ароматическая ПКС содержит неактивированную область кеторедуктазы (КР). В одном варианте изобретения ароматическая ПКС является синтазой орселлиновой кислоты (СОК), закодированной геном AviM из Streptomyces viridochromogenes. В одном варианте изобретения промежуточным алкилированным фенольным соединением является орсин. В другом варианте изобретения алкилированное фенольное соединение является 3,5-диметокситолуолом.

В другом варианте настоящее изобретения представляет способ производства фталевого ангидридного соединения, который включает а) обеспечение модифицированной рекомбинантной клетки-хозяина, которая содержит i) первую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую ароматическую поликетидсинтазу (ПКС) для 6-метилсалициловой килсоты (6-СМСК), которая может быть экспрессирована; ii) вторую систему экспрессии, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую голо синтазу ацил-переносящего белка (АПБ), причем синтаза АПБ содержит пантетеновую кислоту указанной ПКС. В другом варианте изобретения способ дополнительно включает b) изолирование промежуточного фталевого ангидридного соединения, произведенного в рекомбинантной клетке-хозяине. В другом варианте изобретения способ дополнительно включает с) окисление промежуточного фталевого ангидридного соединения в операции b) образования фталевого ангидридного соединения посредством обработки окисляющим агентом. В одном варианте изобретения промежуточное фталевое ангидридное соединение является 6-МСК. В другом варианте изобретения фталевый ангидрид является 3-гидроксифталевым ангидридом.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано обратное, то все термины из области техники, обозначения и другая используемая здесь научная терминология имеют общепонятное значение для специалистов в области техники, к которой относится это изобретение. В некоторых случаях приводится пояснение используемых здесь терминов с общепонятным значением для внесения ясности и/или для справки, и внесение таких определений не обязательно должно объясняться существующей значительной разницей с обычным пониманием в области техники. Технологии и процедуры, описанные или приведенные здесь в виде ссылки, обычно понимаются и широко используются специалистами в области техники в традиционной методологии, например, широко используемая методология молекулярного клонирования, которая была описана Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Соответственно, процедуры, в которых используются коммерчески доступные наборы и реагенты, обычно осуществляются в соответствии с протоколами и/или параметрами производителя, если не указано обратное. До приведения настоящих способов описываются наборы и применение, которое стоит понимать так, что это изобретение не ограничено определенной методологией, протоколами, клеточными линиями, видами или родами животных, и описанные здесь компоненты и реагенты естественно могут изменяться. Также стоит понимать, что используемая здесь терминология имеет целью только описание отдельных вариантов изобретения и не предназначена для ограничения области действия настоящего изобретения, которое будет ограничено только в прилагаемой формуле изобретения.

Стоит заметить, что используемые здесь и в формуле изобретения формы единственного числа предполагают соответствующее множественное число, если из контекста не явствует обратное.

В настоящем описании изобретения и формуле изобретения слово «содержит» или его однокоренные слова стоит понимать как включение заявленного целого или группы целых, а не исключение любого другого целого или группы целых.

ПКС означает поликетидсинтазу (например, 6-СМСК или ССК).

АПБ означает ацил-переносящий блок.

САПБ означает синтазу ацил-переносящего белка {например, голо синтазу АПБ).

ДК означает декарбоксилазу.

ПКС* означает модифицированную поликетидсинтазу или вариант ПКС (например, ПКС с неактивной областью кеторедуктазы).

6-СМСК означает синтазу 6-метилсалициловой кислоты.

СОК означает синтазу орселлиновой кислоты.

ООМТ означает орсин O-метилтрансферазы.

6-МСК означает 6-метилсалициловую кислоту.

ОК означает орселлиновую кислоту.

ГМБК означает 2-гидрокси-6-метилбензойную кислоту.

Все патенты, патентные заявки, ссылки на литературу, которые использованы в настоящем описании изобретения, полностью включены посредством ссылки.

Настоящее изобретение представляет способы и материалы для производства интересующих органических соединений быстрым, недорогим и эффективным образом. Так, настоящее изобретение удовлетворяет большое число коммерческих и промышленных нужд. Термин «органическая молекула» означает, например, любую молекулу, которая состоит преимущественно из углерода и водорода, например, ароматические соединения. Органические соединения, которые представляют интерес, содержат, но не ограничиваются фенольными смолами или соединениями, такими как 6-МСК/ГМБК, ОСК, метакрезол, орсин; 3-метиланизол; 3,5-диметокситолуол; и фталаты, такие как фталевый ангидрид (например, 3-гидроксифталевый ангидрид).

В частности производство интересующих микроорганизмов (например, метакрезол, орсин, метиланизол) и их производных из возобновляемых ресурсов рассмотрено в настоящем изобретении. Ароматические соединения получены с помощью функциональных ароматических поликетидсинтаз (ПКС), и окончательное многообразие молекул преобразуется в организме для образования специальных химических веществ микробицидного или фармацевтического применения; или обрабатываются дополнительно для получения высокооктановых ароматических или циклогексановых и циклогексанольных молекул, которые могут служить предшественниками для других специальных химических веществ и полимером, или совместимы с реактивными топливами и топливами на основе бензина и поэтому могут быть использованы в качестве возобновляемого источника энергии.

В одном случае настоящее изобретение относится к синтезу фенольных смол, фенольных соединений и промежуточных фенольных соединений. Используемые здесь термины «фенольная смола» или «фенольное соединение» означает органическое соединение, которое содержит фенильную группу (-C₆H₅), связанную с гидроксильной группой (-ОН).

В предпочтительном варианте изобретения фенольная смола или фенольное соединение является m-крезолом (также называемым 3-метилфенол) или орсин (также называемым 5-метилбензен-1,3-диол).

Настоящее изобретение также рассматривает синтез промежуточных фенольных соединений. В одном варианте изобретения промежуточное фенольное соединение является соединением, произведенным в одной из операций описанного здесь метаболического пути (например, Фиг.1 и Фиг.2). Термин «метаболический путь» означает последовательность из двух или более ферментных реакций, в который продукт одной ферментной реакции становится субстратом для следующей ферментной реакции. В каждой операции метаболического пути промежуточные соединения формируются и используются в качестве субстратов для последующей операции. В одном варианте изобретения каждая операция метаболического пути происходит в модифицированной рекомбинантной клетке, которая описана здесь. В другом варианте изобретения, по меньшей мере, одна операция метаболического пути происходит в описанной здесь модифицированной рекомбинантной клетке, и, по меньшей мере, одна операция метаболического пути происходит вне описанной здесь модифицированной рекомбинантной клетки. Соединения, полученные в каждой операции метаболического пути, называются «промежуточными», «промежуточными соединениями» или «промежуточными смесями».

В одном варианте изобретения метаболический путь содержит ферментную реакцию, катализатором которой выступает одно из следующих веществ: 6-СМСК; СОК; голо синтаза АПБ; декарбоксилаза, O-метилтрансфераза; и любая их комбинация. Такие метаболические пути могут производить интересующие соединения, а также промежуточные описанные здесь соединения.

В другом варианте изобретения метаболический путь содержит ферментную реакцию, катализатором которой является i) 6-СМСК или СОК и ii) голо синтаза АПБ.

В одном варианте изобретения метаболический путь содержит использование пантетена 6-СМСК посредством голо синтазы АПБ. В одном варианте изобретения соединение, произведенное в метаболическом пути, является 6-МСК или СОК. В одном варианте изобретения 6-МСК или ОСК является промежуточным фенольным соединением. В другом варианте осуществления 6-МСК является промежуточным фталевым ангидридным соединением.

В одном варианте изобретения промежуточное фенольное соединение выбирается из группы, содержащей 6-метилсалициловую кислоту (6-МСК) (известную также как 2-гидрокси-6-метилбензойная кислота (ГМБК)) и орселлиновую кислоту (ОК). В другом варианте изобретения описанные здесь рекомбинантные клетки и способы представляют синтез интересующего фенольного соединения из промежуточного фенольного соединения. В другом варианте изобретения, m-крезол синтезируется из 6-МСК или орсин синтезируется из промежуточного вещества ОСК.

В другом варианте изобретения 6-МСК является промежуточным фталевым ангидридным соединением. В другом варианте изобретения описанные здесь рекомбинантные клетки и способы представляют синтез фталевого ангидридного соединения из промежуточного фенольного соединения.

В другом варианте изобретения метаболический путь содержит ферментную реакцию, катализатором которой является i) ПКС (например, 6-МСК, модифицированная 6-СМСК или СОК); ii) голо синтаза АПБ и iii) декарбоксилаза. В другом варианте изобретения соединение, произведенное в метаболическом пути, является m-крезолом или орсином.

В другом варианте изобретения метаболический путь содержит ферментную реакцию, катализатором которой является i) ПКС (например, 6-СМСК, модифицированная 6-СМСК или СОК); ii) голо синтаза АПБ и iii) декарбоксилаза. В другом варианте изобретения соединение, произведенное в метаболическом пути, является промежуточное метилированное фенольное соединение. В другом варианте изобретения промежуточное метилированное фенольное соединение является m-крезолом или орсином. В одном варианте изобретения m-крезол является промежуточным веществом для 3-метиланизола, орсин является промежуточным веществом для 3,5-диметокситолуол.

В другом варианте изобретения метаболический путь содержит ферментную реакцию, катализатором которой является i) ПКС (например, 6-СМСК, модифицированная 6-СМСК или ОСК); ii) голо синтаза АПБ; iii) декарбоксилаза и iv) O-метилтрансфераза. В другом варианте изобретения соединение, полученное в метаболическом пути, является метилированным фенольным соединением. В одном варианте изобретения катализатором реакции является 6-СМСК, голо синтаза АПБ, декарбоксилаза и ООМТ для получения 3-метиланизола. В одном варианте изобретения катализатором является модифицированная 6-МСК (или СОК), голо синтаза АПБ, декарбоксилаза и ООМТ для получения 3,5-диметокситолуола.

В другом варианте настоящее изобретение относится к производству интересующего органического соединения в микроорганизме и представляет способы производства таких соединений из источника углеводородов микроорганизма.

Способ включает микроорганизмы, способные производить одно из следующих интересующих органических соединений, например, 6-метилсалициловой кислоты (6-МСК) (также известную, как 2-гидрокси-6-метилбензойная кислота (ГМБК)), m-крезол, орсин, 3-метиланизол; 3,5-диметилтолуол, толуол и эфиры фталевой кислоты. Настоящее изобретение представляет инженерные метаболические пути, изолированные нуклеиновые кислоты или синтетические нуклеиновые кислоты, полипептиды или синтетические полипептиды, клетки-хозяева или генетически синтезированные клетки-хозяева, способы и материалы производства интересующих инженерных соединений.

В другом варианте настоящее изобретение относится к синтетическим полипептидам и полинуклеотидам, кодирующим ферменты, которые обладают активностью или повышенной активностью по отношению к естественным или неестественным субстратам или которые могут быть применены к различным специальным субстратам. Термин «полипептид» и термины «белок» и «пептид», которые здесь являются взаимозаменяемыми, означают аминокислотные полимеры, например, генные продукты, белки естественного происхождения, гомологи, ортологи, паралоги, фрагменты и другие эквиваленты, варианты и аналоги вышеуказанных веществ. Термин «полипептид с ферментной активностью» означает любой полипептид, который катализирует химическую реакцию других веществ, при этом не разрушаясь или не изменяясь по завершении реакции. Обычно полипептид с ферментной активностью является катализатором образования одного или нескольких продуктов из одного или нескольких субстратов. В некоторых вариантах изобретения существующие ферменты модифицируются для использования в органическом биосинтезе. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения ферменты, участвующие в производстве интересующих органических соединений, содержит, но не ограничиваются 6-метилсалициловой кислотой (6-СМСК); синтазой орселлиновой кислоты (СОК); голо синтазой ацил-переносящего белка (АПБ); декарбоксилазой и O-метилтрансферазой (ООМТ). В одном варианте изобретения ферментом является 6-СМСК, содержащая неактивированную область кеторедуктазы (КР). В другом варианте изобретения 6-СМСК содержит неактивированную область КР, которая способствует производству орселлиновой кислоты в модифицированных рекомбинантных клетках и описанные здесь способы.

Настоящее изобретение в различных его вариантах использует различные компоненты ароматической системы ПКС или их модифицированные формы или часть более, чем одной из них, вместе с дополнительными модифицированными ферментами, поступающими в необходимый продукт.

Итерационные или «ароматические» системы ПКС, применяемые в настоящем изобретении, характеризуются итерационным использованием каталитических участков произведенных ферментов. Таким образом, в этих ароматических системах ПКС производится только один фермент определенного типа, который является катализатором соответствующей активность системы при синтезе поликетидов.

В некоторых вариантах изобретения механизм реакции фермента может быть изменен для ускорения новых реакций, изменения, расширения или улучшения специфичности субстрата. Стоит отметить, что если ферментная структура (например, структура кристалла) известна, свойства ферментов могут быть модифицированы соответствующим изменением конструкции (см. заявки на патенты США US 20060160138, US 20080064610 и US 20080287320, полное содержание которых приведено посредством ссылки). Модификации или улучшение свойств фермента могут возникать из-за введения модификаций в цепочку полипептидов, которая может изменять структуру и функции фермента и/или взаимодействие с другой молекулой (например, субстрат и неестественный субстрат). В области техники хорошо известно, что некоторые участки полипептидов могут быть критичны для активности фермента. Например, небольшое изменение состава аминокислот, участвующих в катализе и/или в связывающих областях субстрата, будет иметь значительное влияние на функции фермента. Некоторые остатки аминокислот могут иметь существенное значение в поддержании вторичной или третичной структуры фермента, и могут производить значительные изменения в свойствах фермента при модификации. В некоторых вариантах изобретения возможные компоненты пути являются вариантами любых из вышеуказанных веществ. Такие варианты могут быть произведены путем неспецифического мутагенеза или путем рационального устройства для производства ферментной активности, например, с измененной специфичностью субстрата, увеличенной ферментной активностью, большей устойчивостью и т.д. Таким образом, в некоторых вариантах изобретения число модификаций относительно исходного фермента, который производит фермент, обладающий необходимыми свойствами, может содержать одну или более аминокислот, 2 или более аминокислот, 5 или более аминокислот, 10 или более аминокислот, 20 или более аминокислот, до 10% от общего числа аминокислот, до 20% от общего числа аминокислот, до 30% от общего числа аминокислот, до 40% от общего числа аминокислот, составляющих исходный фермент, или до 50% общего числа аминокислот, составляющих исходный фермент. В одном варианте изобретения исходный или контрольный фермент является 6-СМСК, измененная для удаления области кеторедуктазы (КР). В другом варианте изобретения модифицированная 6-СМСК, которой недостает в области КР, может производить орселлиновую кислоту в клетке или с помощью описанного здесь способа.

Специалисты в области техники понимают, что искусственные пути, являющиеся здесь примером, описаны относительно специальных видов генов и охватывают гомологи или ортологи последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислоты, но не ограничиваются ими. Гомологические и ортологические последовательности обладают относительно высокой степенью сходства/идентичнос