Объект сои 9582.814.19.1, придающий устойчивость к насекомым и устойчивость к гербицидам

Объект сои 9582.814.19.1, придающий устойчивость к насекомым и устойчивость к гербицидам

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку

[0001] Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки № 61/511,664, зарегистрированной 26 июля 2011, и предварительной заявки № 61/521,798, зарегистрированной 10 августа 2011, обе из которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

Уровень техники

[0002] Гены, кодирующие Cry1F и Cry1Ac synpro (Cry1Ac), способны придавать трансгенным растениям устойчивость к насекомым, например, устойчивость к чешуекрылым насекомым; и гены, кодирующие PAT (ацетилтрансфераза фосфинотрицина), способны придавать трансгенным растениям устойчивость к гербицидному фосфинотрицину (глуфосинат). PAT успешно экспрессировался в сое для применения и в качестве селектируемого маркера при получении устойчивых к насекомым трансгенных сельскохозяйственных культур, так и для придания коммерческие оправданных уровней устойчивости к гербицидному глуфосинату трансгенным сельскохозяйственным культурам.

[0003] Известно, что на экспрессирование чужеродных генов в растениях влияет их местоположение в геноме растения, возможно из-за структуры хроматина (например, гетерохроматин) или близкого расположения элементов регуляции транскрипции (например, гены - усилители) к участку интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). В то же самое время, присутствие трансгена в различных местах в геноме влияет на общий фенотип растения по-разному. Поэтому, часто необходимо скринировать большое количество объектов, чтобы идентифицировать объект, характеризующийся оптимальной экспрессией представляющего интерес вводимого гена. Например, в растениях и в других организмах наблюдали, что может иметь место широкая вариация в уровнях экспрессии введенного гена между объектами. Могут также быть различия в пространственных или временных паттернах экспрессии, например, различия в относительной экспрессии трансгена в различных растительных тканях, которые могут не соответствовать паттернам, ожидаемым от регулирующих транскрипцию элементов, присутствующих во введенном генном конструкте. Поэтому, как правило, получают от сотен до тысяч различных объектов и скринируют эти объекты на предмет одного единственного объекта, который обладает желаемыми в коммерческих целях уровнями и паттернами экспрессии трансгена. Объект, который обладает желаемыми уровнями и паттернами экспрессии трансгена, полезен для интрогрессии трансгена в другие генетические окружения путем полового ауткроссинга с применением обычных способов размножения. Потомство таких скрещиваний сохраняет характеристики экспрессии трансгена первоначального трансформанта. Эту стратегию применяют для того, чтобы гарантировать надежную экспрессию гена во многих сортах, которые хорошо адаптированы к местным условиям произрастания.

[0004] Желательно иметь возможность обнаруживать присутствие специфического объекта для того, чтобы определять содержит ли потомство полового скрещивания интересующий трансген или группу трансгенов. Кроме того, способ обнаружения специфического объекта был бы полезен для выполнения инструкций, требующих одобрения перед продажей, и маркировки продуктов, полученных из рекомбинантных растений сельскохозяйственных культур, например, или для применения в экологическом мониторинге, мониторинге признаков сельскохозяйственных культур в поле или мониторинге продуктов, полученных из урожая сельскохозяйственной культуры, так же как для применения в обеспечении согласия сторон, подчиняющихся нормативным или договорным условиям.

[0005] Обнаружение присутствия трансгенного объекта возможно любым способом обнаружения нуклеиновой кислоты, известным в области техники, включая, но не ограничиваясь ими, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или ДНК-гибридизацию с применением зонда для нуклеиновой кислоты. Эти способы обнаружения, в целом, сфокусированы на часто применяемых генетических элементах, таких как промоторы, терминаторы, маркеры и т.д., поскольку для многих ДНК-конструктов область кодирования является взаимозаменяемой. В результате, такие способы могут не быть полезными для различения между различными объектами, в частности, таких, которые получены с применением одного и того же ДНК-конструкта или очень схожих конструктов, если только не известна последовательность фланкирующей ДНК, смежная с введенной гетерологичной ДНК. Например, объект-специфический анализ ПЦР описан в патентной заявке США 2006/0070139 для объекта кукурузы DAS-59122-7. Было бы желательно иметь простой и чувствительный способ идентификации объекта сои 9582.814.19.1.

Сущность настоящего изобретения

[0006] Настоящее изобретение относится к новому объекту трансформации трансгенной сои, придающему устойчивость к насекомым и устойчивость к гербицидам, обозначаемому как объект сои 9582.814.19.1, включающему cry1F, cry1Ac и pat, как приведено в настоящем описании, введенному в специфический сайт генома клетки сои. Представительное семя сои депонировано в американской коллекции типовых культур (ATCC) под номером доступа зарегистрированного образца, идентифицированным в параграфе [0021]. ДНК растений сои, содержащих этот объект, включает примыкающие вплотную/фланкирующие последовательности, приведенные в настоящем описании, которые характеризуют местоположение введенной ДНК в геноме сои. SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 являются диагностическими для объекта сои 9582.814.19.1. Более конкретно, последовательности, окружающие примыкающие вплотную последовательности в п.о. 1400/1401 и п.о. 1536/1537 SEQ ID NO:1 и п.о. 152/153 SEQ ID NO:2, являются диагностическими для объекта сои 9582.814.19.1. Параграф [00012] ниже описывает примеры последовательностей, включающих эти примыкающие вплотную последовательности, которые характерны для ДНК сои, содержащей объект сои 9582.814.19.1.

[0007] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет растение сои или его часть, устойчивые к Pseudoplusia includens (соевая пяденица), и которые имеют геном, включающий одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. 1385-1415 из SEQ ID NO:1; п.о. 1350-1450 из SEQ ID NO:1; п.о. 1300-1500 из SEQ ID NO:1; п.о. 1200-1600 из SEQ ID NO:1; п.о. 137-168 из SEQ ID NO:2; п.о. 103-203 из SEQ ID NO:2; и п.о. 3-303 из SEQ ID NO:2 и комплементарных им. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет семена таких растений.

[0008] В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ борьбы с насекомыми, который включает экспонирование насекомым растений сои, резистентных к насекомым, в котором растения сои содержат геном, который содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. 1385-1415 из SEQ ID NO:1; п.о. 1350-1450 из SEQ ID NO:1; п.о. 1300-1500 из SEQ ID NO:1; п.о. 1200-1600 из SEQ ID NO:1; п.о. 137-168 из SEQ ID NO:2; п.о. 103-203 из SEQ ID NO:2; и п.о. 3-303 из SEQ ID NO:2 и комплементарных им; которые характерны для присутсвия объекта сои 9582.814.19.1, чтобы, таким образом, бороться с насекомыми. Присутствие генов cry1F v3 (cry1F) и cry1Ac synpro (cry1Ac) в объекте сои 9582.814.19.1 придает устойчивость, например, к Pseudoplusia includens (соевая пяденица), Anticarsia gemmatalis (гусеница бархатных бобов), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica и Elasmopalpus lignosellus.

[0009] В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ борьбы с сорняками в сельскохозяйственной культуре сои, который включает нанесение гербицида на основе глуфосината на сельскохозяйственную культуру сои, где указанная сельскохозяйственная культура сои включает растения сои, содержащие геном, включающий одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. 1385-1415 из SEQ ID NO:1; п.о. 1350-1450 из SEQ ID NO:1; п.о. 1300-1500 из SEQ ID NO:1; п.о. 1200-1600 из SEQ ID NO:1; п.о. 137-168 из SEQ ID NO:2; п.о. 103-203 из SEQ ID NO:2; и п.о. 3-303 из SEQ ID NO:2 и комплементарных им, которые являются диагностическими для присутствия объекта сои 9582.814.19.1. Присутствие гена pat v6 (pat) в объекте сои 9582.814.19.1 придает устойчивость к гербицидам на основе глуфосината.

[0010] В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ обнаружения объекта сои 9582.814.19.1 в образце, содержащем ДНК сои, где указанный способ включает:

(a) приведение в контакт указанного образца с первым праймером длиной, по меньшей мере, 10 п.о., который избирательно связывается с фланкирующей последовательностью в пределах п.о. 1-1400 из SEQ ID NO:1 или комплементарной ей, и вторым праймером длиной, по меньшей мере, 10 п.о., который избирательно связывается с последовательностью-вставкой в пределах п.о. 1401-1836 из SEQ ID NO:1 или комплементарной ей; и проведение анализа на ампликон, образующийся между указанными праймерами; или

(b) приведение в контакт указанного образца с первым праймером длиной, по меньшей мере, 10 п.о., который избирательно связывается с последовательностью-вставкой в пределах п.о. 1-152 из SEQ ID NO:2 или комплементарной ей, и вторым праймером длиной, по меньшей мере, 10 п.о., который избирательно связывается с фланкирующей последовательностью в пределах п.о. 153-1550 из SEQ ID NO:2 или комплементарной ей; и

(c) проведение анализа на ампликон, образующийся между указанными праймерами.

[0011] В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ обнаружения объекта сои 9582.814.19.1, включающий:

(a) приведение в контакт указанного образца с первым праймером, который избирательно связывается с фланкирующей последовательностью, выбранной из группы, состоящей из п.о. 1-1400 из SEQ ID NO:1 и п.о. 153-1550 из SEQ ID NO:2 и комплементарной ей; и вторым праймером, который избирательно связывается с SEQ ID NO:3 или комплементарной ей;

(b) проведение полимеразной цепной реакции в указанном образце; и

(c) проведение анализа на ампликон, образующийся между указанными праймерами.

[0012] В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ размножения растения сои, включающий: скрещивание первого растения со вторым растением сои для получения третьего растения сои, где указанное первое растение содержит ДНК, включающую одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. 1385-1415 из SEQ ID NO:1; п.о. 1350-1450 из SEQ ID NO:1; п.о. 1300-1500 из SEQ ID NO:1; п.о. 1200-1600 из SEQ ID NO:1; п.о. 137-168 из SEQ ID NO:2; п.о. 103-203 из SEQ ID NO:2; и п.о. 3-303 из SEQ ID NO:2 и комплементарных им; и проведение анализа указанного третьего растения сои на присутствие ДНК, включающего одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. 1385-1415 из SEQ ID NO:1; п.о. 1350-1450 из SEQ ID NO:1; п.о. 1300-1500 из SEQ ID NO:1; п.о. 1200-1600 из SEQ ID NO:1; п.о. 137-168 из SEQ ID NO:2; п.о. 103-203 из SEQ ID NO:2; и п.о. 3-303 из SEQ ID NO:2, и комплементарных им.

[0013] В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет изолированную молекулу ДНК, которая является диагностической для объекта сои 9582.814.19.1. Такие молекулы включают, в дополнение к SEQ ID NOS: 1 и 2, молекулы, по меньшей мере, 25 п.о. в длину, включающие п.о. 1400-1401 из SEQ ID NO:1 и, по меньшей мере, 10 п.о. из SEQ ID NO:1 в каждом направлении от прилегающей вплотную последовательности п.о. 1400/1401; ампликоны, по меньшей мере, 25 п.о. в длину, включающие 152-153 из SEQ ID NO:2 и, по меньшей мере, 10 п.о. из SEQ ID NO:2 в каждом направлении от прилегающей вплотную последовательности п.о. 152/153. Примерами являются п.о. 1385-1415 из SEQ ID NO:1; п.о. 1350-1450 из SEQ ID NO:1; п.о. 1300-1500 из SEQ ID NO:1; п.о. 1200-1600 из SEQ ID NO:1; п.о. 137-168 из SEQ ID NO:2; п.о. 103-203 из SEQ ID NO:2; и п.о. 3-303 из SEQ ID NO:2 и комплементарные им.

[0014] В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ борьбы с вредителями в зерне сои, семени или семенном пищевом продукте, который включает введение объекта сои 9582.814.19.1 в указанное зерно, семя или семенной пищевой продукт, что демонстрируется указанным зерном, семенем или семенным пищевым продуктом, содержащим ДНК, включающим одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. 1385-1415 из SEQ ID NO:1; п.о. 1350-1450 из SEQ ID NO:1; п.о. 1300-1500 из SEQ ID NO:1; п.о. 1200-1600 из SEQ ID NO:1; п.о. 137-168 из SEQ ID NO:2; п.о. 103-203 из SEQ ID NO:2; и п.о. 3-303 из SEQ ID NO:2 и комплементарных им.

[0015] Изобретение также включает растительные клетки сои и части растений, включая, но не ограничивая ими, пыльцу, семяпочку, цветки, побеги, корни и листья и ядра растительных клеток, клетки пыльцы, семя и семенной пищевой продукт и оотиды, которые содержат объект сои 9582.814.19.1.

[0016] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения объект сои 9582.814.19.1 может быть объединен с другими признаками, включая, например, другие ген(ы) устойчивости к гербицидам и/или ингибирующие насекомых белки и регулирующие транскрипцию последовательности (т.е. РНК интерференция, дсРНК, факторы транскрипции и т.д.). Дополнительные признаки могут быть соединены в геноме растения путем размножения растений, перетрансформации трансгенного растения, содержащего объект сои 9582.814.19.1, или добавления новых признаков путем целенаправленной интеграции посредством гомологичной рекомбинации.

[0017] Другие варианты осуществления настоящего изобретения включают вырезание полинуклеотидных последовательностей, которые содержат объект сои 9582.814.19.1, включая например, кассету экспрессии гена pat. После вырезания полинуклеотидной последовательности модифицированный объект может быть перенаправлен на специфический хромосомный участок, на котором дополнительные полинуклеотидный последовательности соединяют с объектом сои 9582.814.19.1.

[0018] В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает таргетный хромосомный участок сои, расположенный на хромосоме 02 между фланкирующими последовательностями, указанными в SEQ ID NOS:1 и 2.

[0019] В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ создания трансгенного растения сои, включающий введение гетерологичной нуклеиновой кислоты в положение на хромосоме 02 между геномными последовательностями, указанными в SEQ ID NOS:1 и 2, т.е. между п.о. 1-1400 из SEQ ID NO:1 и п.о. 153-1550 из SEQ ID NO:2.

[0020] Дополнительно, рассматриваемое изобретение предоставляет анализы для обнаружения присутствия рассматриваемого объекта в образце (сои, например). Анализы могут быть основаны на последовательности ДНК рекомбинантного конструкта, введенного в геном сои, и на геномных последовательностях, примыкающих к участку вставки. Наборы и условия, полезные при проведении анализов, также предоставляются.

[0021] Рассматриваемое изобретение частично имеет отношение к клонированию и анализу последовательностей ДНК граничных областей, получаемых в результате вставки T-ДНК из pDAB9582 в трансгенные линии сои. Эти последовательности уникальны. В зависимости от вставки и плотно прилегающей последовательности могут быть и были получены объект-специфические праймеры. ПЦР анализ продемонстрировал, что эти объекты могут быть идентифицированы анализом ампликонов ПЦР, получаемых с этими объект-специфическими наборами праймеров. Таким образом, эти и другие связанные процедуры могут быть применены для того, чтобы уникальным образом идентифицировать линии сои, содержащие объект по рассматриваемому изобретению.

Депозит семян

[0022] Как часть этого раскрытия, по меньшей мере, 2500 семян линии сои, содержащей объект сои 9582.814.19.1, было депонировано в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Манассас, Вирджиния, 20110. Депозит, патентное обозначение депозита в ATCC - PTA 12006, был получен в ATCC 21 июля 2011. Этот депозит был создан и будет поддерживаться в соответствии с и по правилам Будапештского Соглашения в отношении депозитов семян в целях прохождения патентной процедуры. Этот депозит был создан и будет поддерживаться в соответствии с и по правилам Будапештского Соглашения в отношении депозитов семян в целях прохождения патентной процедуры.

Краткое описание последовательностей

[0023] SEQ ID NO:1 представляет собой 5'-фланкирующую пограничную последовательность ДНК для объекта сои 9582.814.19.1. Нуклеотиды 1-1400 представляют собой геномную последовательность. Нуклеотиды 1401-1535 представляют собой перегруппированную последовательностью из pDAB9582. Нуклеотиды 1536-1836 представляют собой вставляемую последовательность.

[0024] SEQ ID NO:2 представляет собой 3'-фланкирующую пограничную последовательность ДНК для объекта сои 9582.814.19.1. Нуклеотиды 1-152 представляют собой вставляемую последовательность. Нуклеотиды 153-1550 представляют собой геномную последовательностью.

[0025] SEQ ID NO:3 представляет собой последовательность ДНК pDAB9582, которая аннотирована ниже в таблице 1.

[0026] SEQ ID NO:4 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81419_FW3 для подтверждения 5'-концевой геномной ДНК.

[0027] SEQ ID NO:5 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81419_RV1 для подтверждения 3'-концевой геномной ДНК.

[0028] SEQ ID NO:6 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81419_RV2 для подтверждения 3'-концевой геномной ДНК.

[0029] SEQ ID NO:7 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81419_RV3 для подтверждения 3'-концевой геномной ДНК.

[0030] SEQ ID NO:8 представляет собой олигонуклеотидный праймер 5'IREnd-01 для подтверждения 5'-концевой геномной ДНК.

[0031] SEQ ID NO:9 представляет собой олигонуклеотидный праймер 5'IREnd-02 для подтверждения 5'-концевой геномной ДНК.

[0032] SEQ ID NO:10 представляет собой олигонуклеотидный праймер для подтверждения AtUbi10RV1 5'-концевой геномной ДНК.

[0033] SEQ ID NO:11 представляет собой олигонуклеотидный праймер AtUbi10RV2 для подтверждения 5'-концевой геномной ДНК.

[0034] SEQ ID NO:12 представляет собой олигонуклеотидный праймер 3'PATEnd05 для подтверждения 3'-концевой геномной ДНК.

[0035] SEQ ID NO:13 представляет собой олигонуклеотидный праймер 3'PATEnd06 для подтверждения 3'-концевой геномной ДНК.

[0036] SEQ ID NO:14 представляет собой подтвержденную последовательностью объекта сои 9582.814.19.1. Включая 5'- фланкирующую геномную последовательность, pDAB9582 вставку T-нити и 3'-фланкирующую геномную последовательность.

Краткое описание фигур

[0037] Фиг.1 представляет собой карту плазмиды pDAB9582, содержащей cry1F, cry1Ac и кассеты экспрессии pat.

[0038] На фиг.2 изображены месторасположения праймеров для подтверждения 5' и 3' пограничных последовательностей объекта сои pDAB9582.814.19.1.

[0039] На фиг.3 изображено устройство геномной последовательности в объекте сои pDAB9582.814.19.1

Подробное описание настоящего изобретения

[0040] Оба конца вставки объекта сои 9582.814.19.1 секвенировали и описывали. Разрабатывали объект-специфические анализы. Также наносили на карту генома сои (хромосома сои 02). Объект может быть далее введен в элитные линии.

[0041] Как приводится ссылка на вышеуказанное в разделе уровень техники, введение и интеграция трансгена в геном растения включают некоторые случайные объекты (отсюда имя «объект» для данной вставки, которая экспрессируется). Таким образом, во многих технологиях трансформации, таких как трансформация посредством Agrobacterium, биолистическая трансформация (т.е. генная пушка) и карборунд-опосредованная трансформация (т.е. WHISKERS), невозможно предсказать в какое место в геноме трансген будет вставлен. Таким образом, идентификация фланкирующей геномный ДНК растения с обеих сторон вставки может быть важна для идентификации растения, содержащего объект вставки. Например, могут быть разработаны такие ПЦР-праймеры, которые создают ампликон ПЦР через область соединения вставки и генома хозяина. Этот ампликон ПЦР может быть применен для идентификации уникального или отличительного типа объекта вставки.

[0042] Определения и примеры приведены здесь для описания настоящего изобретения и в качестве инструкции для специалистов в области техники для осуществления настоящего изобретения на практике. Если не указано иное, термины необходимо понимать в их обычном смысле применения специалистами в соответствующей области техники. Спецификация оснований ДНК применена как указано в 37 CFR §1.822.

[0043] Как применено в настоящем описании, термин «потомство» обозначает потомство любого поколения от родительского растения, которое включает объект сои 9582.814.19.1.

[0044] Трансгенный «объект» получают трансформацией растительных клеток гетерологичной ДНК, т.е. конструктом нуклеиновой кислоты, который включает представляющие интерес трансгены, получением потомства от популяции растений, полученных в результате вставки трансгена в геном растения, и селекции конкретного растения, характеризующегося вставкой в специфическое место генома. Термин «объект» относится к первоначальному трансформанту и потомству трансформанта, которое включает гетерологичную ДНК. Термин «объект» также относится к потомству, получаемому половым ауткроссингом между трансформантом и другим сортом, который содержит геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного обратного скрещивания с рекуррентным родителем, введенная трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК) от трансформированного родителя присутствуют в потомстве после скрещивания в том же самом месте хромосомы. Термин «объект» также относится к ДНК первоначального трансформанта и его потомства, содержащего введенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность непосредственно в смежном положении со введенной ДНК, которая, как ожидается, передается потомству, которое получает введенную ДНК, включающую интересующий трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая включает введенную ДНК (например, первоначальный трансформант и потомство, появляющееся при самоопылении), и родительской линии, которая не содержит введенной ДНК.

[0045] «Примыкающая последовательность» или «пограничная последовательность» охватывает точку, в которой ДНК, введенная в геном, связывается с ДНК естественного гена сои, примыкающей к точке вставки, при этом идентификации или определения одной или другой примыкающей последовательности в генетическом материале растения достаточно для диагностирования объекта. Включены последовательности ДНК, которые охватывают вставки в описанных здесь объектах сои, и фланкирующие ДНК схожей длины. В настоящем описании предоставлены определенные примеры таких диагностических последовательностей; однако, другие последовательности, которые схожи с примыкающими к вставкам последовательностями или с примыкающими к вставкам последовательностями и геномной последовательностью, также являются диагностическими и могут быть применены согласно рассматриваемому изобретению.

[0046] Рассматриваемое изобретение имеет отношение частично к идентификации объектов с применением таких фланкирующих, примыкающих и вводимых последовательностей. Соответствующие ПЦР-праймеры и ампликоны включены в настоящее изобретение. Согласно рассматриваемому изобретению, методы ПЦР анализа с участием ампликонов, которые покрывают введенную ДНК и ее границы, могут быть применены для обнаружения или идентификации коммерциализуемых трансгенных сортов сои или линий, получаемых из рассматриваемых патентуемых трансгенных линий сои.

[0047] Фланкирующие/примыкающие последовательности являются диагностическими для объекта сои 9582.814.19.1. На основе этих последовательностей получали объект-специфические праймеры. Анализ ПЦР показал, что эти линии сои могут быть идентифицированы в различных генотипах сои анализом ампликонов ПЦР, образующихся с этими наборами объект-специфических праймеров. Таким образом, эти и другие соответствующие процедуры могут быть применены для уникальной идентификации этих линий сои. Последовательности, идентифицируемые в настоящем описании, уникальны.

[0048] Способы обнаружения по рассматриваемому изобретению особенно полезны в связи с разведением растений для определения того, какие растения потомства включают данный объект, после того, как родительское растение, включающее объект скрещивается с другой линией растения в попытках придать потомству один или более дополнительных представляющих интерес признаков. Эти способы ПЦР анализа приносят пользу программам разведения сои так же как и контролю качества, особенно в отношении коммерциализированных трансгенных семян сои. ПЦР наборы для обнаружения этих трансгенных линий сои также теперь могут быть сделаны и применены. Это может также принести пользу для регистрации продукта и управления продуктом.

[0049] Кроме того, фланкирующие/геномные последовательности сои могут быть применены для специфичной идентификации места расположения каждой вставки в геноме. Эта информация может быть применена для создания систем молекулярных маркеров, специфических для каждого объекта. Они могут быть применены в стратегиях ускоренного размножения и для установления сцепления.

[0050] Еще дополнительно, информация о фланкирующей последовательности может быть применена для изучения и описания процессов интеграции трансгена, характеристик места интеграции генома, классификации объектов, устойчивости трансгенов и их фланкирующих последовательностей и экспрессии гена (особенно в отношении подавления активности гена, паттернов метилирования трансгена, эффектов положения и потенциальных связанных с экспрессией элементов, таких как MARS [участки прикрепления к матриксу] и т.п.).

[0051] В свете всего рассматриваемого раскрытия должно быть ясно, что рассматриваемое изобретение включает семена, доступные под номером доступа депозита ATCC, идентифицированным в параграфе [0021]. Рассматриваемое изобретение также включает устойчивое к гербициду растение сои, выращенное из семени, депонированного под номером доступа депозита ATCC, идентифицированным в параграфе [0021]. Рассматриваемое изобретение дополнительно включает части указанного растения, такие как листья, образцы ткани, семена, образуемые указанным растением, пыльцу и т.п. (которые содержат cry1F, cry1Ac, pat и SEQ ID NOS: 1 и 2).

[0052] Все еще дополнительно, рассматриваемое изобретение включает растение-потомка и/или потомство растений, выращенных из депонированных семян, предпочтительно, устойчивое к гербициду растение сои, где указанное растение имеет геном, включающий обнаруживаемую примыкающую последовательность дикого типа, как приведено в настоящем описании. Как применено в настоящем описании, термин «соя» обозначает Glycine max и включает все ее сорта, которые могут быть выведены с участием растения сои.

[0053] Это изобретение дополнительно включает способы скрещиваний с применением растения по рассматриваемому изобретению в качестве, по меньшей мере, одного родителя. Например, рассматриваемое изобретение включает гибридное растение F1, у которого одним или обоими родителями являются любое из растений, приведенных в настоящем описании в качестве примера. Также рассматриваемое изобретение охватывает семя, образуемое такими F1 гибридами по рассматриваемому изобретению. Это изобретение включает способ получения гибридного семени F1 путем скрещивания растения, приведенного в качестве примера, с другим (например, инбредным родителем) растением и сбора образующегося гибридного семени. Рассматриваемое изобретение включает растение, приведенное в качестве примера, которое является либо родителем женского пола, либо родителем мужского пола. Характеристики получаемых в результате растений могут быть улучшены путем внимательного отбора родительских растений.

[0054] Устойчивое к насекомым/глуфосинат-устойчивое растение сои по рассматриваемому изобретению может быть размножено сначала путем полового скрещивания первого родительского растения сои, представляющего собой растение сои, выращенное из семени любой из приведенных в настоящем описании линий, и второго родительского растения сои, таким образом, получая множество растений потомства первого поколения; затем, выбора растения-потомка первого поколения, устойчивого к глуфосинату; самоопыления растения-потомка первого поколения, таким образом, получая множество растений-потомков второго поколения; и затем отбора из растений-потомков второго поколения растений, устойчивых к глуфосинату. Эти стадии могут дополнительно включать обратное скрещивание растения-потомка первого поколения или растения-потомка второго поколения со вторым родительским растением сои или третьим родительским растением сои. Затем может быть культивирована сельскохозяйственная культура сои, включающая семена сои по рассматриваемому изобретению или их потомство.

[0055] Необходимо также понимать, что два различных трансгенных растения также могут быть скрещены для получения потомства, которое содержит два независимо расходящихся, добавленных, экзогенных гена. Самоопыление соответствующего потомства может дать растения, которые являются гомозиготными для обоих добавленных, экзогенных гена. Обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением также рассматриваются как вегетативное размножение. Другие способы размножения, обычно применяемые для различных признаков и сельскохозяйственных культур, известны в области техники. Размножение обратным скрещиванием применяют для переноса генов, которые придают легко наследуемый, высоко передающийся признак в желательный гомозиготный культурный сорт растения или инбредную линию, которая является рекуррентным родителем. Источник передаваемого признака называется родителем-донором. Ожидается, что получаемое растение будет иметь признаки рекуррентного родителя (например, культурный сорт растения) и желаемый признак, переданный от донорского родителя. После исходного скрещивания отбирают индивидуальные растения, обладающие фенотипом донорского родителя, и неоднократно скрещивают (обратным скрещиванием) с рекуррентным родителем. Ожидается, что получаемый родитель будет иметь признаки рекуррентного родителя (например, культурный сорт растения) и желаемый признак, переданный от донорского родителя.

[0056] Аналогично устойчивое к насекомым/глуфосинат-устойчивое растение сои по рассматриваемому изобретению может быть трансформировано дополнительными трансгенами с применением способов, известных в области техники. Способы трансформации, такие как трансформация посредством Agrobacterium, биолистическая трансформация (т.е. генная пушка) и карборунд-опосредованная трансформация (т.е. WHISKERS), могут быть применены для введения дополнительного трансгена(ов) в геном объекта сои 9582.814.19.1. Выбор и описание трансгенных растений, содержащих нововведенные трансгены, могут быть выполнены для идентификации растений, которые содержат устойчивый интегрант нового трансгена в дополнение к генам cry1F, cry1Ac, pat по рассматриваемому изобретению.

[0057] Молекулы ДНК по настоящему изобретению могут быть применены в качестве молекулярных маркеров в способе скрещивания с применением маркера (MAB). Молекулы ДНК по настоящему изобретению могут быть применены в способах (такие как, маркеры AFLP, маркеры RFLP, маркеры RAPD, SNP и SSR) идентификации генетически связанных агрономически полезных признаков, как известно в области техники. Признаки устойчивости к насекомым и устойчивости к гербицидам могут быть прослежены в потомстве скрещивания растения сои по рассматриваемому изобретению (или их потомство и любой другой культурный сорт растения сои или сорт) с применением способов MAB. Молекулы ДНК являются маркерами этого признака, и способы MAB, которые известны в области техники, могут быть применены для отслеживания признака(ов) устойчивости к гербицидам у растений сои, где, по меньшей мере, одна линия сои по рассматриваемому изобретению или ее потомство, были родителем или предком. Способы по настоящему изобретению могут быть применены для идентификации любого сорта сои, содержащего рассматриваемый объект.

[0058] Способы по рассматриваемому изобретению включают способ получения устойчивого к насекомым/устойчивого к гербицидам растения сои, где указанный способ включает размножение с участием растения по рассматриваемому изобретению. Более конкретно, указанные способы могут включать скрещивание двух растений по рассматриваемому изобретению, или одного растения по рассматриваемому изобретению и любого другого растения. Предпочтительные способы дополнительно включают отбор из потомства указанного скрещивания путем анализа указанного потомства на предмет объекта, обнаруживаемого согласно рассматриваемому изобретению и выгодной эффективности сорта (например, урожай). Например, рассматриваемое изобретение может быть применено для того, чтобы отследить рассматриваемый объект через циклы воспроизводства с растениями, включающими другие желательные признаки, такие как агрономические признаки, устойчивость или резистентность к заболеваниям или устойчивость или резистентность к нематодам и срок созревания. Например, растения, включающие рассматриваемый объект и желаемый признак, могут быть обнаружены, идентифицированы, отобраны и сразу же применены в дополнительных циклах размножения. Рассматриваемый объект/признак может также быть объединен с дополнительным признаком(ами) устойчивости к насекомым и/или с дополнительными признаками устойчивости к гербицидам посредством размножения и отслежен согласно рассматриваемому изобретению. Вариантами осуществления последнего являются растения, включающие рассматриваемый объект, объединенный с геном aad-12, который придает устойчивость к 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте и придилоксиацетатным гербицидам, или геном, придающим устойчивость к гербициду дикамба.

[0059] Таким образом рассматриваемое изобретение может быть объединено, например, признаками, придающими устойчивость к глифосату (например, растительные или бактериальные гены устойчивости EPSPS, GOX, GAT), устойчивость к глуфосинату (например, pat, bar), устойчивость к ацетолактатсинтаза (ALS)-ингибирующим гербицидам (например, имидазолиноны [такие как имазетапир], сульфонилмочевины, триазолопиримидина сульфонанилид, пирмидинилтиобензоаты и другие химические вещества [Csr1, SurA и др.]), устойчивость к бромоксинилу (например, Bxn), устойчивость к ингибиторам фермента HPPD (4-гидроксифенил-пируват-диоксигеназа), устойчивость к ингибиторам фитоендесатуразы (PDS), устойчивость к гербицидам ингибирующим фотосистему II (например, psbA), устойчивость к гербицидам ингибирующим фотосистему I, устойчивость к гербицидам ингибирующим протопорфириногеноксидазу IX (PPO) (например, PPO-1), устойчивость к гербицидам на основе фенилмочевины (например, CYP76B1), дикамба-разлагающим ферментам (см., например, США 20030135879), и другими, которые могут быть соединены по отдельности или в множестве комбинаций для обеспечения способности эффективной борьбы или предотвращения сдвигов сорняков и/или устойчивости к любому гербициду из вышеуказанных классов.

[0060] Дополнительно, объект сои 9582.814.19.1 может быть объединен с одним или более дополнительных входных (например, устойчивость к насекомым, устойчивость к патогенам или устойчивость к стрессу и др.) или выходных (например, повышенный урожай, улучшил нефтяной профиль, улучшил волоконное качество, и др.) признаков. Таким образом, рассматриваемое изобретение может быть применено для предоставления полного агрономического пакета сельскохозяйственной культуры улучшенного качества с возможностью гибкой и рентабельной борьбы с любым количеством агрономических насекомых-вредителей.

[0061] Способы интеграции полинуклеотидной последовательности в специфический участок хромосомы растительной клетки путем гомологической рекомбинации уже описаны в области техники. Например, сайт-специфическая интеграция, как описано, в патентной публикации США № 2009/0111188 A1, включенной в настоящее описание посредством ссылки, описывает применение рекомбиназ или интеграз для ускорения введения донорской полинуклеотидной последовательности в хромосомную мишень. Кроме того, международный номер патентной заявки WO 2008/021207, включенной в настоящее описание посредством ссылки, описывает гомологичную рекомбинацию опосредованную белком цинковый палец для интеграции одной или более донорских полинуклеотидных последовательностей в специфических местах генома. Применение рекомбиназ, таких как FLP/FRT, как описано в патенте США № 6720475, включенном в настоящее описание посредством ссылки, или CRE/LOX, как описано в патенте США № 5658772, включенном в настоящее описание посредством ссылки, может быть вовлечено для интеграции полинуклеотидной последовательности в специфический сайт хромосомы. Наконец, применение мегануклеаз для направления донорных полинуклеотидов на специфический сайт хромосомы описано в Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) стр. 5055-5060).

[0062] Другие способы сайт-специфичной интеграция в растительных клетках являются общеизвестными и применимыми (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6 (4) (2001) стр. 155-159). Кроме того, системы сайт-специфической рекомбинации, которые были идентифици