Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты для контроля экспрессии генов

Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты для контроля экспрессии генов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к молекуле одноцепочечной нуклеиновой кислоты, которая подавляет экспрессию генов, к композиции, содержащей молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, а также к применению молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты.

Уровень техники

[0002] Примером технологии подавления экспрессии генов является РНК-интерференция (RNAi) (непатентный документ 1). Обычно подавление экспрессии генов посредством РНК-интерференции осуществляется, например, путем введения короткой молекулы двухцепочечной РНК в клетку или подобным образом. Молекулу двухцепочечной РНК обычно называют миРНК (малая интерферирующая РНК). Сообщалось, что экспрессию генов может подавлять не только миРНК, но также и кольцевые молекулы РНК, которые оказываются частично двухцепочечными благодаря межмолекулярному отжигу (патентный документ 1). Тем не менее, существуют следующие проблемы при использовании молекул РНК в этих методиках для индукции подавления экспрессии генов.

[0003] Во-первых, для получения миРНК необходимо по отдельности синтезировать смысловую цепь и антисмысловую цепь и по окончании этого синтеза провести гибридизацию этих цепей. Таким образом, существует проблема низкой промышленной эффективности. Кроме того, в отношении введения миРНК: введение миРНК в клетку необходимо осуществлять с одновременным подавлением диссоциации одноцепочечной РНК, для чего необходимо решить трудоемкую задачу создания условий для обработки миРНК. С другой стороны, существует проблема затрудненного синтеза кольцевых молекул РНК. Перечень ссылок:

Патентный документ (документы)

[0004] Патентный документ 1: JP 2008-278784А

Непатентный документ (документы)

[0005] Непатентный документ 1: Fire. et al., Nature, Vol. 391, стр. 806-811, 1998 год.

Краткое описание изобретения

[0006] С учетом вышеизложенного целью настоящего изобретения является создание новой молекулы нуклеиновой кислоты со способностью к подавлению экспрессии генов, производство которой при этом также может быть легким и эффективным.

[0007] Для достижения вышеуказанной цели в настоящем изобретении рассмотрено создание молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, подавляющую экспрессию, и указанная последовательность ингибирует экспрессию целевого гена. Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты включает, в порядке от 5'-конца к 3'-концу: 5'-концевой участок (Xc), внутренний участок (Z) и 3'-концевой участок (Yc). Внутренний участок (Z) состоит из внутреннего участка со стороны 5'-конца (X) и внутреннего участка со стороны 3'-конца (Y), которые связаны друг с другом. Участок 5'-конца (Xc) является комплементарным для внутреннего участка со стороны 5'-конца (X). Участок 3'-конца (Yc) является комплементарным для внутреннего участка со стороны 3'-конца (Y). По меньшей мере один из следующих участков: внутренний участок (Z), 5'-концевой участок (Xc) и 3'-концевой участок (Yc), включает последовательность, подавляющую экспрессию.

[0008] Настоящее изобретение также относится к композиции, подавляющей экспрессию целевого гена. Композиция содержит молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

[0009] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

[0010] Настоящее изобретение также относится к способу подавления экспрессии целевого гена. В этом способе используют молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

[0011] Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, который включает этап введения пациенту молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В качестве последовательности, подавляющей экспрессию, молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты включает последовательность, которая подавляет экспрессию гена, вызывающего болезнь.

[0012] С помощью молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно подавлять экспрессию гена. Кроме того, молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты можно легко синтезировать, поскольку она не является циркулярной. Также производство молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты может быть эффективным, так как молекула имеет одну цепь, и не требуется проводить этап отжига, необходимый при получении двойной цепи.

[0013] Авторам настоящего изобретения принадлежит открытие, что подавление экспрессии гена может соответствовать структуре молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Они предположили, что эффект подавления генов молекулой одноцепочечной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению обусловлен феноменом, сходным с РНК-интерференцией. Вместе с тем, необходимо отметить, что в настоящем изобретении подавление экспрессии генов не ограничено или не связано исключительно с РНК-интерференцией.

Краткое описание чертежей

[0014] Фигура 1 представляет собой схематическое изображение примера молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

Фигура 2 представляет собой схематическое изображение другого примера молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

Фигура 3 представляет собой схематическое изображение других примеров молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

Фигура 4 представляет собой график, показывающий уровень относительной экспрессии гена GAPDH в примере настоящего изобретения.

Фигура 5 представляет собой график, показывающий уровень относительной экспрессии гена GAPDH в другом примере настоящего изобретения.

Фигура 6 представляет собой график, показывающий уровень относительной экспрессии гена GAPDH в клетках A549 еще в одном примере настоящего изобретения

Фигура 7 представляет собой график, показывающий уровень относительной экспрессии гена GAPDH в клетках 293 в примере настоящего изобретения.

Фигура 8 представляет собой график, показывающий уровень экспрессии гена TGF-β1 еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 9 представляет собой график, показывающий уровень экспрессии TGF-β1 на единицу веса легкого в каждой группе введения еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 10 представляет собой график, показывающий количество клеток в образце BALF в каждой группе введения в примере настоящего изобретения.

Фигура 11 представляет собой график, показывающий количество нейтрофилов в образце BALF в каждой группе введения в примере настоящего изобретения.

Фигура 12 представляет фотографии, каждая из которых показывает результат окрашивания клеток по Гимзе в образце BALF в примере настоящего изобретения.

Фигура 12А показывает результат, полученный в группе введения 4 (ЛПС(+)/РНК(-)). Фигура 12B показывает результат, полученный в группе введения 6 (ЛПС(+)/отрицательный контроль NK-0035(+)). Фигура 12С показывает результат, полученный в группе введения 5 (ЛПС(+)/NK-0033(+)).

Фигура 13 представляет фотографии, каждая из которых показывает результат окрашивания гематоксилином и эозином (ГЭ) ткани легкого в примере настоящего изобретения. Фигура 13А показывает результат, полученный в группе введения 4 (ЛПС(+)/РНК(-)). Фигура 13B показывает результат, полученный в группе введения 6 (ЛПС(+)/отрицательный контроль NK-0035(+)). Фигура 13С показывает результат, полученный в группе введения 5 (ЛПС(+)/NK-0033(+)).

Фигура 14А показывает результат измерения уровня экспрессии гена TGF-β1 еще в одном примере настоящего изобретения. Фигура 14B показывает результат измерения уровня экспрессии гена IFH-α в примере настоящего изобретения. Фигура 14С показывает результат измерения уровня экспрессии гена IFH-β в примере настоящего изобретения.

Фигура 15 представляет собой график, показывающий относительное значение уровня экспрессии гена TGF-β1 еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 16 представляет собой график, показывающий относительное значение уровня экспрессии гена TGF-β1 в примере настоящего изобретения.

Фигура 17 представляет собой график, показывающий уровень экспрессии гена TGF-β1 на единицу веса легкого в каждой группе введения еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 18А представляет собой график, показывающий количество TNF-α в образце BALF в каждой группе введения в примере настоящего изобретения. Фигура 18B представляет собой график, показывающий количество IFH-β в образце BALF в каждой группе введения в примере настоящего изобретения.

Фигура 19 представляет собой график, показывающий относительный уровень экспрессии гена LAMA1 в клетках 293 еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 20 представляет собой график, показывающий относительный уровень экспрессии гена LMNA в клетках A549 еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 21 показывает одноцепочечную РНК (оцРНК), используемую еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 22 представляет собой график, показывающий относительный уровень экспрессии гена GAPDH в примере настоящего изобретения.

Фигура 23 показывает одноцепочечную РНК, используемую еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 24 представляет собой график, показывающий относительный уровень экспрессии гена GAPDH в примере настоящего изобретения.

Фигура 25 показывает одноцепочечную РНК, используемую еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 26 представляет собой график, показывающий относительный уровень экспрессии гена GAPDH в примере настоящего изобретения.

Фигура 27 показывает одноцепочечную РНК, используемую еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 28 представляет собой график, показывающий относительный уровень экспрессии гена GAPDH в примере настоящего изобретения.

Фигура 29 представляет собой график, показывающий относительный уровень экспрессии гена GAPDH еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 30 представляет собой график, показывающий относительный уровень экспрессии гена GAPDH в клетках HCT116 еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 31 представляет собой электрофореграмму, показывающую устойчивость к рибонуклеазе еще в одном примере настоящего изобретения.

Фигура 32 представляет собой электрофореграмму, показывающую устойчивость к S7 нуклеазе еще в одном примере настоящего изобретения.

Способ осуществления изобретения

[0015] Каждый из терминов, используемых в настоящем описании, имеет значение, обычно применяемое в данной области, если не указано иначе.

1. Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты (оцНК)

[0016] Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты (оцНК) по настоящему изобретению, как описано выше, представляет собой молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, подавляющую экспрессию, и указанная последовательность подавляет экспрессию целевого гена. Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты включает, в порядке от 5'-конца к 3'-концу: 5'-концевой участок (Xc), внутренний участок (Z) и 3'-концевой участок (Yc). Внутренний участок (Z) состоит из внутреннего участка со стороны 5'-конца (X) и внутреннего участка со стороны 3'-конца (Y), которые связаны друг с другом. Участок 5'-конца (Xc) является комплементарным для внутреннего участка со стороны 5'-конца (X). Участок 3'-конца (Yc) является комплементарным для внутреннего участка со стороны 3'-конца (Y). По меньшей мере один из следующих участков: внутренний участок (Z), 5'-концевой участок (Xc) и 3'-концевой участок (Yc) включает последовательность, подавляющую экспрессию.

[0017] В настоящем изобретении "подавление экспрессии целевого гена" означает, например, нарушение экспрессии целевого гена. Механизм, посредством которого достигается подавление, конкретно не ограничен и может представлять собой, например, даун-регуляцию или сайленсинг. Подавление экспрессии целевого гена может быть подтверждено, например, следующими фактами: уменьшение количества продукта транскрипции, происходящего от целевого гена, снижение активности продукта транскрипции; уменьшение количества продукта трансляции, происходящего от целевого гена; снижение активности продукта трансляции, или подобные способы. Перед тем, как белки подвергают процессированию или пост-трансляционной модификации и тому подобному, эти белки могут представлять собой, например, зрелые белки и белки предшественники.

[0018] Одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в дальнейшем описании также может называться "молекулой одноцепочечной НК" по настоящему изобретению. Такую молекулу одноцепочечной НК по настоящему изобретению можно использовать для подавления экспрессии целевого гена, например, in vivo или in vitro, то есть ее можно также называть "молекулой одноцепочечной НК для подавления экспрессии целевого гена" или "ингибитором экспрессии целевого гена". Кроме того, молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению может подавлять экспрессию целевого гена, например, посредством РНК-интерференции, то есть она также может называться "молекулой одноцепочечной НК для РНК-интерференции", "молекулой, индуцирующей РНК-интерференцию", "агентом РНК-интерференции" или "агентом, индуцирующим РНК-интерференцию". Молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению также может ингибировать побочные эффекты, например, такие как индукция интерферона.

[0019] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению 5'-конец и 3'-конец не связаны друг с другом. Таким образом, молекулу одноцепочечной НК по настоящему изобретению также можно называть "линейной молекулой одноцепочечной нуклеиновой кислоты". Конфигурация молекулы одноцепочечной НК по настоящему изобретению такова, что, например, внутренний участок (Z), внутренний 5'-концевой участок (X) и внутренний 3'-концевой участок (Y) напрямую связаны друг с другом.

[0020] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению 5'-концевой участок (Xc) является комплементарным внутреннему 5'-концевому участку (X), и 3'-концевой участок (Yc) комплементарен внутреннему 3'-концевому участку (Y). Таким образом, двойная цепь на 5'-конце может быть образована путем конъюгации "в себе" участка (Xc) к участку (X) и самоотжига участков (Хс) и (X). Двойная цепь на 3'-конце может быть образована путем конъюгации "в себе" участка (Yc) к участку (Y) и самоотжига участков (Yc) и (Y). Молекулы одноцепочечной НК по настоящему изобретению могут образовывать двойные цепи внутримолекулярно, как описано выше. Таким образом, строение молекулы одноцепочечной НК полностью отличается от строения двухцепочечной РНК, полученной путем отжига двух отдельных одноцепочечных РНК, например, таких как миРНК, обычно используемых для РНК-интерференции.

[0021] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению последовательность, подавляющая экспрессию, представляет собой последовательность, которая проявляет действие подавления экспрессии целевого гена, например, при введении в клетку in vivo или in vitro молекулы одноцепочечной НК по настоящему изобретению. Нет конкретных ограничений для последовательности, подавляющей экспрессию, и ее можно выбирать подходящим образом в зависимости от вида целевого гена, экспрессию которого необходимо подавлять. В качестве последовательности, подавляющей экспрессию, можно использовать, в зависимости от ситуации, например, последовательность, вовлеченную в РНК-интерференцию, которая опосредована миРНК. В общем, РНК-интерференция представляет собой феномен расщепления дайсером длинной двухцепочечной РНК (дцРНК) в клетке для получения двухцепочечной РНК (миРНК: малой интерферирующей РНК), состоящей примерно из 19-21 пары оснований и имеющей выступающий 3'-конец, и одной из одноцепочечных РНК, и состоит в связывании миРНК с целевой мРНК до разрушения мРНК, в результате чего подавляется трансляция мРНК. В качестве последовательности одноцепочечной РНК известны, например, разные виды целевых генов для связывания миРНК с целевой мРНК. В настоящем изобретении в качестве последовательности, подавляющей экспрессию, например, можно использовать последовательности одноцепочечной РНК из миРНК.

[0022] Следует отметить, что информация о последовательности, подавляющей экспрессию целевого гена, не является целью настоящего изобретения. Фактически настоящее изобретение относится к структуре молекулы нуклеиновой кислоты, которая позволит последовательности, подавляющей экспрессию целевого гена, функционировать в клетке, например, проявлять ингибирующее действие, направленное на целевой ген. Таким образом, в настоящем изобретении в качестве последовательности, подавляющей экспрессию, можно использовать не только последовательности одноцепочечной РНК из миРНК, известные на момент регистрации настоящей заявки, но также, например, последовательности, которые будут идентифицированы в будущем.

[0023] Последовательность, подавляющая экспрессию, предпочтительно является комплементарной заданному участку целевого гена, например, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно комплементарна на 95%, еще более предпочтительно комплементарна на 98%, и особенно предпочтительно комплементарна на 100%. Если последовательность, подавляющая экспрессию, соответствует указанной выше степени комплементарности, то можно, например, адекватно уменьшить нецелевое действие.

[0024] Конкретные примеры последовательности, подавляющей экспрессию, состоят в следующем: например, если целевой ген представляет собой ген GAPDH, можно использовать 19-мерную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1; например, если целевой ген представляет собой ген TGF-β1, можно использовать 21-мерную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16; например, если целевой ген представляет собой ген LAMA1, можно использовать 19-мерную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5; и, например, если целевой ген представляет собой ген LMNA, можно использовать 19-мерную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6.

5'-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3' (SEQ ID NO: 1)

5'-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3' (SEQ ID NO: 16)

5'-AUUGUAACGAGACAAACAC-3' (SEQ ID NO: 5)

5'-UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3' (SEQ ID NO: 6)

[0025] Предполагается, что подавление экспрессии целевого гена с помощью молекулы одноцепочечной НК по настоящему изобретению достигается посредством РНК-интерференции или явления, сходного с РНК-интерференцией (феномена по типу РНК-интерференции), обусловленного структурой молекулы одноцепочечной НК, в которую, например, включена последовательность, подавляющая экспрессию, по меньшей мере в одном из внутреннего участка (Z), 5'-концевого участка (Xc) и 3'-концевого участка (Yc). Вместе с тем, следует отметить, что настоящее изобретение никоим образом не ограничено указанным механизмом. Например, в отличие от так называемых миРНК, молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению не вводится в клетку или в подобную единицу в виде дцРНК, состоящей из двух одноцепочечных РНК, и не всегда является необходимым разрушать последовательность, подавляющую экспрессию в клетке. Таким образом, например, можно сказать, что молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению проявляет действие по типу РНК-интерференции.

[0026] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению последовательность, подавляющая экспрессию, включена по меньшей мере в один участок из внутреннего участка (Z), 5'-концевого участка (Xc) и 3'-концевого участка (Yc), как описано выше. Молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению может включать одну последовательность, подавляющую экспрессию, или, например, две или более последовательности, подавляющие экспрессию.

[0027] В последнем случае молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению может включать, например, две или более одинаковых подавляющих экспрессию последовательности для одного и того же целевого гена; две или более разных подавляющих экспрессию последовательности для одного и того же целевого гена, или две или более разных последовательности, подавляющих экспрессию, для разных целевых генов. Если молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению включает две или более последовательности, подавляющие экспрессию, то нет конкретных ограничений для местоположения соответствующих последовательностей, подавляющих экспрессию, и они могут располагаться в одном участке или в разных участках, выбираемых из внутреннего участка (Z), 5'-концевого участка (Xc) и 3'-концевого участка (Yc). Если молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению включает две или более последовательности, подавляющие экспрессию, для разных целевых генов, молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению может подавлять экспрессию, например, двух или более видов разных целевых генов.

[0028] Как описано выше, внутренний участок (Z) состоит из внутреннего 5'-концевого участка (X) и внутреннего 3'-концевого участка (Y), которые связаны друг с другом. Например, участки (X) и (Y) связаны непосредственно друг с другом без промежуточных последовательностей между ними. Внутренний участок (Z) указан просто для обозначения окружения последовательности между 5'-концевым участком (Xc) и 3'-концевым участком (Yc) и описывается как участок, "состоящий из внутреннего 5'-концевого участка (X) и внутреннего 3'-концевого участка (Y), которые связаны друг с другом". В настоящем описании не рассмотрено в качестве ограничения, что при использовании молекулы одноцепочечной НК 5'-концевой участок (Xc) и 3'-концевой участок (Xc) во внутреннем участке (Z) представляют собой, например, дискретные независимые участки. Таким образом, например, если последовательность, подавляющая экспрессию, включена во внутренний участок (Z), то последовательность, подавляющая экспрессию, может быть расположена так, что она проходит через участки (X) и (Y) во внутреннем участке (Z).

[0029] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению 5'-концевой участок (Xc) является комплементарным для внутреннего 5'-концевого участка (X). Необходимым условием является наличие в участке (Xc) последовательности, комплементарной для всего участка или части участка (X). В частности, например, желательно, чтобы участок (Xc) включал последовательность, комплементарную для всего участка или для части участка (X), или состоял из упомянутых участков. Например, участок (Xc) может быть абсолютно комплементарным для всего участка или части участка (X), или одно или несколько оснований в участке (Xc) может быть некомплементарным для упомянутых участков. Предпочтительно, чтобы участок (Xc) был абсолютно комплементарным для упомянутых участков. В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению 3'-концевой участок (Yc) является комплементарным внутреннему 3'-концевому участку (Y). Необходимым условием является наличие в участке (Yc) последовательности, комплементарной для всего участка или части участка (Y). В частности, например, желательно, чтобы участок (Yc) включал последовательность, комплементарную для всего участка или для части участка (Y), или состоял из упомянутых участков. Например, участок (Yc) может быть абсолютно комплементарным для всего участка или части участка (Y), или одно или несколько оснований в участке (Yc) могут быть некомплементарными для упомянутых участков. Предпочтительно, чтобы участок (Yc) был абсолютно комплементарным для упомянутых участков. Экспрессия "одного или нескольких оснований" означает, например, от 1 до 3 оснований, предпочтительно экспрессию 1 основания или 2 оснований.

[0030] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению 5'-концевой участок (Xc) и внутренний 5'-концевой участок (X) могут быть связаны друг с другом, например, прямым или опосредованным образом. В первом случае участки (Xc) и (X) могут быть связаны прямым образом, например, посредством фосфодиэфирной связи. В последнем случае строение молекулы одноцепочечной НК может быть, например, таковым, что молекула имеет линкерный участок (Lx) между участками (Xc) и (X), и участки (Xc) и (X) связаны через линкерный участок (Lx).

[0031] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению 3'-концевой участок (Yc) и внутренний 3'-концевой участок (Y) могут быть связаны друг с другом, например, прямо или опосредованно. В первом случае участки (Yc) и (Y) могут быть связаны, например, прямым образом посредством фосфодиэфирной связи. В последнем случае молекула одноцепочечной НК может иметь, например, такое строение, что в ней имеется линкерный участок (Ly) между участками (Yc) и (Y), и участки (Yc) и (Y) связаны через линкерный участок (Ly).

[0032] Молекула одноцепочечной НК по настоящему изобретению может иметь, например, или оба линкерных участков (Lx) и (Ly), или может иметь один из упомянутых участков. В последнем случае строение молекулы одноцепочечной НК по настоящему изобретению может быть таковым, что, например, эта молекула имеет линкерный участок (Lx) между 5'-концевым участком (Xc) и внутренним 5'-концевым участком (X), при этом линкерный участок (Ly) между 3'-концевым участком (Yc) и внутренним 3'-концевым участком (Y) отсутствует, то есть участки (Yc) и (Y) связаны друг с другом прямым образом. Также в последнем случае строение молекулы одноцепочечной НК по настоящему изобретению может быть таковым, например, что молекула имеет линкерный участок (Ly) между 3'-концевым участком (Yc) и внутренним 3'-концевым участком (Y), при этом отсутствует линкерный участок (Lx) между 5'-концевым участком (Xc) и внутренним 5'-концевым участком (X), то есть участки (Xc) и (X) связаны друг с другом прямым образом.

[0033] Предпочтительно, каждый из линкерных участков (Lx) и (Ly) имеет такую структуру, что внутри этих участков не происходит самоотжига.

[0034] Фигура 1 показывает схематическое изображение примера молекулы одноцепочечной НК по настоящему изобретению, не включающей линкерный участок. Фигура 1А представляет собой схематическое изображение, показывающее порядок соответствующих участков от 5'-конца к 3'-концу в молекуле одноцепочечной НК. Фигура 1В представляет собой схематическое изображение, показывающее состояние, при котором образуются двойные цепи в молекуле одноцепочечной НК. Как показано на фиг. 1B, в молекуле одноцепочечной НК 5'-концевой участок (Xc) конъюгирует "в себе", при этом двойная цепь образована 5'-концевым участком (Xc) и внутренним 5'-концевым участком (X), и 3'-концевой участок (Yc) конъюгирует "в себе", при этом двойная цепь образована 3'-концевым участком (Yc) и внутренним 3'-концевым участком (Y). Схематические изображения на фигуре 1 показывают, например, только порядок связывания соответствующих участков друг с другом и взаимное расположение соответствующих участков, образующих двойные цепи, и указанные изображения не ограничивают длину и т.п. каждого участка.

[0035] Фигура 2 показывает схематические изображения примера молекулы одноцепочечной НК по настоящему изобретению, включающей линкерные участки. Фигура 2А представляет собой схематическое изображение, показывающее порядок соответствующих участков от 5'-конца к 3'-концу в молекуле одноцепочечной НК, в качестве иллюстративного примера. Фигура 2В представляет собой схематическое изображение, показывающее состояние, при котором происходит образование двойных цепей в молекуле одноцепочечной НК. Как показано на фигуре 2В, в молекуле одноцепочечной НК двойные цепи образуются между 5'-концевым участком (Xc) и внутренним 5'-концевым участком (X) и, соответственно, между внутренним 3'-концевым участком (Y) и 3'-концевым участком (Yc), и каждый из Lx-участка и Ly-участка имеет структуру петли. Схематические изображения на фигуре 2 показывают, например, только порядок связывания соответствующих участков друг с другом и взаимное расположение соответствующих участков, образующих двойные цепи, и указанные изображения не ограничивают длину и т.п. каждого участка.

[0036] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению конкретно не ограничено количество оснований в каждом из 5'-концевого участка (Xc), внутреннего 5'-концевого участка (X), внутреннего 3'-концевого участка (Y) и 3'-концевого участка (Yc), и это количество может в качестве примера иметь нижеуказанные значения. В настоящем изобретении "количество оснований" означает, например, "длину" и также может называться "длиной в основаниях".

[0037] Как описано выше, 5'-концевой участок (Xc) может быть комплементарным, например, для всего участка из внутреннего 5'-концевого участка (X). В этом случае является предпочтительным, например, чтобы участок (Xc) имел такую же длину в основаниях, как и участок (X), и состоял из последовательности оснований, которая комплементарна для всего участка на протяжении от 5'-конца к 3'-концу участка (X). Более предпочтительно, например, чтобы участок (Xc) имел такую же длину в основаниях, как и участок (X), и все основания в участке (Xc) были комплементарными для всех оснований в участке (X), т.е., чтобы участок (Xc) был полностью комплементарен участку (X). Вместе с тем, следует отметить, что строение участка (Xc) не ограничено описанием выше, и например, одно или несколько оснований в участке (Xc) могут быть некомплементарными соответствующим основаниям в участке (X), как описано выше.

[0038] Кроме того, согласно описанию выше, 5'-концевой участок (Xc) может быть комплементарным, например, для части внутреннего 5'-концевого участка (X). В этом случае, например, является предпочтительным, чтобы участок (Xc) имел такую же длину в основаниях, как и часть участка (X), т.е., чтобы участок (Xc) состоял из последовательности оснований, длина которой по количеству оснований меньше на одно или несколько оснований, чем длина в основаниях участка (X). Более предпочтительно, чтобы участок (Xc) имел такую же длину в основаниях, как часть участка (X), и все основания в участке (Xc) были бы комплементарны всем основаниям в части участка (X), т.е., например, чтобы участок (Xc) был полностью комплементарен части участка (X). Например, часть участка (X) предпочтительно представляет собой участок (сегмент), имеющий последовательность оснований, которая состоит из последовательных оснований, начиная с основания на 5'-конце (первое основание) в участке (X).

[0039] Как описано выше, 3'-концевой участок (Yc) может быть комплементарным, например, для всего участка из внутреннего 3'-концевого участка (Y). В этом случае является предпочтительным, чтобы, например, участок (Yc) имел такую же длину в основаниях, как участок (Y), и состоял из последовательности оснований, комплементарных для всего участка на протяжении от 5' конца к 3'-концу участка (Y). Более предпочтительно, чтобы участок (Yc) имел такую же длину в основаниях, как участок (Y), и все основания в участке (Yc) были бы комплементарными для всех оснований в участке (Y), т.е., например, чтобы участок (Yc) был полностью комплементарен участку (Y). Вместе с тем, следует отметить, что строение участка (Yc) не ограничено вышеуказанным, и одно или несколько оснований в участке (Yc) могут быть некомплементарными соответствующим основаниям в участке (Y), например, как описано выше.

[0040] Кроме того, 3'-концевой участок (Yc) может быть комплементарным для части внутреннего 3'-концевого участка (Y), например, как описано выше. В этом случае является предпочтительным, чтобы, например, участок (Yc) имел такую же длину в основаниях, как часть участка (Y), т.е., чтобы участок (Yc) состоял из последовательности оснований, длина которой по количеству оснований была меньше на одно или несколько оснований, чем длина в основаниях участка (Y). Более предпочтительно, чтобы участок (Yc) имел такую же длину в основаниях, как часть участка (Y), и чтобы все основания в участке (Yc) были бы комплементарны всем основаниям в части участка (Y), т.е., например, чтобы участок (Yc) был полностью комплементарен для части участка (Y). Часть участка (Y) предпочтительно представляет собой, например, участок (сегмент), имеющий последовательность оснований, которая состоит из последовательных оснований, начиная с основания на 3'-конце (первое основание) в участке (Y).

[0041] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению соотношения числа оснований (Z) во внутреннем участке (Z) к числу оснований (X) во внутреннем 5'-концевом участке (X) и к числу оснований (Y) во внутреннем 3'-концевом участке (Y), и отношение числа оснований (Z) во внутреннем участке (Z) к числу оснований (X) во внутреннем 5'-концевом участке (X) и к числу оснований (Xc) в 5'-концевом участке (Xc) удовлетворяют условиям выражений (1) и (2), например:

Z=X+Y (1)

Z≥Xc+Yc (2)

[0042] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению нет конкретного ограничения для соотношения длины между числом оснований (X) во внутреннем 5'-концевом участке (X) и числом оснований (Y) во внутреннем 3'-концевом участке (Y), и это соотношение может соответствовать любым условиям согласно следующим выражениям, например:

X=Y (19)

X<Y (20)

X>Y (21)

[0043] В молекуле одноцепочечной НК по настоящему изобретению соотношение между числом оснований (X) во внутреннем 5'-концевом участке (X) и числом оснований (Xc) в 5'-концевом участке (Xc), и соотношение между числом оснований (Y) во внутреннем 3'-концевом участке (Y) и числом оснований (Yc) в 3'-концевом участке (Yc) соответствуют любому из следующих условий: от (а) до (d), например:

(a) соответствуют условиям выражений (3) и (4).

X>Хс (3)

Y=Yc (4)

(b) соответствуют условиям выражений (5) и (6).

X=Xc (5)

Y>Yc (6)

(c) соответствуют условиям выражений (7) и (8).

X>Хс (7)

Y>Yc (8)

(d) соответствуют условиям выражений (9) и (10).

X=Xc (9)

Y=Yc (10)

[0044] Согласно вышеуказанным условиям от (а) до (d), разница между числом оснований (X) во внутреннем 5'-концевом участке (X) и числом оснований (Xc) в 5'-концевом участке (Xc) и разница между числом оснований (Y) во внутреннем 3'-концевом участке (Y) и числом оснований (Yc) в 3'-концевом участке (Yc) предпочтительно соответствуют следующим условиям от (а) до (d), например:

(а) соответствуют условиям выражений (11) и (12).

X-Xc=от 1 до 10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4,

и более предпочтительно 1, 2 или 3 (11)

Y-Yc=0 (12)

(b) соответствуют условиям выражений (13) и (14).

X-Xc=0 (13)

Y-Yc=от 1 до 10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4,

и более предпочтительно 1, 2 или 3 (14)

(c) соответствуют условиям выражений (15) и (16).

X-Xc=от 1 до 10, предпочтительно 1, 2 или 3,

и более предпочтительно 1 или 2 (15)

Y-Yc=0 (16)

(d) соответствуют условиям выражений (17) и (18).

X-Xc=0 (17)

Y-Yc=0 (18)

[0045] В отношении молекул одноцепочечной НК, соответствующих условиям от (а) до (d), примеры их структуры показаны в схематическом виде соответственно на фиг. 3. Фигура 3 показывает молекулы одноцепочечной НК, включающие линкерные участки (Lx) и (Ly). Фигура 3А показывает пример молекулы одноцепочечной НК, соответствующей условию (а), фигура 3B показывает пример молекулы одноцепочечной НК, соответствующей условию (b), фиг. 3C показывает пример молекулы одноцепочечной НК, соответствующей условию (c), и фиг. 3D показывает пример молекулы одноцепочечной НК, соответствующей условию (d). Пунктирные линии на фиг. 3 указывают состояние, при котором образуются двойные цепи путем самоотжига. Молекулы одноцепочечной НК, показанные на фиг. 3, относятся к примерам, в которых соотношения между числом оснований (X) во внутреннем 5'-концевом участке (X) и числом оснований (Y) во внутреннем 3'-концевом участке (Y) соответствуют условию "X<Y" выражения (20). Вместе с тем, следует отметить, что соотношения не ограничены вышеуказанным, и условиям может соответствовать отношение "X=Y" из выражения (19) или "X>Y" из выражения (21). Схематические изображения на фигуре 3 просто показывают соотношение между внутренним 5'-концевым участком (X) и 5'-концевым участком (Xc), и соотношение между внутренним 3'-концевым участком (Y) и 3'-концевым участком (Yc), и не ограничивают, например, показатели длины, формы и т.п. для каждого участка, а также наличие или отсутствие линкерных участков (Lx) и (Ly).

[0046] Каждая из молекул одноцепочечной НК, соответствующая условиям от (а) до (с), имеет такое строение, что, например, при образовании двойной цепи 5'-концевым участком (Xc) и внутренним 5'-концевым участком (X) и 3'-концевым участком (Yc) и внутренним 3'-концевым участком (Y), соответственно, внутренний участок (Z) включает по меньшей мере одно основание, в связи с чем невозможно его выравнивание как с 5'-концевым участком (Xc), так и с 3'-концевым участком (Yc). Основание во внутреннем участке (Z), которое невозможно выровнять (основание, которое не образует двойную цепь), далее в изобретении также называется "непарным основанием". На фиг. 3 участок, состоящий из непарного основания (оснований), обозначен как участок "F". Количество оснований в участке (F) не имеет конкретных ограничений. Количество оснований (F) в участке (F) является следующим, например: "Xc-X" в случае со