Комбинированные вакцины для профилактики вирусных инфекций свиней

Комбинированные вакцины для профилактики вирусных инфекций свиней

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по следующим трем патентным заявкам Китая: 201110140951.5, зарегистрированной 27 мая 2011 года, названной "Combination Vaccines for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome and Classical Swine Fever and Uses Thereof", 201110331206.9, зарегистрированной 27 октября 2011 года, названной "Combination Vaccines for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome and Porcine Pseudorabies Virus and Uses Thereof", 201110331159.8, зарегистрированной 27 октября 2011 года, названной "Triple Combination Vaccines for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, Classical Swine Fever and Porcine Pseudorabies Virus and Preparation Methods Thereof", включенным в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к ветеринарным биологическим продуктам, конкретно к живой комбинированной вакцине для профилактики репродуктивного и респираторного синдрома свиней, классической чумы свиней и вируса псевдобешенства свиней и ее получению.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (PRRS) является одним из основных инфекционных заболеваний, угрожающих свиноводству во многих регионах мира. Со времен вспышки высокопатогенного репродуктивного и респираторного синдрома свиней (также называемого высокопатогенной "болезнью синих ушей") в Китае в 2006 году PRRS вызывал огромный экономический ущерб свиноводству в Китае и был внесен в список Министерства сельского хозяйства Китая как одно из заболеваний, для которых необходима обязательная вакцинация.

Помимо PRRS свиньи могут быть инфицированы другими инфекционными заболеваниями, такими как классическая чума свиней (CSF) и псевдобешенство. Однако, известно, что вирус PRRS (PRRSV) индуцирует иммуносупрессию после инфицирования своего хозяина и, таким образом, как правило, приводит к сниженному иммунному ответу на вторичные инфекции или даже к неудачной вакцинации. Исследования показали, что PRRSV повреждает иммунную систему хозяина, например, разрушая альвеолярные макрофаги, которые имеют важное значение для развития иммунного ответа, и/или подавляя экспрессию цитокинов, осуществляющих иммунологическую защиту от вторичных инфекций. Например, обнаруживали, что инфекция PRRSV значительно ингибирует иммунный ответ хозяина на вакцину против вируса классической чумы свиней (CSFV), даже приводя к неудачной вакцинации против CSFV (Suradhat, S. et al, Vaccine, 24: 2634-3642 (2006); Li, H. et al, Veterinary Microbiology, 95: 295-301 (2003)). Сообщают, что комбинированная вакцинация аттенуированным PRRSV и аттенуированным CSFV имеет сниженную степень иммунологической защиты приблизительно 60%, что не соответствует требованиям для вакцинации. Для вакцинирования против двух патогенов необходимы отдельные вакцинации, разделенные 14-дневными интервалами (см., например? Du, X.Z. et al, Zhejiang Journal Animal Science and Veterinary Medicine, 2: p5-6 (2011)). В качестве другого примера, обнаруживали, что PRRSV отрицательно влияет на эффекты вакцинации против вируса псевдобешенства (PRV) и значительно снижает или замедляет иммунный ответ хозяина против PRV (De Bruin, M.G.M. et al, Veterinary Immunology and Immunopathology, 76(1-2): p.125-135 (2000)).

Иммуноингибирование PRRSV, как правило, усложняет схему вакцинации свиней и снижает эффективность вакцинации. Когда свиней вакцинируют против PRRSV и других вирусов, часто необходимо использовать повторные инъекции и многократное введение доз, что делает процесс вакцинации длительным, трудоемким и затратным. Кроме того, в схеме многократной вакцинации пропущенная доза может оказывать непосредственное влияние на эффективность защиты вакцинами, в то время как частые и повторные вакцинации могут приводить к иммунопараличу и индуцировать иммунологический стресс.

Таким образом, существует потребность в комбинированной вакцинной композиции против PRRSV и других инфекционных заболеваний свиней без существенного иммуноингибирования.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вакцинным композициям, содержащим вакцину против вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) и вакцину против второго вируса свиней, где вакцина против PRRSV и вторая вакцина, по существу, не оказывают иммуноингибирования в отношении друг друга. В определенных вариантах осуществления вакцинная композиция дополнительно содержит вакцину против третьего вируса свиней, где вакцина против PRRSV, вторая вакцина и третья вакцина, по существу, не оказывают иммуноингибирования в отношении друг друга.

В определенных вариантах осуществления вакцина против второго вируса свиней выбрана из вакцины против вируса классической чумы свиней (CSFV) и вакцины против вируса псевдобешенства (PRV). В определенных вариантах осуществления вакцина против третьего вируса свиней выбрана из вакцины против вируса классической чумы свиней (CSFV) и вакцины против вируса псевдобешенства (PRV). Вторая вакцина отличается от третьей вакцины.

В определенных вариантах осуществления вакцинные композиции содержат вакцину против PRRSV, вакцину против CSFV и вакцину против PRV, где вакцина против PRRSV, вакцина против CSFV и вакцина против PRV, по существу, не оказывают иммуноингибирования в отношении друг друга.

В определенных вариантах осуществления вакцина против PRRSV содержит аттенуированный PRRSV. В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV содержит нуклеотид Nsp2, кодируемый последовательностью ДНК, в которой по сравнению с SEQ ID NO:4 отсутствует нуклеотидный фрагмент, содержащий по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, где фрагмент является по меньшей мере приблизительно на 80% гомологичным части SEQ ID NO:8 той же длины. В определенных вариантах осуществления фрагмент ДНК содержит по меньшей мере 100, по меньшей мере 120, по меньшей мере 150, по меньшей мере 180, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290, по меньшей мере 300, по меньшей мере 310, по меньшей мере 320, по меньшей мере 330, по меньшей мере 340, по меньшей мере 350, или, по меньшей мере 360 смежных нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления фрагмент ДНК является по меньшей мере приблизительно на 81%, приблизительно на 82%, приблизительно на 83%, приблизительно на 84%, приблизительно на 85%, приблизительно на 86%, приблизительно на 87%, приблизительно на 88%, приблизительно на 89%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или на 100% гомологичным части SEQ ID NO: 8 той же длины. В определенных вариантах осуществления фрагмент ДНК содержит SEQ ID NO: 8.

В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV содержит нуклеотид Nsp2, кодирующий последовательность белка Nsp2, в котором по сравнению с SEQ ID NO:11 отсутствует пептидный фрагмент, содержащий по меньшей мере 20 смежных аминокислот, где фрагмент является по меньшей мере приблизительно на 80% гомологичным части SEQ ID NO:9 той же длины. В определенных вариантах осуществления пептидный фрагмент содержит, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 105, по меньшей мере 110, по меньшей мере 115 или по меньшей мере 120 смежных аминокислот. В определенных вариантах осуществления пептидный фрагмент является по меньшей мере приблизительно на 81%, приблизительно на 82%, приблизительно на 83%, приблизительно на 84%, приблизительно на 85%, приблизительно на 86%, приблизительно на 87%, приблизительно на 88%, приблизительно на 89%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или на 100% гомологичным части SEQ ID NO: 9 той же длины. В определенных вариантах осуществления пептидный фрагмент содержит SEQ ID NO: 9.

В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV является аттенуированным относительно высокопатогенного PRRSV. В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV содержит нуклеотид Nsp2, кодируемый последовательностью ДНК, в которой по сравнению с SEQ ID NO:5 отсутствуют 90 несмежных нуклеотидов в SEQ ID NO:6. В определенных вариантах осуществления нуклеотид Nsp2 кодирует последовательность, имеющая по меньшей мере 90% гомологии с SEQ ID NO:2. В определенных вариантах осуществления нуклеотид Nsp2 кодирует последовательность, содержащая SEQ ID NO:2.

В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV дополнительно содержит нуклеотидную последовательность Nsp1, кодируемую последовательностью, имеющей по меньшей мере 90% гомологии с SEQ ID NO:1. В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV содержит нуклеотидную последовательность Nsp1, кодируемую SEQ ID NO:1, и нуклеотидную последовательность Nsp2, кодируемую SEQ ID NO:2.

В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV содержит нуклеотидную последовательность PRRSV, кодируемую последовательностью, имеющей по меньшей мере 90% гомологии с SEQ ID NO: 3. В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV содержит нуклеотидную последовательность PRRSV, кодируемую SEQ ID NO: 3. В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV имеет регистрационный номер в CGMCC 3121.

В определенных вариантах осуществления вакцина против CSFV содержит аттенуированный CSFV. В определенных вариантах осуществления аттенуированный CSFV кодирует последовательность, имеющая по меньшей мере 80% гомологии с SEQ ID NO: 10. В определенных вариантах осуществления аттенуированный CSFV кодирует SEQ ID NO: 10. В определенных вариантах осуществления аттенуированный CSFV имеет регистрационный номер в CGMCC 3891.

В определенных вариантах осуществления вакцина против PRV содержит аттенуированный PRV. В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRV содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологии с последовательностью, имеющей в NCBI идентификационный номер NC_006151.

В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRV имеет один или несколько инактивированных генов, выбранных из группы, состоящей из TK, PK, RR, дУТФазы, gG, gC, gE, gD и gI. В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRV имеет инактивированный ген gE. В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRV имеет регистрационный номер в CGMCC 5076.

В определенных вариантах осуществления вакцинная композиция, представленная в настоящем описании, содержит иммунологически эффективное количество вакцины против PRRSV, вакцины против CSFV и/или вакцины против PRV. В определенных вариантах осуществления иммунологически эффективное количество вакцины против PRRSV составляет по меньшей мере 10^4,5 TCID₅₀, 10^5,0 TCID₅₀ или 10^5,5 TCID₅₀, иммунологически эффективное количество вакцины против CSFV составляет по меньшей мере 10^0,5 FA-TCID₅₀ (TCID₅₀, определяемая с помощью флуоресцентно-меченых антител), 10^1,0 FA-TCID₅₀, 10^1,5 FA-TCID₅₀, 10^2,0 FA-TCID₅₀, 10^2,5 FA-TCID₅₀, 10^3,0 TCID₅₀, 10^3,5 FA-TCID₅₀, 10^4,0 FA-TCID₅₀, 10^4,5 FA-TCID₅₀ или 10^5,0 FA-TCID₅₀ или составляет по меньшей мере 2,5 RID (инфицирующая доза для кролика), 3 RID, 5 RID, 10 RID, 30 RID, 100 RID, 150 RID, 300 RID, 750 RID, 1000 RID, 3000 RID или 7500 RID, и/или иммунологически эффективное количество вакцины против PRV составляет по меньшей мере 10^3,0 TCID₅₀, 10^3,5 TCID₅₀, 10^4,0 TCID₅₀, 10^4,5 TCID₅₀, 10^5,0 TCID₅₀, 10^5,5 TCID₅₀ или 10^6,0 TCID₅₀.

В определенных вариантах осуществления соотношение TCID₅₀ вакцины против PRRSV и вакцины против CSFV в комбинированной вакцине находится в диапазоне от 10000:1 до 1:1. В определенных вариантах осуществления соотношение TCID₅₀ вакцины против PRRSV и вакцины против PRV в комбинированной вакцине находится в диапазоне от 1:1 до 1:30. В определенных вариантах осуществления соотношение TCID₅₀ вакцины против PRRSV: вакцины против CSFV: вакцины против PRV в комбинированной вакцине находится в диапазоне от приблизительно 10⁴:1:10⁵ до приблизительно 5:1:6.

В определенных вариантах осуществления вакцинные композиции дополнительно содержат адъювант. В определенных вариантах осуществления вакцинные композиции дополнительно содержат криопротектор. В определенных вариантах осуществления криопротектор содержит сахарозу, L-глутамат натрия и/или гидролизат лактальбумина.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам получения вакцинных композиций, представленных в настоящем описании, включающим: (a) сбор вакцинного штамма PRRSV, вакцинного штамма CSFV и/или вакцинного штамма PRV, культивируемых в соответствующих им восприимчивых клетках, и (b) смешивание двух или более вирусных штаммов при подходящем соотношении TCID₅₀.

В определенных вариантах осуществления восприимчивыми клетками для вакцинного штамма PRRSV является клеточная линия, выбранная из группы, состоящей из Marc-145, MA-104, Vero и CL-2621, или первичная культура клеток, являющаяся культурой клеток PAM. В определенных вариантах осуществления восприимчивыми клетками для вакцинного штамма CSFV является клеточная линия, выбранная из группы, состоящей из BT, Vero, MPK, SK6, PK2a, CPK, RKC, MDBK, MDCK, CRFK, ST и PT, или первичная культура клеток, являющаяся культурой клеток BT. В определенных вариантах осуществления восприимчивыми клетками для вакцинного штамма PRV является клеточная линия, выбранная из группы, состоящей из ST, PK-15, Marc-145, MDBK, BT, Vero, BHK-21, линия клеток почки свиньи (IBRS-2), линия клеток почки кролика (RK) и линия эмбриональных фибробластов курицы, или первичная культура клеток, являющаяся первичной культурой клеток почки свиньи.

В определенных вариантах осуществления культивирование включает инокуляцию каждым вакцинным штаммом восприимчивых клеток при плотности клеток в диапазоне от 1×10⁶/мл - 5×10⁶/мл при культивировании в роллерном флаконе или при плотности клеток в диапазоне от 5×10⁶/мл - 1×10⁷/мл в суспензионной культуре с встроенным адгезионным носителем в биореакторе.

В определенных вариантах осуществления инокулируют вакцинным штаммом PRRSV при множественности заражения (MOI) 0,01-0,5, вакцинным штаммом CSFV инокулируют при MOI 0,1-0,5 и/или инокулируют вакцинным штаммом PRV при MOI 0,005-0,5.

В определенных вариантах осуществления этап (b) включает смешивание собранного вакцинного штамма вируса PRRSV с вакцинным штаммом вируса CSFV при соотношении TCID₅₀ от 10000:1 до 1:1. В определенных вариантах осуществления этап (b) включает смешивание собранного вакцинного штамма вируса PRRSV с вакцинным штаммом вируса PRV при соотношении TCID₅₀ от 1:1 до 1:30. В определенных вариантах осуществления этап (b) включает смешивание собранного вакцинного штамма вируса PRRSV, вакцинного штамма вируса CSFV и вакцинного штамма вируса PRV при соотношении TCID₅₀ от 10⁴:1:10⁵ до приблизительно 5:1:6.

В определенных вариантах осуществления этап (b) дополнительно включает смешивание смеси растворов, содержащих собранные вирусы, с криопротектором. В определенных вариантах осуществления смесь растворов, содержащих собранные вирусы, смешивают с криопротектором в объемном соотношении 75-80:25-20.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцинным композициям, получаемым с использованием способов, представленных в настоящем описании.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению вакцинных композиций, представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения PRRS, CSF и/или PR.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам иммунизации свиней, включающим введение свинье вакцинной композиции, представленной в настоящем описании.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцинным штаммам CSFV, культивируемым в клеточной линии, выбранной из группы, состоящей из ST, PK-15, Marc-145, MDBK, BT, Vero, BHK-21, линии клеток почки свиньи (IBRS-2), линии клеток почки кролика (RK) и линии эмбриональных фибробластов курицы, или первичной культуре клеток, являющейся первичной культурой клеток почки свиньи. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению этих клеточных линий в культивировании вакцинного штамма CSFV.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показаны 360 последовательных нуклеотидов, отсутствующих в кодирующей Nsp2 последовательности в штамме TJM PRRSV, но присутствующих в нуклеотидной последовательности Nsp2 штамма TJ PRRSV.

На фигуре 2 показана последовательность из 120 аминокислот, отсутствующих в белке Nsp2, кодируемом в штамме TJM PRRSV, но присутствующих в белке Nsp2 штамма TJ PRRSV.

Фигура 3 является схематическим изображением, на котором показана делеция 90 нуклеотидов в кодирующей Nsp2 последовательности высокопатогенного штамма PRRSV и делеция 90 нуклеотидов и делеция 360 нуклеотидов в аттенуированном штамме TJM PRRSV.

На фигуре 4 показана последовательность 90 несмежных нуклеотидов, отсутствующих в высокопатогенном штамме TJ PRRSV, но присутствующих в штамме VR-2332 PRRSV.

На фигуре 5 показана электрофореграмма вакцинного штамма TJM PRRSV (дорожка 2), высокопатогенного вирулентного штамма TJ PRRSV (дорожка 1) и воды (дорожка 3, в качестве отрицательного контроля), соответственно. M представляет собой маркер молекулярной массы.

На фигуре 6 показана электрофореграмма вакцинного штамма PRV (дорожка 1), вирулентного штамма (дорожка 2) и воды (дорожка 3, в качестве отрицательного контроля), соответственно. M представляет собой маркер молекулярной массы.

На фигуре 7 показаны изменения (%) CD3+ T-клеток у тестируемых свиней, вакцинированных отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV и комбинированной вакциной или отрицательным контролем.

На фигуре 8 показаны изменения (%) CD4+ T-клеток у тестируемых свиней, вакцинированных отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV и комбинированной вакциной или отрицательным контролем.

На фигуре 9 показаны изменения (%) CD8+ T-клеток у тестируемых свиней, вакцинированных отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV и комбинированной вакциной или отрицательным контролем.

На фигуре 10 показаны изменения (%)CD4+CD8+ T-клеток у тестируемых свиней, вакцинированных отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV, комбинированной вакциной PRRSV и CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 11 показаны титры антител против PRRSV (определяемые с помощью ELISA) у свиней, вакцинированных отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, комбинированной вакциной на основе штаммов TJM PRRSV и C (F16) CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 12 показаны титры антител против CSFV (определяемые с помощью ELISA) у свиней, вакцинированных отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV, комбинированной вакциной на основе штаммов TJM PRRSV и C (F16) CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 13 показаны ректальные температуры свиней после вакцинации отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV, комбинированной вакциной на основе штаммов TJM PRRSV и C (F16) CSFV или отрицательными контролями.

На фигуре 14 показаны ректальные температуры свиней после заражения вирулентными штаммами PRRSV, свиней вакцинировали отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, комбинированной вакциной на основе штаммов TJM PRRSV и C (F16) CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 15 показаны ректальные температуры свиней после заражения вирулентными штаммами CSFV, свиней вакцинировали отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV, комбинированной вакциной на основе штаммов TJM PRRSV и C (F16) CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 16 показана балльная оценка клинических симптомов у свиней после заражения вирулентными штаммами PRRSV, свиней вакцинировали отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, комбинированной вакциной на основе штаммов TJM PRRSV и C (F16) CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 17 показана балльная оценка клинических симптомов у свиней после заражения вирулентными штаммами CSFV, свиней вакцинировали отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV, комбинированной вакциной на основе штаммов TJM PRRSV и C (F16) CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 18 показаны изменения (%)CD3+ T-клеток у свиней после заражения вирулентными штаммами PRRSV, свиней вакцинировали отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV, комбинированной вакциной на основе штаммов TJM PRRSV и C (F16) CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 19 показаны изменения (%) CD4+ T-клеток после заражения вирулентными штаммами PRRSV.

На фигуре 20 показаны изменения (%) CD8+ T-клеток после заражения вирулентными штаммами PRRSV.

На фигуре 21 показаны изменения (%) CD4+ CD8+ T-клеток после заражения вирулентными штаммами PRRSV.

На фигуре 22 показаны изменения (%) CD3+ T-клеток после заражения вирулентными штаммами CSFV, свиней вакцинировали отдельной вакциной на основе штамма C (F16) CSFV, комбинированной вакциной против PRRSV и CSFV или отрицательным контролем.

На фигуре 23 показаны изменения (%) CD4+ T-клеток после заражения вирулентными штаммами CSFV.

На фигуре 24 показаны изменения (%) CD8+ T-клеток после заражения вирулентными штаммами CSFV.

На фигуре 25 показаны изменения (%) CD4+ CD8+ T-клеток после заражения вирулентными штаммами CSFV.

На фигуре 26 показан титр нейтрализующих антител против PRV после вакцинации PRRSV и PRV. Группу I последовательно инокулировали отдельной вакциной на основе штамма TJM PRRSV и отдельной вакциной на основе штамма Bartha K61 PRV, группу II инокулировали двойной комбинированной живой вакциной, группу III инокулировали отдельной вакциной на основе штамма Bartha K61 PRV, группу IV инокулировали только стерильным PBS.

На фигуре 27 показаны титры штамма вируса C (F16) CSFV в отдельной вакцине против CSFV и в двойной комбинированной вакцине (PRRSV и CSFV) после хранения при 37°C в течение 14 дней. 200904, 200905 и 200906 представляют собой три партии двойной комбинированной вакцины, 200901 и 200902 и 200903 представляют собой три партии отдельной вакцины на основе штамма TJM PRRSV.

На фигуре 28 показаны титры штамма вируса TJM PRRSV в отдельной вакцине против PRRSV и в двойной комбинированной вакцине (PRRSV и CSFV) после хранения при 37°C в течение 14 дней. 200904, 200905 и 200906 представляют собой три партии двойной комбинированной вакцины, 200907 и 200908 и 200909 представляют собой три партии штамма C (F16) CSFV.

На фигуре 29 показаны титры штамма вируса C (F16) CSFV в отдельной вакцине против CSFV и в двойной комбинированной вакцине (PRRSV и CSFV) после хранения при 2-8°C в течение 18 месяцев. 200904, 200905 и 200906 представляют собой три партии двойной комбинированной вакцины, 200901 и 200902 и 200903 представляют собой три партии отдельной вакцины на основе штамма TJM PRRSV.

На фигуре 30 показаны титры штамма вируса TJM PRRSV в отдельной вакцине против PRRSV и в двойной комбинированной вакцине (PRRSV и CSFV) после хранения при 2-8°C в течение 18 месяцев. 200904, 200905 и 200906 представляют собой три партии двойной комбинированной вакцины, 200907 и 200908 и 200909 представляют собой три партии штамма C (F16) CSFV.

На фигуре 31 показаны титры штамма вируса TJM PRRSV в двойной комбинированной вакцине (PRRSV и PRV) после хранения при 2-8°C в течение 24 месяцев. SD001, SD002 и SD003 представляют собой три различные партии двойной живой комбинированной вакцины, соответственно.

На фигуре 32 показаны титры штамма вируса Bartha K61 PRV в двойной комбинированной вакцине (PRRSV и PRV) после хранения при 2-8°C в течение 24 месяцев. SD001, SD002 и SD003 представляют собой три различные партии двойной живой комбинированной вакцины, соответственно.

На фигуре 33 показаны титры штамма вируса TJM PRRSV в двойной комбинированной вакцине (PRRSV и PRV) после хранения при 37°C в течение 14 дней. SD001, SD002 и SD003 представляют собой три различные партии двойной живой комбинированной вакцины, соответственно.

На фигуре 34 показаны титры вируса штамма Bartha K61 PRV в двойной комбинированной вакцине (PRRSV и PRV) после хранения при 37°C в течение 14 дней. SD001, SD002 и SD003 представляют собой три различные партии двойной живой комбинированной вакцины, соответственно.

На фигуре 35 показаны титры штамма вируса TJM PRRSV в тройной живой комбинированной вакцине (TJM PRRSV + штамм C (F16) CSFV+ Bartha K61 PRV) после хранения 2-8°C в течение 18 месяцев. 031-01, 031-02 и 031-03 представляют собой три партии тройной живой комбинированной вакцины, и 031-04, 031-05 и 031-06 представляют собой три партии отдельной вакцины на основе штамма TJM PRRSV.

На фигуре 36 показаны титры штамма вируса C (F16) CSFV в тройной живой комбинированной вакцине (TJM PRRSV + штамм C (F16) CSFV+ Bartha K61 PRV) после хранения 2-8°C в течение 18 месяцев. 031-01, 031-02 и 031-03 представляют собой три партии тройной живой комбинированной вакцины, и 031-07, 031-08 и 031-09 представляют собой три партии отдельной вакцины на основе штамма C (F16) CSFV.

На фигуре 37 показаны титры штамма вируса Bartha K61 PRV в тройной живой комбинированной вакцине (TJM PRRSV + штамм C (F16) CSFV + Bartha K61 PRV) после хранения 2-8°C в течение 18 месяцев. 031-01, 031-02 и 031-03 представляют собой три партии тройной живой комбинированной вакцины, и 031-10, 031-11 и 031-12 представляют собой три партии отдельной вакцины на основе штамма Bartha K61 PRV.

На фигуре 38 показаны титры штамма вируса TJM PRRSV в тройной живой комбинированной вакцине (TJM PRRSV + штамм C (F16) CSFV+ Bartha K61 PRV) после хранения 37°C в течение 14 дней. 031-01, 031-02 и 031-03 представляют собой три партии тройной живой комбинированной вакцины, и 031-04, 031-05 и 031-06 представляют собой три партии отдельной вакцины на основе штамма TJM PRRSV.

На фигуре 39 показаны титры штамма вируса C (F16) CSFV в тройной живой комбинированной вакцине (TJM PRRSV + C CSFV штамм (F16)+ Bartha K61 PRV) после хранения 37°C в течение 14 дней. 031-01, 031-02 и 031-03 представляют собой три партии тройной живой комбинированной вакцины, и 031-07, 031-08 и 031-09 представляют собой три партии отдельной вакцины на основе штамма C (F16) CSFV.

На фигуре 40 показаны титры штамма вируса Bartha K61 PRV в тройной живой комбинированной вакцине (TJM PRRSV + C CSFV штамм (F16)+ Bartha K61 PRV) после хранения 37°C в течение 14 дней. 031-01, 031-02 и 031-03 представляют собой три партии тройной живой комбинированной вакцины, и 031-10, 031-11 и 031-12 представляют собой три партии отдельной вакцины на основе штамма Bartha K61 PRV.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представленное ниже описание предназначено исключительно для иллюстрирования различных вариантов осуществления настоящего изобретения. В связи с этим, конкретные описываемые модификации не предназначены для ограничения изобретения. Для специалиста в этой области очевидно, что можно осуществлять различные эквиваленты, изменения и модификации без отклонения от сущности или объема объекта изобретения, представленного в настоящем описании, и следует понимать, что такие эквивалентные варианты осуществления подлежат включению в настоящее описание. Все публикации, патенты или патентные заявки, процитированные в настоящем описании, включены в качестве ссылки в полном объеме.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вакцинным композициям, содержащим вакцину против вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) и вакцину против второго вируса свиней, где вакцина против PRRSV и вторая вакцина, по существу, не оказывают иммуноингибирования в отношении друг друга.

PRRSV является РНК-вирусом с (+)-цепью, для которого к настоящему времени идентифицировали два генотипа: европейский генотип и американский генотип. Геном PRRSV содержит множественные открытые рамки считывания, в которых первая открытая рамка считывания (ORF1a и ORF1b) содержит 80% последовательности генома PRRSV и кодирует РНК-репликазу, необходимую для репликации PRRSV (Straw et al, Diseases of Swine, 9TH edition, chapter 24(2006)). ORF1a и ORF1b транслируются в полипротеин, расщепляемый содержащимся в нем протеазным доменом на несколько неструктурных белков, включая Nsp1-Nsp12 (см., например, Vries et al, Seminars in Virology, 8: 33-47 (1997); Allende et al, Journal of General Virology, 80: 307-315(1999)).

Вакцина против PRRSV и вакцина против второго вируса свиней, по существу, не оказывают иммуноингибирования в отношении друг друга.

Как применяют в настоящем описании, термин "по существу, не оказывают иммуноингибирования" означает, что комбинация двух или более отдельных вакцин не приводит к существенному снижению протективного иммунного ответа у хозяина на одну из отдельных вакцин или на все из отдельных вакцин. Как применяют в настоящем описании, термин "существенное снижение" относится к снижению на >20% (например, снижению на >30%, >40%, >50% или >60%).

В определенных вариантах осуществления комбинация двух или более отдельных вакцин способна вызывать протективный иммунный ответ на каждую из отдельных вакцин на уровне, сравнимом с иммунным ответом, вызываемым отдельной вакциной. Например, комбинация вакцины против PRRSV и вакцины против второго вируса свиней может вызывать иммунный ответ на PRRSV на уровне, сравнимом с иммунным ответом, вызываемым отдельной вакциной против PRRSV, и/или может вызывать иммунный ответ на вакцину против второго вируса свиней на уровне, сравнимом с иммунным ответом, вызываемым отдельной вакциной против второго вируса свиней.

Протективный иммунный ответ, как правило, включает гуморальный, клеточный и/или мукозальный иммунные ответы, и его можно охарактеризовывать с использованием известных в этой области способов. Гуморальный иммунный ответ развивается посредством продукции антител (например, IgG) против антигена в сыворотке. Титры антител легко можно измерять с использованием анализов, таких как ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Например, вирусный антиген можно иммобилизовывать на твердой подложке и затем приводить в контакт с образцом, в котором, как предполагают, содержится антитело, затем определяя образование комплекса антиген-антитело. Клеточный иммунный ответ, как правило, является результатом возникновения цитотоксических T-лимфоцитов, и его можно охарактеризовывать посредством измерения конкретных субпопуляций T-клеток, таких как CD3+ T-клетки, CD4+ T-клетки, CD8+ T-клетки и CD4+CD8+ T-клетки, с использованием способов, таких как проточная цитометрия. В кратком изложении, T-клетки окрашивают с использованием антител против конкретных поверхностных маркеров, сортируют и подсчитывают как разные субпопуляции по наличию поверхностных маркеров. Мукозальный иммунный ответ, как правило, является результатом возникновения секреторных IgA на поверхностях слизистых оболочек.

В определенных вариантах осуществления вакцина PRRSV и вакцина против второго вируса свиней при введении в виде комбинированной вакцинной композиции не снижают существенно продукцию антител у хозяина в ответ на вакцину против PRRSV и/или вакцину против второго вируса свиней.

В определенных вариантах осуществления вакцина против PRRSV и вакцина против второго вируса свиней при введении в виде комбинированной вакцинной композиции не снижают существенно уровни CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток, CD8+ T-клеток и/или CD4+CD8+ T-клеток у хозяина в ответ на вакцину против PRRSV и/или вакцину против второго вируса свиней.

В определенных вариантах осуществления вакцина против PRRSV содержит аттенуированный PRRSV. Как применяют в настоящем описании, "аттенуированный PRRSV" относится к PRRSV, который может инфицировать хозяина, но не вызывает репродуктивный и респираторный синдром свиней или вызывает меньше симптомов и/или более слабые симптомы. Аттенуированный PRRSV включает живой аттенуированный PRRSV и его инактивированные продукты. Как применяют в настоящем описании, "репродуктивный и респираторный синдром свиней" (PRRS) относится к серии физиологических и патологических симптомов после инфекции природным PRRSV. Симптомы включают, в качестве неограничивающих примеров, помимо прочего, лихорадку, сонливость, потерю аппетита, утомляемость, одышку, кашель, репродуктивное нарушение у свиноматок и медленный рост или гибель поросят.

В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV содержит нуклеотид Nsp2, кодируемый последовательностью ДНК, в которой по сравнению с SEQ ID NO: 4 отсутствует нуклеотидный фрагмент, содержащий по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, где фрагмент является по меньшей мере приблизительно на 80% гомологичным части SEQ ID NO: 8 той же длины.

Как применяют в настоящем описании, термин "кодируемый последовательностью ДНК" относится к последовательности ДНК, которая может транскрибироваться в соответствующую последовательность РНК. Одноцепочечный РНК-вирус, такой как PRRSV и CSFV, имеет геном, состоящий из одной цепи молекулы РНК, который может кодироваться молекулой ДНК на основании уотсон-криковского спаривания оснований. При транскрипции из такой молекулы ДНК может продуцироваться молекула РНК с (+)-цепью, идентичная последовательности РНК в геноме вируса.

Хотя и не желая быть связанными какой-либо теорией, предполагают, что отсутствие такого фрагмента нуклеотида в последовательности Nsp2 в части, гомологичной SEQ ID NO: 8, может снижать вирулентность, а также потенциал иммуноингибирования PRRSV, например, посредством продукции нефункционального или менее функционального белка Nsp2, и/или отрицательно влияя на экспрессию или функцию других белков PRRSV и/или отрицательно влияя на жизненный цикл PRRSV.

Отсутствующий фрагмент может иметь любую подходящую длину, при условии, что он может снижать вирулентность, а также иммуноингибирование PRRSV, до степени, достаточной для устранения вирулентности PRRSV и для индукции протективного иммунитета против PRRSV без нарушения иммунитета против других коинфицирующих вирусов или вакцин. Например, отсутствующий фрагмент ДНК может содержать, по меньшей мере 100, по меньшей мере 120, по меньшей мере 150, по меньшей мере 180, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290, по меньшей мере 300, по меньшей мере 310, по меньшей мере 320, по меньшей мере 330, по меньшей мере 340, по меньшей мере 350 или по меньшей мере 360 смежных нуклеотидов. Длина отсутствующего нуклеотидного фрагмента также может находиться в диапазоне, определяемом по любому из двух указанных выше значений, как если бы эти диапазоны точно указывали в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления отсутствующий нуклеотидный фрагмент содержит приблизительно 300 смежных нуклеотидов, приблизительно 310, приблизительно 320, приблизительно 330, приблизительно 340, приблизительно 350 или приблизительно 360 смежных нуклеотидов.

Специалисты в этой области легко могут получать рекомбинантные вирусы, имеющие различные делеции в нуклеотидной последовательности Nsp2 в части, гомологичной SEQ ID NO: 8, и тестировать эти рекомбинантные вирусы на их жизнеспособность, вирулентность и потенциал иммуноингибирования с использованием способов, известных в этой области, и способов, представленных в настоящем описании. Например, что касается продукции и тестирования вирулентности рекомбинантного PRRSV, содержащего делеции в Nsp2, способы описывают в Kim, Dal-Young et al, Virus Genes, 38: 118-128 (2009). Что касается тестирования иммуноингибирования рекомбинантного PRRSV, способы описывают в Suradhat, S. et al, Vaccine, 24: 2634-3642 (2006), а также в примерах в настоящем описании. С помощью делеции фрагмента в части, гомологичной SEQ ID NO: 8 (например, делеции с 1-го нуклеотида по 50-й нуклеотид в этой части, со 2-го по 60-й нуклеотид, с 5-го по 100-й нуклеотид и т.д.), можно получать рекомбинантный PRRSV, содержащий интересующий нуклеотид Nsp2, и дополнительно тестировать жизнеспособные рекомбинантные штаммы PRRSV на их способность к образованию цитопатических бляшек, таким образом, что можно выбирать аттенуированные рекомбинантные штаммы PRRSV и дополнительно тестировать на свиньях их потенциал иммуноингибирования в отношении вакцины против второго вируса свиней.

В определенных вариантах осуществления отсутствующий фрагмент ДНК является по меньшей мере приблизительно на 81%, приблизительно на 82%, приблизительно на 83%, приблизительно на 84%, приблизительно на 85%, приблизительно на 86%, приблизительно на 87%, приблизительно на 88%, приблизительно на 89%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или на 100% гомологичным части SEQ ID NO: 8 той же длины. В определенных вариантах осуществления отсутствующий фрагмент ДНК содержит SEQ ID NO: 8. В определенных вариантах осуществления отсутствующий фрагмент ДНК является SEQ ID NO: 8 (см. фигуру 1).

В определенных вариантах осуществления аттенуированный PRRSV содержит нуклеотидную последовательность Nsp2, кодирующую последовательность белка Nsp2,