Способы повышения урожайности резистентных к 2,4-d сельскохозяйственных культур

Способы повышения урожайности резистентных к 2,4-d сельскохозяйственных культур

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/656546, зарегистрированной 7 июня 2012 года, описание которой, таким образом, явно включено в качестве ссылки в полном объеме.

ВКЛЮЧЕНИЕ МАТЕРИАЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ, В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ

Включенным в полном объеме в качестве ссылки является машинно-читаемый список последовательностей, поданный одновременно с заявкой и определенный следующим образом: один файл размером 11342 байт ASCII (текстовый) под названием "72747_ST25.txt", созданный 13 мая 2013 года.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сорняки могут быстро истощать содержание в почве полезных питательных веществ, необходимых для сельскохозяйственных культур и других желаемых растений. Существует множество типов гербицидов, используемых в настоящее время для контроля сорняков. Одним из крайне популярных гербицидов является глифосат.

Разработаны сельскохозяйственные культуры, такие как кукуруза, соя, канола, хлопок, сахарная свекла, пшеница, газонная трава и рис, резистентные к глифосату. Таким образом, поля с активно растущей кукурузой, резистентной к глифосату, например, можно опрыскивать для контроля сорняков без значительного повреждения растений кукурузы.

С внедрением генетически сконструированных, устойчивых к глифосату сельскохозяйственных культур (GTC) в середине 1990-х годов сельхозпроизводители получили простой, удобный, гибкий и недорогой инструмент для контроля широкого спектра широколиственных и травянистых сорняков, не имеющий аналогов в сельском хозяйстве. Таким образом, производители быстро приняли GTC и во многих случаях отказались от многих из лучших общепринятых агрономических приемов, таких как севооборот, севооборот в комбинации с действием гербицидов, использование баковой смеси, внедрение механического контроля вместе с химическим и культуральным контролем сорняков. В настоящее время толерантные к глифосату соя, хлопок, кукуруза и канола являются коммерчески доступными в США и в других областях Западного полушария. Все больше GTC (например, пшеница, рис, сахарная свекла, газонная трава, и т.д.) готовы для внедрения, ожидая принятия на глобальном рынке. Многие другие резистентные к глифосату виды находятся в стадии от эксперимента до разработки (например, люцерна, сахарный тростник, подсолнечник, свекла, горох, морковь, огурец, латук, лук, клубника, помидор и табак; лесохозяйственные виды, такие как тополь и ликвидамбар; и садоводческие виды, такие как бархатцы, петуния и бегония; см. веб-сайт "isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm, 2005"). Кроме того, стоимость глифосата за последние годы значительно снизилась до такой точки, что несколько программ общепринятого контроля сорняков могут эффективно конкурировать по цене и действию с системами глифосат-GTC.

Глифосат успешно используют для уничтожения сорняков и в других несельскохозяйственных областях для тотальной борьбы с сорняками в течение более 15 лет. Во многих случаях, как и с GTC, глифосат используют 1-3 раз в год в течение 3, 5, 10, до 15 лет подряд. Эти обстоятельства привели к избыточному доверию к глифосату и технологии GTC и тяжелому давлению отбора по отношению к местным видам сорняков в пользу растений, являющихся от природы более устойчивыми к глифосату или у которых развился механизм резистентности к гербицидной активности глифосата.

Обширное использование программ контроля сорняков только с помощью глифосата приводит к селекции резистентных к глифосату сорняков и является селективным для размножения видов сорняков, от природы более устойчивых к глифосату, чем большинство видов-мишеней (т.е. сдвиги в популяциях сорняков). (Ng et al., 2003; Simarmata et al, 2003; Lorraine-Colwill et al, 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al, 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002). Хотя глифосат широко используют по всему миру в течение более 15 лет, сообщают, что только у небольшого количества сорняков развилась резистентность к глифосату (Heap, 2005); однако, большинство из них идентифицировали в последние 3-5 лет. Резистентные сорняки включают травянистые и широколиственные виды - Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis и Plantago lanceolata. Кроме того, сорняки, ранее не представлявшие собой агрономическую проблему до широкого использования GTC, теперь становятся все более распространенными и трудноконтролируемыми в случае GTC, занимающих >80% акров хлопка и сои в США и >20% акров кукурузы в США (Gianessi, 2005). Эти сдвиги в популяциях сорняков преимущественно (но не исключительно) происходят у трудноконтролируемых широколиственных сорняков. Некоторые примеры включают виды Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum и Commelina.

В областях, где сельхозпроизводители сталкиваются с резистентными к глифосату сорняками или сдвигами в сторону более трудноконтролируемых видов сорняков, сельхозпроизводители могут компенсировать недостаточность действия глифосата использованием его в баковой смеси или заменой другими гербицидами, с помощью которых будут контролировать упущенные сорняки. Одним из популярных и эффективных средств для использования в баковой смеси для контроля широколиственных диких растений во многих случаях является 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D). 2,4-D используют в агрономии и в несельскохозяйственных условиях широкого спектра для контроля широколиственных сорняков в течение более 60 лет. Сообщают об отдельных случаях устойчивых видов, но 2,4-D остается одним из наиболее широко используемых гербицидов по всему миру. Ограничением для дальнейшего использования 2,4-D является то, что его селективность в случае двудольных сельскохозяйственных культур, таких как соя или хлопок, очень плоха, и, таким образом, 2,4-D, как правило, не используют на (и, как правило, не вблизи) чувствительных двудольных сельскохозяйственных культур. Кроме того, использование 2,4-D в случае травянистых сельскохозяйственных культур в некоторой степени ограничено природой повреждения сельскохозяйственных культур, которое может происходить. 2,4-D в комбинации с глифосатом используют для обеспечения более надежной burndown обработки перед посадкой сои и хлопка с нулевой обработкой почвы; однако, по причине чувствительности этих двудольных видов к 2,4-D, эту burndown обработку необходимо проводить по меньшей мере за 14-30 дней до посадки (Agriliance, 2003).

2,4-D принадлежит к феноксикислотному классу гербицидов, как и MCPA. 2,4-D используют в случае многих однодольных сельскохозяйственных культур (таких как кукуруза, пшеница и рис) для селективного контроля широколиственных сорняков без существенного повреждения желаемых сельскохозяйственных культур. 2,4-D является синтетическим производным ауксина, действующим, нарушая регуляцию нормального клеточно-гормонального гомеостаза и препятствуя сбалансированному, контролируемому росту; однако, точный механизм действия все еще неизвестен. Триклопир и флуроксипир являются гербицидами на основе пиридилоксиуксусной кислоты, механизм действия которых также является таким, как у синтетического ауксина.

Эти гербициды имеют различные уровни селективности в отношении конкретных растений (например, двудольные растения являются более чувствительными, чем травянистые растения). Различия метаболизма у различных растений являются одним из объяснений разных уровней селективности. В основном, растения медленно метаболизируют 2,4-D, таким образом, разный ответ растений на 2,4-D, более вероятно, можно объяснить различной активностью в сайтах-мишенях (WSSA, 2002). Метаболизм 2,4-D у растений, как правило, происходит посредством двухфазного механизма, как правило, гидроксилирования с последующей конъюгацией с аминокислотами или глюкозой (WSSA, 2002).

С течением времени в популяциях микроорганизмов появился альтернативный и эффективный путь деградации этого конкретного ксенобиотика, приводящий к полной минерализации 2,4-D. Последующие нанесения гербицида приводят к селекции микроорганизмов, которые могут использовать гербицид в качестве источника углерода для роста, обеспечивая им конкурентное преимущество в почве. По этой причине составляемый в настоящее время 2,4-D имеет относительно короткое время полужизни в почве, и не обнаруживали значительных переходящих эффектов в отношении последующих сельскохозяйственных культур. Это повышает применимость 2,4-D в качестве гербицида.

Одним из организмов, подвергаемых обширным исследованиям на предмет его способности деградировать 2,4-D, является Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). Кодирующим геном на первом ферментативном этапе цикла минерализации, является tfdA. См. патент США № 6153401 и GENBANK рег. № M16730. TfdA катализирует преобразование кислоты 2,4-D в дихлорфенол (DCP) через реакцию α-кетоглутарат-зависимой диоксигеназы (Smejkal et al., 2001). DCP обладает невысокой гербицидной активностью по сравнению с 2,4-D. TfdA используют в трансгенных растениях для придания резистентности к 2,4-D двудольным растениям (например, хлопку и табаку), в норме чувствительным к 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993) и патент США № 5608147).

Большое количество генов tfdA-типа, кодирующих белки, способные деградировать 2,4-D, идентифицированы в окружающей среде и депонированы в базе данных Genbank. Многие гомологи схожи с tfdA (>85% идентичности аминокислот) и обладают схожими с tfdA ферментативными свойствами. Однако, существует ряд гомологов, имеющих значительно меньшую идентичность по отношению к tfdA (25-50%), но имеющие характерные остатки, ассоциированные с α-кетоглутарат-зависимыми Fe⁺²-диоксигеназами. Таким образом, не ясны субстратные специфичности этих дивергентных диоксигеназ.

Одним уникальным примером низкой гомологии по отношению к tfdA (31% идентичности аминокислот) является sdpA из Delftia acidovorans (Kohler et al., 1999, Westendorf et al., 2002, Westendorf et al., 2003). Показано, что этот фермент катализирует первый этап в минерализации (S)-дихлорпропа (и других (S)-феноксипропионовых кислот), а также 2,4-D (феноксиуксусной кислоты) (Westendorf et al., 2003). До настоящего времени не сообщали об использовании этого гена в трансформации растений.

Разработка новых технологий устойчивых к гербицидам сельскохозяйственных культур (HTC) имеет ограниченный успех, главным образом, по причине эффективности, низкой стоимости и удобства GTC. Таким образом, среди производителей имеет место очень высокий уровень внедрения GTC. Это приводит к низкой мотивации для разработки новых технологий HTC.

Арилоксиалканоатные химические субструктуры являются распространенными веществами во многих коммерческих гербицидах, включая феноксиацетатауксины (такие как 2,4-D и дихлорпроп), пиридилоксиацетатауксины (такие как флуроксипир и триклопир), арилоксифеноксипропионатные (AOPP) ингибиторы ацетил-кофермент A карбоксилазы (ACCase) (такие как галоксифоп, квизалофоп, и диклофоп) и 5-замещенные феноксиацетатные ингибиторы протопорфириногеноксидазы IX (такие как пирафлуфен и флумиклорак). Однако эти классы гербицидов являются совершенно разными, и в современной литературе нет доказательств общих путей деградации среди этих классов химических веществ. Недавно описан мультифункциональный фермент для деградации гербицидов, охватывающих множество типов действия (PCT US/2005/014737; зарегистрированной 2 мая 2005 года).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам повышения высоты растений и/или урожайности сельскохозяйственных культур, резистентных к гербициду 2,4-D, посредством обработки растений 2,4-D при нормах внесения, не являющихся вредными для растений. В частности, изобретение относится к способу с использованием обработки 2,4-D для повышения урожайности сельскохозяйственных культур, экспрессирующих ген AAD-12 для резистентности к 2,4-D. Это изобретение дополнительно относится к применению 2,4-D для улучшения урожайности сельскохозяйственных культур, являющихся резистентными к 2,4-D. Предоставляемый способ представляет конкретный интерес для обработки сельскохозяйственных растений, включая кукурузу, сою, озимый и яровой рапс, (канолу), сахарную свеклу, пшеницу, подсолнечник, ячмень и рис.

В некоторых вариантах осуществления резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры являются трансгенными сельскохозяйственными культурами, трансформированными арилоксиалканоатдиоксигеназой (AAD). В дополнительном варианте осуществления арилоксиалканоатдиоксигеназа (AAD) является AAD-1 или AAD-12. AAD-1 ранее описана в патенте США 2009/0093366, а AAD-12 ранее описана в WO 2007/053482, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок.

Повышающий урожайность эффект обработки 2,4-D можно наблюдать при нормах внесения от 25 г кэ/га до 5000 г кэ/га, или от 100 г кэ/га до 2500 г кэ/га, или, в частности, от 1000 г кэ/га до 2000 г кэ/га. В одном из вариантов осуществления используют от 1000 г кэ/га до 1500 г кэ/га 2,4-D. В другом варианте осуществления используют от 2000 г кэ/га до 2500 г кэ/га. Кроме того, этот повышающий урожайность эффект обработки 2,4-D является особенно выраженным при нанесении 2,4-D в фазу от 2 до 8 листьев сельскохозяйственных культур до цветения. Однако необходимая норма внесения и/или фаза роста сельскохозяйственной культуры варьируется в зависимости от растений, их роста и климатических условий.

Термин "повышение" урожайности означает, что урожайность растения повышается на 50% или более. В одном из вариантов осуществления повышение урожайности составляет по меньшей мере 10%. В другом варианте осуществления повышение урожайности составляет по меньшей мере 20%. В другом варианте осуществления повышение урожайности составляет от 10% до 60%. В другом варианте осуществления повышение урожайности составляет от 20% до 50%. В другом варианте осуществления повышение урожайности является статистически значимым. Активность 2,4-D, усиливающую рост, в отношении резистентных к 2,4-D сельскохозяйственных культур можно измерять в полевых испытаниях или вегетационных опытах. О гербициде, имеющем различный механизм действия, как правило, известно, оказывает ли он неблагоприятное воздействие на урожайность, или не влияет на урожайность.

Один из аспектов относится к способу повышения урожайности резистентных к 2,4-D сельскохозяйственных культур, включающий обработку растений стимулирующим количеством гербицида, содержащего остаток арилоксиалканоата.

В одном из вариантов осуществления резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры являются трансгенными растениями, трансформированными с использованием арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD). В дополнительном варианте осуществления арилоксиалканоатдиоксигеназа (AAD) является AAD-1 или AAD-12. В другом варианте осуществления гербицид, содержащий остаток арилоксиалканоата, является фенокси-гербицидом или феноксиуксусным гербицидом. В дополнительном варианте осуществления гербицид, содержащий остаток арилоксиалканоата, является 2,4-D. В дополнительном варианте осуществления 2,4-D содержит 2,4-D-холин или 2,4-D-диметиламин (DMA).

В одном из вариантов осуществления трансгенные растения, трансформированные с использованием арилоксиалканоатдиоксигеназы, (AAD) выбраны из хлопка, сои и канолы. В другом варианте осуществления обработку осуществляют по меньшей мере один раз при норме внесения 2,4-D, используемой также для контроля сорняков. В другом варианте осуществления обработку осуществляют два раза при норме внесения 2,4-D, используемой также для контроля сорняков. В дополнительном варианте осуществления 2,4-D наносят в фазы роста V3 и R2 сои с устойчивостью к 2,4-D. В другом варианте осуществления обработку осуществляют по меньшей мере три раза при норме внесения 2,4-D, используемой также для контроля сорняков. В другом варианте осуществления гербицид, содержащий остаток арилоксиалканоата, достигает резистентных к 2,4-D сельскохозяйственных культур посредством поглощения корнями.

В другом варианте осуществления для контроля сорняков резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры также обрабатывают гербицидом, иным, чем 2,4-D. В дополнительном варианте осуществления гербицид, иной, чем 2,4-D, является фосфорным гербицидом или арилоксифеноксипропионовым гербицидом. В дополнительном варианте осуществления фосфорный гербицид включает глифосат, глуфосинат, их производные или их комбинации. В дополнительном варианте осуществления фосфорный гербицид находится в форме соли аммония, соли изопропиламмония, соли изопропиламина или соли калия. В другом варианте осуществления фосфорный гербицид достигает резистентных к 2,4-D сельскохозяйственных культур посредством поглощения корнями. В другом варианте осуществления арилоксифеноксипропионовый гербицид включает хлоразифоп, феноксапроп, флуазифоп, галоксифоп, квизалофоп, их производные или их комбинации. В дополнительном варианте осуществления арилоксифеноксипропионовый гербицид достигает резистентных к 2,4-D сельскохозяйственных культур посредством поглощения корнями.

В одном из вариантов осуществления резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры обрабатывают по меньшей мере один раз при дозе от 25 г кэ/га до 5000 г кэ/га 2,4-D. В другом варианте осуществления резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры обрабатывают по меньшей мере один раз при дозе от 100 г кэ/га до 2000 г кэ/га 2,4-D. В другом варианте осуществления резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры обрабатывают по меньшей мере один раз при дозе от 100 г кэ/га до 2500 г кэ/га 2,4-D. В другом варианте осуществления резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры обрабатывают по меньшей мере один раз при дозе от 1000 г кэ/га до 2000 г кэ/га 2,4-D. В дополнительном варианте осуществления 2,4-D включает 2,4-D-холин или 2,4-D-диметиламин (DMA).

Один из вариантов осуществления относится к способу повышения урожайности резистентных к 2,4-D сельскохозяйственных культур. Способ включает

(a) трансформацию растительных клеток с использованием молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую арилоксиалканоатдиоксигеназу (AAD);

(b) селекцию трансформированных клеток;

(c) регенерацию растений из трансформированных клеток; и

(d) обработку растений стимулирующим количеством гербицида, содержащего остаток арилоксиалканоата.

В одном из вариантов осуществления арилоксиалканоатдиоксигеназа (AAD) является AAD-1 или AAD-12. В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит селективный маркер, не являющийся арилоксиалканоатдиоксигеназой (AAD). В дополнительном варианте осуществления или альтернативном варианте осуществления селективный маркер является геном фосфинотрицинацетилтрансферазы (pat) или геном резистентности к биалафосу (bar). В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты оптимизирована для растений.

Другой аспект относится к применению гербицида, содержащего остаток арилоксиалканоата, в производстве трансгенных растений с резистентностью к 2,4-D с повышенной урожайностью по сравнению с их нетрансгенными родительскими растениями. В одном из вариантов осуществления гербицид, содержащий остаток арилоксиалканоата, является 2,4-D. В дополнительном варианте осуществления 2,4-D наносят по меньшей мере один раз при дозе от 25 г кэ/га до 5000 г кэ/га 2,4-D. В другом варианте осуществления 2,4-D наносят по меньшей мере один раз при дозе от 100 г кэ/га до 2000 г кэ/га 2,4-D. В другом варианте осуществления 2,4-D наносят по меньшей мере один раз при дозе от 100 г кэ/га до 2500 г кэ/га 2,4-D. В другом варианте осуществления 2,4-D наносят по меньшей мере один раз при дозе от 1000 г кэ/га до 2000 г кэ/га 2,4-D. В дополнительном варианте осуществления 2,4-D включает 2,4-D-холин или 2,4-D-диметиламин (DMA). В дополнительном варианте осуществления резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры обрабатывают 2,4-D по меньшей мере два раза перед цветением. В другом варианте осуществления резистентные к 2,4-D сельскохозяйственные культуры являются трансгенными растениями, трансформированными с использованием арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD). В дополнительном варианте осуществления арилоксиалканоатдиоксигеназа (AAD) является AAD-1 или AAD-12.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

На фиг. 1 представлена общая химическая реакция, катализируемая ферментами AAD-12 по настоящему изобретению. На фиг. 2 представлена типичная карта плазмиды pDAB4468. На фиг. 3 представлена типичная карта плазмиды pDAS1740.

SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность AAD-12 из Delftia acidovorans.

SEQ ID NO: 2 представляет собой транслированную белковую последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 представляет собой оптимизированную для растений нуклеотидную последовательность AAD-12 (v1).

SEQ ID NO: 4 представляет собой транслированную белковую последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 представляет собой оптимизированную для E. coli нуклеотидную последовательность AAD-12 (v2).

SEQ ID NO: 6 представляет собой последовательность прямого праймера M13.

SEQ ID NO: 7 представляет собой последовательность обратного праймера M13.

SEQ ID NO: 8 представляет собой последовательность прямого праймера PTU AAD-12 (v1).

SEQ ID NO: 9 представляет собой последовательность обратного праймера PTU AAD-12 (v1).

SEQ ID NO: 10 представляет собой последовательность прямого праймера для ПЦР кодирующей области AAD-12 (v1).

SEQ ID NO: 11 представляет собой последовательность обратного праймера для ПЦР кодирующей области AAD-12 (v1).

SEQ ID NO: 12 представляет собой последовательность праймера "sdpacodF" AAD-12 (v1).

SEQ ID NO: 13 представляет собой последовательность праймера "sdpacodR" AAD-12 (v1).

SEQ ID NO: 14 представляет собой последовательность праймера "Nco1 of Brady".

SEQ ID NO: 15 представляет собой последовательность праймера "Sac1 of Brady".

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как применяют в настоящем описании, фраза "трансформированный" или "трансформация" относится к встраиванию ДНК в клетку. Фразы "трансформант" или "трансгенный" относятся к растительным клеткам, растениям и т.п., трансформированным или подвергнутым трансформации. Встраиваемая ДНК, как правило, находится в форме вектора, содержащего вставку ДНК.

Как применяют в настоящем описании, фраза "селективный маркер" или "ген селективного маркера" относится к гену, необязательно, используемому в трансформации растений, например, для защиты растительных клеток от селективного средства или обеспечения резистентности/устойчивости к селективному средству. Только те клетки или растения, которые получали функциональный селективный маркер, способны делиться или расти в условиях наличия селективного средства. Примеры селективных средств могут включать, например, антибиотики, включая спектиномицин, неомицин, канамицин, паромомицин, гентамицин и гигромицин. Эти селективные маркеры включают ген неомицинфосфотрансферазы (npt II), экспрессирующий фермент, придающий резистентность к антибиотику канамицину, и гены для родственных антибиотиков неомицина, паромомицина, гентамицина и G418, или ген гигромицинфосфотрансфераза (hpt), экспрессирующий фермент, придающий резистентность к гигромицину. Другие гены селективных маркеров могут включать гены, кодирующие резистентность к гербициду, включая Bar (резистентность к BASTA® (глуфосинат аммония) или фосфинотрицину (PPT)), ацетолактатсинтазу (ALS, резистентность к ингибиторам, таким как сульфонилкарбамиды (SU), имидазолиноны (IMI), триазолопиримидины (TP), пиримидинилоксибензоаты (POB) и сульфониламинокарбонилтриазолиноны, предотвращающие первый этап синтеза аминокислот с разветвленной цепью, глифосату, 2,4-D и резистентность или чувствительность к металлам. Фраза "маркер-позитивный" относится к растениям, трансформированным с включением гена селективного маркера.

В выбранный экспрессирующий вектор можно встраивать различные селективные или детектируемые маркеры, делая возможной идентификацию и селекцию трансформированных растений, или трансформантов. Доступно множество способов подтверждения экспрессии селективных маркеров в трансформированных растениях, включая, например, секвенирование ДНК и ПЦР (полимеразную цепную реакцию), Саузерн-блоттинг, РНК-блоттинг, иммунологические способы определения белка, экспрессирующегося с вектора, например, преципитированного белка, белков репортерных генов - к фосфинотрицину, или других белков, таких как β-глюкуронидаза (GUS), люцифераза, зеленый флуоресцентный белок (GFP), DsRed, β-галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT), щелочная фосфатаза и т.п. (См. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

Гены селективных маркеров используют для селекции трансформированных клеток или тканей. Гены селективных маркеров включают гены, кодирующие резистентность к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (NEO) и гигромицинфосфотрансферазу (HPT), а также гены, придающие резистентность к гербицидным соединениям. Гены резистентности к гербицидам, как правило, кодируют модифицированный белок-мишень, нечувствительный к гербициду, или фермент, деградирующий или детоксифицирующий гербицид в растении до того, как он может подействовать. См. DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol., 91:691-704; Fromm et al. (1990) 8:833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) 2:603-618). Например, резистентности к глифосату или сульфонилкарбамидным гербицидам достигали с использованием генов, кодирующих мутантные ферменты-мишени 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтетазу (EPSPS) и ацетолактатсинтазу (ALS). Резистентности к глуфосинату аммония, бромоксинилу и 2,4-дихлорфеноксиацетату (2,4-D) достигали с использованием бактериальных генов, кодирующих фосфинотрицинацетилтрансферазу, нитрилазу или 2,4-дихлорфеноксиацетатмонооксигеназу, детоксифицирующие соответствующие гербициды. Ферменты/гены резистентности к 2,4-D ранее описаны в патенте США № 2009/0093366 и WO 2007/053482, содержание которых, таким образом, включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

Другие гербициды могут ингибировать конус нарастания или меристему, включая имидазолинон или сульфонилкарбамид. Примеры генов этой категории кодируют мутантные ферменты ALS и AHAS, как описано, например, в Lee et al., EMBO J. 7: 1241 (1988); и Miki et al., Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990), соответственно.

Гены резистентности к глифосату включают мутантные гены 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтетазы (EPSP) (посредством встраивания рекомбинантных нуклеиновых кислот и/или различных форм мутагенеза in vivo нативных генов EPSP), гены aroA и гены глифосатацетилтрансферазы (GAT), соответственно. Гены резистентности к другим фосфоновым соединениям включают гены глуфосинат (гены фосфинотрицинацетилтрансфераы (PAT) из видов Streptomyces, включая Streptomyces hygroscopicus и Streptomyces viridichromogenes) и пиридинокси- или феноксипроионовые кислоты и циклогексоны (гены, кодирующие ингибитор ACCase). См., например, патент США № 4940835 Shah, et al. и патент США № 6248876 Barry et al., в которых описывают нуклеотидные последовательности форм EPSP, которые могут придавать растению резистентность к глифосату. Молекулу ДНК, кодирующую мутантный ген aroA, можно получать в ATCC под регистрационным номером 39256, и нуклеотидная последовательность мутантного гена описана в патенте США № 4769061 Comai, европейской патентной заявке № 0 333 033 Kumada et al. и патенте США № 4975374 Goodman et al., в которых описывают нуклеотидные последовательности генов глутаминсинтетазы, придающих резистентность к гербицидам, таким как L-фосфинотрицин. Нуклеотидная последовательность гена PAT представлена в европейской патентной заявке № 0 242 246 Leemans et al. Кроме того, в DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989) описывают получение трансгенных растений, экспрессирующих химерные гены bar, кодирующие активность PAT. Примерами генов, придающих резистентность к феноксипропионовым кислотам и циклогексонам, включая сетоксидим и галоксифоп, являются гены Acc1-S1, Acc1-S2 и Acc1-S3, описываемые в Marshall et al., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992). Гены GAT, способные придавать резистентность к глифосату, описывают в WO 2005012515 Castle et al. Гены, придающие резистентность к гербицидам 2,4-D, фоп и пиридилоксиауксину, описывают в WO 2005107437 и патентной заявке США с серийным № 11/587893.

Другие гербициды могут ингибировать фотосинтез, включая триазин (гены psbA и 1s+) или бензонитрил (ген нитрилазы). В Przibila et al., Plant Cell 3: 169 (1991) описывают трансформацию Chlamydomonas с использованием плазмид, кодирующих мутантные гены psbA. Нуклеотидные последовательности генов нитрилазы описывают в патенте США № 4810648 Stalker, и молекулы ДНК, содержащие эти гены, доступны в ATCC под регистрационными №№ 53435, 67441 и 67442. Клонирование и экспрессию ДНК, кодирующей глутатион-S-трансферазу, описывают в Hayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992).

В целях по настоящему изобретению, гены селективных маркеров включают, в качестве неограничивающих примеров, гены, кодирующие: неомицинфосфотрансферазу II (Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4: 1-25); цианамидгидратазу (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264); аспартаткиназу; дигидродипиколинатсинтетазу (Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718); триптофандекарбоксилазу (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912); дигидродипиколинатсинтетазу и десенсибилизированную аспартаткиназу (Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718); ген bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol., 100: 1503-1507 и Meagher et al. (1996) and Crop Sci., 36: 1367); триптофандекарбоксилазу (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912); неомицинфосфотрансферазу (NEO) (Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327; гигромицинфосфотрансферазу (HPT или HYG) (Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol., 6: 1074); дигидрофолатредуктазу (DHFR) (Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552); фосфинотрицинацетилтрансферазу (DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513); дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); синтетазу ацетогидроксикислот (Anderson et al., патент США № 4761373; Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-енолпирувилшикиматфосфатсинтетазу (aroA) (Comai et al. (1985) Nature 317:741); галоарилнитрилазу (Stalker et al., опубликованная заявка PCT WO87/04181); ацетил-кофермент A карбоксилазу (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92: 1220); дигидроптероатсинтетазу (sul I) (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 127); и полипептид фотосистемы II массой 32 кДа (psbA) (Hirschberg et al. (1983) Science, 222: 1346).

Также включены гены, кодирующие резистентность к: хлорамфениколу (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J., 2:987-992); метотрексату (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature, 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991); гигромицину (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5: 103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science, 108:219-227 и Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820); стрептомицину (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91); спектиномицину (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res., 5: 131-137); блеомицину (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol., 7: 171-176); сульфонамиду (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio., 15: 127-136); бромоксинилу (Stalker et al. (1988) Science, 242:419-423); 2,4-D (Streber et al. (1989) Bio/Technology, 7:811-816); глифосату (Shaw et al. (1986) Science, 233:478-481); и фосфинотрицину (DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518). Все ссылки, процитированные в описании, таким образом, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме, если не указано иначе.

Представленный выше список генов селективных маркеров и репортерных генов не является ограничивающим. Любой репортерный или ген селективного маркера находятся в объеме настоящего изобретения. При необходимости, такие гены можно секвенировать известными в этой области способами.

Репортерные гены и гены селективных маркеров синтезируют для оптимальной экспрессии в растениях. Т.е. кодирующую последовательность гена модифицируют для повышения экспрессии в растениях. Синтетический маркерный ген конструируют для экспрессии в растениях на высоком уровне, приводящей к более высокой эффективности трансформации. В этой области доступны способы синтетической оптимизации генов. Фактически, несколько генов оптимизируют для повышения экспрессии продукта гена в растениях.

Последовательность маркерного гена можно оптимизировать для экспрессии в конкретном виде растений или, альтернативно, ее можно модифицировать для оптимальной экспрессии в семействах растений. Предпочтительные для растения кодоны можно определять из кодонов, встречающихся с наибольшей частотой в белках, экспрессирующихся в наибольших количествах в конкретном интересующем виде растений. См., например, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328; и Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498; патент США № 5380831; и патент США № 5436391, включенные в настоящее описание в качестве ссылок. Таким образом, нуклеотидные последовательности можно оптимизировать для экспрессии в любом растении. Установлено, что можно оптимизировать или синтезировать всю последовательность гена или любую ее часть. То есть, также можно использовать полностью оптимизированные или частично оптимизированные последовательности.

Кроме того, разработано несколько стратегий трансформации с использованием системы опосредованной Agrobacterium трансформации. Например, бинарная векторная стратегия основана на двухплазмидной системе, где Т-ДНК находится в иной плазмиде, чем плазмида Ti. В стратегии коинтеграции небольшую часть Т-ДНК помещают в тот же вектор, что и чужеродный ген, который затем рекомбинирует с плазмидой Ti.

Как применяют в настоящем описании, фраза "растение" включает двудольные растения и однодольные растения. Примеры двудольных растений включают табак, арабидопсис, сою, помидор, папайю, канолу, подсолнечник, хлопок, люцерну, картофель, виноград, голубиный горох, горох, декоративную капусту, нут, сахарную свеклу, рапс, арбуз, дыню, перец, арахис, тыкву, редис, шпинат, гигантскую тыкву, брокколи, капусту, морковь, цветную капусту, сельдерей, китайскую капусту, огурец, баклажан и латук. Примеры однодольных растений включают кукурузу, рис, пшеницу, сахарный тростник, ячмень, рожь, сорго, орхидею, бамбук, банан, рогоз, лилию, овес, лук, просо и тритикале.

Предметная разработка гена резистентности к 2,4-D и последующих резистентных сельскохозяйственных культур обеспечивает исключительные средства контроля широколиственных, резистентных к глифосату (или высокоустойчивых и подвергнутых сдвигу) видов сорняков для использования в сельскохозяйственных культурах. 2,4-D является относительно недорогим и надежным гербицидом широкого спектра действия против широколиственных растений, который будет приносить исключительную пользу сельхозпроизводителям, если можно обеспечивать боле высокую устойчивость сельскохозяйственных культур в равной степени в случае двудольных и однодольных сельскохозяйственных культур. Устойчивые к 2,4-D трансгенные двудольные сельскохозяйственные культуры также будут иметь большую гибкость по срокам и норме внесения. Дополнительной пользой указанного признака устойчивости к гербициду 2,4-D является предотвращение повреждения в норме восприимчивых сельскохозяйственных культур при дрейфе 2,4-D, испарении, преобразовании (или другом явлении перемещения за пределы территории), неправильном применении, вандализме и т.п. Дополнительным преимуществом гена AAD-12 является то, что, в отличие от всех гомологов tfdA, охарактеризованных к настоящему времени, AAD-12 способна деградировать пиридилоксиацетатные ауксины (например, триклопир, флуроксипир) в дополнение к ахиральным феноксиауксинам (например, 2,4-D, MCPA, 4-хлорфеноксиуксусной кислоте). См. таблицу 1. Общая картина химических реакций, катализируемых указанным ферментом AAD-12, представлена на фиг. 1. (Добавление O.sub.2 является стереоспецифичным; распад промежуточного соединения на фенол и глиоксилат является спонтанным.) Следует понимать, что с помощью химических структур на фиг. 1 иллюстрируют молекулярные остовы, и что различные R-группы и т.п. (такие, как представленные в таблице 1) включены, но не обязательно конкретно проиллюстрированы на фиг. 1. Для воздействия на конкретные спектры сорняков и условия окружающей среды в различных областях во всем мире используют множество смесей различных комбинаций феноксиауксинов. Использование гена AAD-12 в растениях обеспечивает защиту против гораздо более широкого спектра ауксиновых гербицидов, таким образом, увеличивая гибкость и спектры сорняков, которые можно контролировать.

К настоящему времени идентифицирован единственный ген (AAD-12), который при генетическом конструировании для экспрессии в растениях обладает свойствами, позволяющими использовать феноксиауксиновые гербициды на растениях, у которых никогда не было наследственной устойчивости, или она была недостаточно высокой, чтобы иметь возможность использовать эти гербициды. Кроме того, AAD-12 может обеспечивать защиту от пиридилоксиацетатных гербицидов в полевых условиях, повышая потенциальную пользу от этих гербицидов, природной устойчивости к которым также недостаточно, чтобы сделать возможной селективность. Растения, содержащие AAD-12 в отдельности, теперь можно обрабатывать последовательно или с использованием баковой смеси с одним, двумя или комбинацией нескольких феноксиауксиновых гербицидов. Норма внесения каждого феноксиауксинового гербицида может находиться в диапазо