Получение и применение бактериального гистамина

Получение и применение бактериального гистамина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ДАННОЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к способу отбора специфических пробиотических молочнокислых бактерий, продуцирующих гистамин, и к применению таких штаммов для доставки полезных эффектов для этого хозяина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций (ФАО) определяет пробиотики как «живые микроорганизмы, которые после введения в достаточных количествах человеку производят пользу для здоровья (вызывают укрепление здоровья) этого человека». В настоящее время ряд различных бактерий используют в качестве пробиотиков, например, продуцирующие молочную кислоту бактерии, такие как штаммы Lactobacillus и Bifidobacteria.

Продуцирующие молочную кислоту бактерии не только используются вследствие их полезного действия на здоровье человека или животного, но они также широко используются в пищевой промышленности для процессов ферментации. Эффективность пробиотиков является штаммспецифической, и каждый штамм может способствовать здоровью хозяина через различные механизмы. Пробиотики могут предотвращать или ингибировать пролиферацию патогенов, подавлять продуцирование вирулентных факторов патогенами или модулировать иммунную реакцию в провоспалительном или противовоспалительном пути. Применение различных штаммов пробиотических, продуцирующих молочную кислоту бактерий Lactobacillus reuteri является многообещающей терапией для устранения пароксизмальной боли («детской колики»), ослабления экземы, уменьшения приступов профессиональных заболеваний и супрессии инфекции Helicobacter pylori. L. reuteri считается свойственным желудочно-кишечному тракту человека организмом и присутствует, например, на слизистой оболочке гастрального корпуса, гастральной полости, двенадцатиперстной кишки и подвздошной кишки. См., например, патенты США с номерами 5439678, 5458875, 5534253, 5837238 и 5849289.

При выращивании клеток L. reuteri в анаэробных условиях в присутствии глицерина они продуцируют антимикробное вещество, известное как реутерин (β-гидроксипропиональдегид).

Взаимосвязь между хозяином и его микробами является сложной, и для некоторых бактерий эта взаимосвязь хозяин/микроб развивалась на протяжении многих лет ко-эволюции. Это, по-видимому, является особенно верным для Lactobacillus reuteri. Наши знания мутуалистической взаимосвязи между микробами кишечника и человека-хозяина существуют в ее периоде новорожденности, но мы уже в высокой степени осознаем, что микробиом кишечника играет важную роль в развитии кишечника и иммунной системы, питании, и новые звенья устанавливаются между микробиомом кишечника и головным мозгом. Дисбиоз, пертурбация нормального микробиома кишечника, подразумевался в широком диапазоне связанных с заболеваниями процессов, включающих в себя процессы, влияющие на локальную среду кишечника, таких как воспалительная болезнь кишечника (IBD) и синдром раздраженной толстой кишки (слизистый колит) (IBS), и процессы в участках, удаленных от кишечника, такие как метаболический синдром. Существенный терапевтический потенциал лежит в микробиоме кишечника, и прилагается исследование в направлении дальнейшей задачи изменения микрофлоры для предотвращения и/или лечения различных, связанных с заболеванием процессов.

Таким образом, существует необходимость в понимании таких специфических взаимодействий между микробами и человеком, связанных с конкретным заболеванием или другими ситуациями, влияющими на здоровье хозяина таким образом, что большая часть подходящих пробиотических штаммов может быть отобрана и использована для противодействия таким развитиям.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанное здесь изобретение обеспечивает локальное продуцирование гистамина в млекопитающих, в частности, в человеке, причем это локальное продуцирование гистамина включает в себя, но не ограничивается ими, продуцирование в GI-тракте (гастроэнтерологическом тракте), мочеполовом тракте (GU), полости рта, в легких и дыхательных путях, на коже и т. д. тела человека посредством отбора определенных штаммов молочнокислых бактерий. Эти бактерии могут доставляться вместе с некоторыми аминокислотами и/или сахарами, вводиться отдельно или уже присутствовать в активном участке.

Первичной целью данного изобретения является отбор (селекция) штаммов, которые могут локально продуцировать гистамин в разнообразных местоположениях, включающих в себя GI-тракт, GU-тракт, полость рта, в легких и дыхательных путях, на коже и т. д. тела человека.

Следующей целью этого изобретения является обеспечение продуктов, содержащих указанные штаммы.

Следующей целью данного изобретения является комбинирование введения бактерий с введением гистидина или содержащих гистидин пищевых продуктов или композиций для гарантии локального генерирования гистамина.

Таким образом, данное изобретение относится к новому способу для отбора клеток молочнокислых бактерий, которые применимы в качестве пробиотиков и в терапии. Этот новый способ предусматривает скрининг и отбор на штаммы молочнокислых бактерий, которые имеют активный оперон гистидина и способны продуцировать гистамин. Неожиданно эти молочнокислые бактериальные штаммы, отобранные таким способом, применимы в качестве пробиотиков и в терапии, в частности, в продуцировании противовоспалительных эффектов, посредством локального продуцирования гистамина. Эти эффекты данных бактерий являются неожиданными, как обсуждается в другом месте здесь, и ранее присутствие в пищевых продуктах бактерий, продуцирующих гистамин, активно избегалось вследствие узнаваемого риска для здоровья, например, потенциальных токсичных эффектов. Так, введение млекопитающему молочнокислых бактерий, способных локально продуцировать гистамин, или фактически скрининг и селекция (отбор) молочнокислых бактерий на такую способность локального продуцирования гистамина на основе присутствия активного оперона гистамина является контринтуитивным относительно такой доктрины. Действительно, ранее никогда не сообщалось, что пробиотики продуцируют гистамин.

Таким образом, в самом широком смысле данное изобретение обеспечивает способ отбора продуцирующего молочную кислоту бактериального штамма для применения в локальном продуцировании гистамина в млекопитающем, где указанный способ предусматривает скрининг бактерий на присутствие активного оперона гистидина и отбор штамма, который имеет активный оперон гистидина и способен продуцировать гистамин.

Оперон гистидина содержит три гена (антипортера гистидина/гистамина, гистидин-декарбоксилазы-пирувоил типа А (HdcA) и гистидин-декарбоксилазы-пирувоил типа В (HdcB)). Считается, что активность каждого из этих генов является важной для данного изобретения. Так, в способах скрининга этого изобретения кандидатные бактерии оценивали на присутствие всех трех генов и отбирали штаммы, положительные в отношении всех трех генов. Любой подходящий способ может быть использован для детектирования присутствия всех трех генов, например, генетические способы, такие как ПЦР. Получение хороших уровней гистамина может быть также индикатором присутствия всех трех генов и присутствия активного оперона гистидина. Таким образом, этот способ отбора данного изобретения включает в себя также стадию отбора штамма, который способен продуцировать гистамин. Предпочтительными являются штаммы с высокими уровнями продуцирования гистамина. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления штамм отбирают на его способность продуцировать гистамин на уровне, большем чем 200, предпочтительно большем чем 250, или более предпочтительно большем чем 300 пг/мл, например на уровне, большем чем 350, 400, 450 или 500 пг/мл. Такие величины обычно относятся к величинам гистамина, измеренным в супернатанте штаммов в культуре.

Подходящие способы измерения уровней продуцирования гистамина будут хорошо известны лицу с квалификацией в данной области. Здесь приводится в качестве примера и является предпочтительным способ масс-спектрометрии, более конкретно тройной квадрупольной масс-спектрометрии. Однако ELISA или иммуноанализы могут быть равным образом использованы для оценивания и количественного определения продуцирования гистамина. Так, в некоторых вариантах осуществления способ отбора будет включать в себя стадию детектирования количества или уровня гистамина, продуцируемого кандидатным штаммом. Вследствие дальнейших применений штаммов, которые отбирают способами этого изобретения, после отбора или выделения продуцирующих гистамин штаммов другие варианты осуществления будут включать в себя дополнительные способы культивирования или размножения таких штаммов или, возможно, хранения таких штаммов для последующих применений.

Такие дополнительные стадии (и фактически стадии отбора способов этого изобретения) будут обычно необходимыми для проведения в подходящей культуральной среде, которая поддерживает продуцирование гистамина. Предпочтительные культуральные среды будут содержать подходящий источник углерода, который будет поддерживать продуцирование гистамина указанным штаммом. В особенно предпочтительных вариантах осуществления эти среды будут содержать глюкозу в качестве источника углерода и предпочтительно не будут содержать сахарозы или по меньшей мере будут содержать только сахарозу при таком уровне, который не будет значимо ухудшать продуцирование гистамина этим штаммом. Гистидин или аналог гистидина могут быть также обеспечены, необязательно вместе с источниками других аминокислот.

В предпочтительных вариантах осуществления указанным штаммом является штамм Lactobacillus reuteri.

Сразу после отбора подходящего штамма с использованием способа данного изобретения он может быть затем использован для локального продуцирования гистамина в млекопитающем. Таким образом, указанные штаммы способны также к локальному продуцированию гистамина в млекопитающем.

Таким образом, один дополнительный аспект данного изобретения обеспечивает продукт, содержащий клетки штамма молочнокислых бактерий, получаемого способом отбора этого изобретения, где указанный штамм молочнокислых бактерий имеет активный оперон гистидина и способен продуцировать гистамин, для применения в локальном продуцировании гистамина в млекопитающем. Как будет описано в другом месте здесь, предпочтительными применениями являются применения в лечении и/или профилактике воспалительных состояний или в лечении и/или профилактике состояний или заболеваний, которые будут получать пользу от локального продуцирования гистамина. Например, такое локальное продуцирование гистамина может приводить к противовоспалительному эффекту.

Альтернативные варианты осуществления этого изобретения обеспечивают штамм молочнокислых бактерий, который способен продуцировать гистамин, для применения в локальном продуцировании гистамина в млекопитающем, где указанный штамм молочнокислых бактерий имеет активный оперон гистидина. Предпочтительные признаки этого штамма и его применения описаны в другом месте здесь.

Обеспечены также способы лечения или способы локального продуцирования гистамина в млекопитающем, причем указанные способы предусматривают введение продукта, содержащего клетки штамма молочнокислых бактерий, получаемые способом отбора этого изобретения, или введение штамма молочнокислых бактерий, где указанный штамм молочнокислых бактерий имеет активный оперон гистидина и способен продуцировать гистамин, указанному млекопитающему в количестве, эффективном для возможности локального продуцирования гистамина в указанном млекопитающем. Предпочтительные признаки этого штамма и его терапевтические применения описаны здесь в другом месте.

Данное изобретение обеспечивает также применение продукта, содержащего клетки молочнокислых бактерий, получаемые способом отбора этого изобретения, где указанный штамм молочнокислых бактерий имеет активный оперон гистидина и способен продуцировать гистамин, в приготовлении композиции или лекарственного средства для применения в локальном продуцировании гистамина в млекопитающем. Альтернативные варианты осуществления обеспечивают применение штамма молочнокислых бактерий, где указанный штамм молочнокислых бактерий имеет активный оперон гистидина и способен к локальному продуцированию гистамина в млекопитающем. Предпочтительные признаки этого штамма и его терапевтические применения описаны здесь в другом месте.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 - количественное определение гистамина во фракциях HILIC-HPLC. Использовали тройную квадрупольную масс-спектрометрии для количественного определения гистамина, присутствующего в выбранном диапазоне фракций HILIC-HPLC. TNF-ингибирующие фракции имели наивысшие количества гистамина из всех испытанных фракций.

Фигура 2 - очищенный гистамин и гистамин из L. reuteri 6475 ингибирует продуцирование TNF через H₂-рецептор гистамина. A. Очищенный гистамин значимо ингибировал продуцирование TNF, эффект, который блокируется специфическими антагонистами H₂-рецепторов зависимым от дозы образом. Кондиционированные среды (или супернатант), содержащие секретированные факторы из штамма 6475 (включающие в себя гистамин), значимо ингибировали продуцирование TNF - эффект, который частично блокируется специфическими антагонистами H₂-рецепторов. N=3, p-величина <0,05 в сравнении с контрольной средой, ^**p-величина <0,05 в сравнении с гистамином, ^***p-величина <0,05 в сравнении с кондиционированной средой ATCC 6475 (CM). B. Промывка осадка клеток из штамма 6475, содержащая гистамин, подавляла продуцирование TNF - эффект, который частично блокировался специфическими антагонистами H₂-рецепторов. Фракция В3, которая содержит относительно чистый гистамин, ингибировала продуцирование TNF - эффект, который полностью блокировался специфическими антагонистами H₂-рецепторов. N=3, p-величина <0,05 в сравнении с контрольной средой, p-величина <0,05 в сравнении с промывкой клеток ATCC 6475 (CP), ^***p-величина <0,05 в сравнении с фракцией B3.

Фигура 3 - оперон гистидина является важным для TNF-ингибирующего фенотипа L. reuteri 6475. A. Этот оперон гистидина состоит из трех генов: антипортера гистидина/гистамина, hdcA и hdcB. B. Мутация в любом одном гене в этом опероне гистидина приводит к частичной потере супрессии TNF L. reuteri 6475. N=9, p-величина <0,05 в сравнении с контрольной средой, ^**p-величина <0,05 в сравнении с ATCC PTA 6475.

Фигура 4 - L. reuteri 6475 значимо уменьшал потерю массы, индуцированную введением TNBS; эта фигура представляет данные из двух независимых экспериментов: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

Фигура 5 - L. reuteri 6475 значимо уменьшал макроскопическое повреждение ободочной кишки, индуцированное введением TNBS; эта фигура представляет данные из двух независимых экспериментов: *p<0,05, ***p<0,001.

Фигура 6 - L. reuteri 6475 значимо уменьшал концентрацию SAA, индуцированную введением TNBS; эта фигура представляет данные из двух независимых экспериментов: *p<0,05, ***p<0,001.

Фигура 7 - мутант hdcA давал уменьшенную способность аттенуированного колита; эта фигура представляет данные из двух независимых экспериментов: *p<0,05, ***p<0,001.

Фигура 8 - мутант hdcA давал уменьшенную способность аттенуированного колита; эта фигура представляет данные из двух независимых экспериментов: *p<0,01, ***p<0,001.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЭТОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ И ЕГО ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Авторы данного изобретения обнаружили здесь, что отобранная группа лактобацилл, включающих в себя определенные штаммы Lactobacillus reuteri, локально продуцирует гистамин при конкретных условиях роста, и что такой гистамин будет давать пользу для хозяина, например, уменьшение воспаления, уменьшение некоторых типов рака и т. д.

Histamine

Гистамин является органическим азотистым соединением, участвующим в нескольких, ассоциированных со здоровьем процессов млекопитающего, включающих в себя локальные иммунные реакции, а также регулирующим физиологическую функцию в кишечнике и действующим в качестве нейротрансмиттера. В качестве части иммунной реакции на чужеродные патогены гистамин продуцируется базофилами и мастоцитами (тучными клетками). Гистамин может быть получен из декарбоксилирования аминокислоты гистидина - реакции, катализируемой ферментом L-гистидиндекарбоксилазой.

Бактерии способны продуцировать гистамин с использованием ферментов гистидиндекарбоксилаз, неродственных с ферментами, обнаруживаемыми в эукариотах. До сих пор такое продуцирование гистамина некоторыми бактериальными штаммами рассматривалось скорее как опасность для здоровья, чем как возможная польза для людей. Например, отравление Scombroid (форма неинфекционного заболевания новорожденных) обусловлено продуцированием гистамина бактериями в испортившейся пище, в частности, рыбы. Ферментированные пищевые продукты и напитки природно содержат малые количества гистамина вследствие сходного превращения, выполняемого ферментацией бактерий или дрожжей. Доставка некоторых контролируемых количеств гистамина из отобранных бактерий может неожиданно давать скорее полезные эффекты, чем вредные эффекты, как можно было бы ожидать из вышеупомянутых исследований.

Рецепторы гистамина являются классом G-белоксвязанных рецепторов с гистамином в качестве их эндогенного лиганда. Имеются четыре известных рецептора гистамина: Н₁-рецептор (H1R), H₂-рецептор (H2R), H₃-рецептор (H3R) и H₄-рецептор (H4R).

Vannier et al. (Histamine Suppresses Gene Expression and Synthesis of Tumor Necrosis Factor a via Histamine H₂-Receptors; J Exp Med. 1991 July 1; 174(1):281-4) показали, что LPS-индуцируемый синтез TNF-α в мононуклеарных клетках периферической крови подавлялся гистамином, и авторы дополнительно предполагают, что высвобождение гистамина из тучных клеток может ограничивать степень воспалительных и иммунных реакций подавлением локального синтеза цитокинов в H₂-рецепторнесущих клетках.

Противовоспалительная активность гистамина была ранее описана Wang et al. (Histamine Antagonizes Tumor Necrosis Factor (TNF) Signaling by Stimulating TNF Receptor Shedding from the Cell Surface and Golgi Storage Pool; J. Biol. Chem. 278(24): 21751-21760), которые показали, что гистамин вызывает транзиторную потерю поверхностного TNFR1, увеличивает выделение TNFR1 и мобилизацию молекул TNFR1 из аппарата Гольджи в культивируемых эндотелиальных клетках человека. Инъекция гистамина в кожу человека, трансплантированную на иммунонедостаточных мышах, вызывала выделение TNFR1 или уменьшала TNF-опосредованную индукцию эндотелиальных молекул адгезии.

Vannier et al. and Wang et al. не упоминали ничего ни об использовании бактериальных штаммов в качестве пробиотиков, ни о том, как отбирать эти штаммы на основе их гистамин-продуцирующих способностей для гарантии определенных, полезных для здоровья эффектов для хозяина, таких как противовоспалительные эффекты.

Цеплен, форму фармацевтической категории дигидрохлорида гистамина, используют для предотвращения рецидива в пациентах, диагностированных как имеющих острый миелоидный лейкоз (AML). Цеплен вводят вместе с низкими дозами иммуноактивирующего цитокина интерлейкина-2 (IL-2) в постремиссионной фазе AML, то есть когда пациенты завершили первоначальную химиотерапию. Исследования показали, что Цеплен/IL-2 может индуцировать иммуноопосредованное убивание лейкозных клеток. Это лечение (подкожные инъекции) предоставляется в виде 3-недельных циклов пациентами дома в течение 18 месяцев. Побочные эффекты Цеплена включают в себя транзиторные приливы и головную боль. Для пациентов было бы предпочтительным получение локально производимого гистамина по мере необходимости, вместо подкожных инъекций; эта стратегия доставки может быть достигнута введением бактериально-производимого гистамина пациенту с использованием штаммов, отобранных в соответствии с этим исследованием.

Было известно ранее, что грамотрицательные бактерии образуют гистамин, например, в сырой рыбе и сыром мясе после неприемлемой температуры, и что грамположительные бактерии вызывают порчу от гистамина ферментируемых продуктов, таких как сыр, колбаса, мисо, соевый соус, пиво и вино. Идентификация продуцирующих гистамин бактерий в пищевых продуктах была трудной.

Lactobacillus reuteri был ранее также ассоциирован с продуцированием гистамина, Casas et al. (Validation of the Probiotic Concept: Lactobacillus reuteri Confers Broad-spectrum Protection against Disease in Humans and Animals.; 2000, ISSN 0891-060X) сообщает, что было показано, что два штамма L. reuteri в руках Straub et.al. (Z Lebensm Unters Forsch (1995) 201: 79-82) декарбоксилируют L-гистидин с образованием гистамина, и эти авторы предостерегают против использования таких штаммов для ферментации пищевых продуктов и в качестве пробиотиков.

Trip et al. (HdcB, a novel enzyme catalyzing maturation of pyruvoyl-dependent histidine decarboxylase; Molecular Microbiology (2011) 79(4), 861-871) ссылаются на три типа генетической организации локусов декарбоксилирования гистидина среди гистамин-продуцирующих грамположительных бактерий. Наибольшая группа обнаружена в молочнокислых бактериях, включающих в себя L. hilgardii 0006, L. buchneri B301, L. reuteri F275 и T. halophilus. Было показано, что Lactobacillus hilgardii 0006 продуцирует гистамин; в исследовании, выполняемом Lucas et al. (Histamine-Producing Pathway Encoded on an Unstable Plasmid in Lactobacillus hilgardii 0006; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 2005, Vol. 71, No. 3, p. 1417-1424), они дополнительно утверждают, что гистамин является примесью, которая появляется в некоторых продуктах во время роста нежелательных бактерий. Lucas et al. выполнили скрининг коллекции молочнокислых бактерий вина для идентификации генов, участвующих в гистамин-продуцирующем пути грамположительной бактерии вина.

Из швейцарского сыра был выделен гистамин-продуцирующий штамм Lactobacillus buchneri, который, по-видимому, участвовал во вспышке отравления гистамином. (Summer et al. Isolation of histamine-producing Lactobacillus buchneri from Swiss cheese implicated in a food poisoning outbreak.; Applied and Environmental Microbiology (1985), Vol. 50, Issue 4, p. 1094-1096).

Calles-Enriquez et al. (Sequencing and Transcriptional Analysis of the Streptococcus thermophiles Histamine Biosynthesis Gene Cluster: Factors That Affect Differential hdcA Expression; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Sept. 2010, Vol 76, No. 18, p. 6231-6238) описывают гистамин-продуцирующие штаммы Streptococcus thermophiles, термофильную закваску, используемую для приготовления йогурта и некоторых разновидностей сыра. Кроме того, они указывают на то, что присутствие штаммов со способностью декарбоксилирования гистидина могло бы приводить к продуктам, содержащим гистамин, продуцируемый во время приготовления или во время хранения, перед употреблением, и что это лежит в основе важности использования только гистаминотрицательных штаммов в приготовлении ферментированных молочных продуктов.

Даже если ранее было известно, что некоторый Lactobacillus может производить гистамин, определенно не известно, что способность продуцировать гистамин является ключевым фактором для гарантии определенных полезных эффектов для здоровья для его хозяина, например, противовоспалительных свойств некоторых штаммов Lactobacillus.

Из предыдущего уровня техники не известно и не является очевидным, что это может быть использовано для скрининга или отбора определенных пробиотических штаммов Lactobacillus.

Мастоциты (тучные клетки)

Тучная клетка (также известная как мастоцит и лаброцит) является резидентной тучной клеткой нескольких типов тканей и содержит многие гранулы, богатые гистомином и гепарином. Хотя они наиболее хорошо известны из-за их роли в аллергии и анафилаксии, тучные клетки также играют важную защитную роль, будучи, например, тесно связанными с заживлением ран и защитой против патогенов.

Тучные клетки присутствуют в большинстве тканей, обычно окружая кровеносные сосуды и нервы, и особенно заметны вблизи пограничных слоев между наружным миром и внутренней средой, такой как кожа, слизистая оболочка легких и пищеварительный тракт, а также в полости рта, конъюнктивы и носа.

В аллергических реакциях тучные клетки остаются неактивными, пока аллерген не связывается с IgE уже в ассоциации с этой клеткой. Другие события активации мембраны могут либо праймировать тучные клетки для последующей дегрануляции, либо могут действовать в синергии с трансдукцией сигнала FceRI. Гистамин из такой грануляции сужает посткапиллярные венулы, активирует эндотелий и увеличивает проницаемость кровеносных сосудов. Высвобождение гистамина приводит к локальному отеку (опуханию), теплу, покраснению и аттрагированию других воспалительных клеток к сайту высвобождения. Оно также раздражает нервные окончания (приводя к зуду или боли). Кожными признаками высвобождения гистамина является реакция «прилива крови к лицу и волдырей». Шишка и краснота сразу же после укуса комара являются хорошим примером этой реакции, которая осуществляется в течение секунд после обработки тучных клеток аллергеном. Другие физиологические активности тучных клеток являются гораздо менее хорошо понимаемыми. Несколько линий доказательства предполагают, что тучные клетки могут иметь явно фундаментальную роль в наследственном иммунитете - они способны усовершенствовать широкий ряд важных цитокинов и других воспалительных медиаторов, таких как TNFα, они экспрессируют множественные «рецепторы узнавания паттернов», которые, как считается, включены в распознавание широких классов патогенов, и мыши без тучных клеток считаются гораздо более чувствительными к различным инфекциям.

С учетом токсичности бактериального гистамина в пищевых продуктах и того факта, что рекомендуется избегание гистамин-продуцирующих штаммов в ферментированных продуктах (см. дополнительно примеры в Calles-Enriquez et al. Sequencing and Transcriptional Analysis of the Streptococcus thermophiles Histamine Biosynthesis Gene Cluster: Factors That Affect Differential hdcA Expression; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Sept. 2010, Vol. 76, No. 18, p. 6231-6238), нельзя считать очевидным применение определенных отобранных штаммов Lactobacillus для локального продуцирования гистамина в лечении и/или профилактике различных заболеваний.

Взаимоотношение между хозяином и его микробами является комплексным, так как имеются определенно собственные типы клеток млекопитающих, такие как тучные клетки. Это взаимоотношение хозяин-микроб развивалось на протяжении многих лет ко-эволюции, это включает в себя продуцирование микробами различных метаболитов, которые могут быть полезными для хозяина с точки зрения питания, иммунологически и т. д., действует в качестве всех или части антагонистов, агонистов, десенсибилизации и т. д. специфических рецепторов или других процессов. Таким образом, имеется необходимость в понимании таких специфических взаимодействий между микробами и человеком таким образом, чтобы большая часть подходящих пробиотических штаммов могла быть отобрана и использована для противодействия таким развитиям.

Авторы изобретения обнаружили здесь, что отобранная группа лактобацилл, включающая в себя некоторые штаммы Lactobacillus reuteri, локально продуцирует гистамин в специфических условиях роста. Такой локально продуцированный гистамин, в противоположность прежним мнениям, будет приносить пользу хозяину множественными путями, включающими в себя уменьшение воспаления, уменьшение определенных типов рака и т. д.

Одной целью этого изобретения является обеспечение продуктов, содержащих указанные штаммы вместе со специфическим источником углерода, для получения синбиотического продукта.

Другие цели и преимущества будут более полно очевидными из следующего описания и прилагаемой формулы изобретения.

Введение штаммов молочнокислых бактерий, отобранных в соответствии с данным способом, млекопитающему будет приводить к локально продуцируемому гистамину, который мог бы быть полезным по нескольким причинам.

Первичной целью данного изобретения является обеспечение способа отбора штаммов молочнокислых бактерий, гарантирующих хороший противовоспалительный эффект. Эти штаммы могли бы предпочтительно использоваться для лечения и/или профилактики воспалительных состояний, так как оперон гистидина и продуцирование гистамина является существенным для противовоспалительной способности определенной молочнокислой бактерии. Предпочтительно эти штаммы могут быть использованы для лечения и/или профилактики воспалительных процессов в GI-тракте, GU-тракте, полости рта, в легких и дыхательных путях, на коже и т. д. тела млекопитающего, в том числе, но не ограничивающихся ими, колита, IBD, IBS, дивертикулеза, гингивита, вагинита и т. д. Ранее было известно, что гистамин через H₂-рецептор может уменьшать экспрессию гена TNF-альфа. Кроме того, тучные клетки способны вырабатывать широкий ряд важных цитокинов и других воспалительных медиаторов, таких как TNF-альфа. Однако ранее не было известно, что оперон гистидина и локальное продуцирование гистамина таких отобранных штаммов может быть полезным для этого хозяина и является, например, ключевым фактором в противовоспалительной способности отобранных штаммов L. reuteri. Ранее не было известно применение отобранного L. reuteri в лечении, требующем гистамина.

Предпочтительными продуктами и штаммами для лечения и/или профилактики воспалительных состояний являются Lactobacillus reuteri, в частности, Lactobacillus reuteri 6475 (ATCC PTA 6475). В других вариантах осуществления этого изобретения используемым штаммом не является Lactobacillus reuteri 6475 (ATCC PTA 6475).

Терапевтические применения этих штаммов, продуктов и композиций этого изобретения, определенных здесь, приводят к уменьшению или облегчению релевантных заболеваний или симптомов заболевания, например, могут приводить к значимому уменьшению уровней воспаления в млекопитающем. Например, локально производимый гистамин может быть активирующим H₂-рецепторы на кишечных эпителиальных клетках, а также иммунных клетках для супрессии мукозного иммунитета хозяина, например, через ингибирование провоспалительных цитокинов. Таким образом, данное изобретение позволяет превращать диетический компонент (гистидин) в гистамин в сайте активности и локально модулировать иммунную реакцию хозяина (например, в кишечнике). Можно видеть, что такое локальное продуцирование гистамина, обеспечиваемое данным изобретением, может обеспечивать реальные преимущества относительно, например, перорального проглатывания или других форм введения гистамина, особенно в связи с тем фактом, что такое пероральное проглатывание не может пропагандироваться вследствие узнаваемых токсичных эффектов и рисков для здоровья.

В частности, когда речь идет о воспалительных заболеваниях кишечника, эти терапевтические применения штаммов, продуктов и композиций этого изобретения могут приводить к значимому уменьшению образования язв и повреждения кишечника (например, повреждения ободочной кишки), измеряемому стандартным способом, таким как показатель Wallace, значимому уменьшению потери массы или значимому уменьшению воспаления кишечника, например, ободочной кишки.

Такое уменьшение или облегчение заболевания или его симптомов может быть измерено любым подходящим анализом. Предпочтительно уменьшение или ослабление заболевания или симптомов является статистически значимым, предпочтительно с величиной вероятности <0,05. Такое уменьшение или ослабление заболевания или симптомов обычно определяют в сравнении с подходящим контрольным индивидуумом или контрольной популяцией, например, здоровым млекопитающим или не получающим лечения или получающим плацебо млекопитающим.

Один подходящий способ введения и приготовления этих штаммов и т. д. выбирают в зависимости от участка, в котором желательным является продуцирование гистамина. Одним предпочтительным способом введения является пероральный способ, однако равным образом для некоторых обработок будет подходящей местная или некая другая форма локального введения в кожу, прямую кишку, влагалище или десны или внутривенная или внутримышечная инъекция.

Хотя приведенные здесь примеры демонстрируют применение штаммов этого изобретения и их подходящие дозы для лечения колита, будет понятно, что это является только одним примером воспалительных состояний, которые могут лечиться в соответствии с данным изобретением, и что подходящие дозы этих штаммов, продуктов и композиций этого изобретения, описанного здесь, могут быть выбраны в зависимости от подлежащего лечению заболевания, способа введения и соответствующей композиции.

Диетические смеси, содержащие гистидин, могут быть использованы для гарантии присутствия гистидина и увеличения посредством этого эффективности этих бактерий. Гистидин может вводиться отдельно или вместе с этими бактериями.

Одной возможностью гарантии бактериальной доставки гистидина является употребление богатой гистидином пищи, в том числе, но не только, соевого белка, сыра, яиц, куриного мяса или свинины.

Было показано, что оперон гистидина в бактериях улучшает способность роста в условиях низкого рН или ограничения источника энергии (Calles-Enriquez et al.), но оперон гистидина не был ассоциирован с противовоспалительными признаками некоторых штаммов L. reuteri.

Другой целью данного изобретения является применение штаммов, отобранных в соответствии с данным способом, в раковой терапии. Гистамин в комбинации с IL-2 использовали для лечения AML. Применение штаммов данного изобретения будет приводить к локально продуцируемому гистамину, который в комбинации с IL-2 мог бы быть использован для лечения AML.

Другой целью данного изобретения является применение отобранных штаммов для уменьшения пищевой аллергии, других аллергических реакций или других аутоиммунных заболеваний. Системные увеличения гистамина являются, как было известно ранее, следствием аллергии, вызываемой грануляцией тучных клеток. При введении штаммов, отобранных в соответствии с этим изобретением, реципиенту этот локально продуцируемый гистамин будет приводить к эффекту десенсибилизации, который будет уменьшать аллергию или другие аутоиммунные заболевания.

Целью данного изобретения является также применение продуцирующих гистамин штаммов молочнокислых бактерий для уменьшения риска поноса путешественников. Пациенты, лечившиеся блокаторами гистамина, имеют увеличенный риск приобретения поноса путешественников, и этот увеличенный риск мог бы быть нейтрализован введением молочнокислых бактерий в соответствии с данным способом.

Еще одной целью данного изобретения является применение отобранных штаммов в лечении MS. Гистамин был предложен в качестве важной молекулы для развития новых способов лечения для MS, и штаммы, отобранные в соответствии с данным изобретением, будут обеспечивать пациента гистамином.

Еще одной целью данного изобретения является применение продуцирующих гистамин бактерий в качестве противовоспалительного лечения кожи с использованием доступных гистидина и аналогов гистидина в коже. Поскольку гистидин является субстратом уроканиновой кислоты, которую кожа производит при УФ-облучении, эта уроканиновая кислота проявляет противовоспалительные свойства на коже.

Другой целью является применение таких отобранных штаммов для ингибирования активации ERK1/2.

Другой целью этого изобретения является ингибирование TNF-альфа.

Другой целью этого изобретения является уменьшение воспаления, локально или системно.

Другой целью этого изобретения является усиление экзоцитоза синаптических пузырьков ингибированием ERK1/2.

Другой целью этого изобретения является стимуляция самообновления эмбриональных стволовых клеток ингибированием ERK1/2.

Другой целью этого изобретения является индуцирование экспрессии макрофага ABCA1 и отток холестерина ингибированием ERK1/2.

Другой целью этого изобретения является уменьшение сердечной гипертрофии и сердечной недостаточности ингибированием ERK1/2.

Другой целью этого изобретения является уменьшение пролиферации некоторых типов рака, включающих в себя лейкоз (например, AML) или злокачественную меланому. Таким образом, такие типы рака являются предпочтительными заболеваниями, которые могут лечиться с использованием этих штаммов, продуктов и композиций данного изобретения.

Другой целью этого изобретения является применение отобранных штаммов для продуцирования гистамина в определенных условиях в качестве нейротрансмиттера, например, во взаимодействиях GU-тракта с CNS, а также передаче невральных сигналов в случае локальной боли. Эта роль в качестве нейротрансмиттера может распространяться до действий на перистальтику кишечника (для лечения констипации или диареи) и для пер