Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний

Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к области медицины и вирусологии, в частности к аттенуированному химерному вирусу группы А, аттенуированному гриппозному вектору на основе указанного вируса и их применению для профилактики и/или лечения заболеваний инфекционной природы, а также для лечения онкологических заболеваний.

Уровень техники

На сегодняшний день важнейшей мерой защиты от вирусной инфекции и ограничения ее распространения является вакцинопрофилактика. Современные вакцины, как правило, индуцируют образование антител к поверхностным антигенам вирусов. Эффективность вакцин прямо зависит от степени соответствия антигенной структуры штаммов вируса, входящих в состав вакцины, и штаммов, циркулирующих среди популяции. Поверхностные белки большинства вирусов подвергаются постоянной антигенной вариации (антигенный дрейф), что требует регулярного обновления штаммового состава вакцин. Разработка высокоиммуногенных и безопасных вакцин, индуцирующих иммунный ответ широкого спектра действия, является на сегодняшний день одной из основных проблем эффективной профилактики вирусных заболеваний.

Существующие вакцины можно разделить на два вида: аттенуированные (живые, содержащие цельные и активные вирусы, проявляющие низкую патогенность в полевых условиях) и инактивированные (содержащие фрагменты вирусных частиц или цельные неактивные вирусы). Живые вирусы, способные реплицироваться в инфицированном хозяине, вызывают сильный и длительный иммунный ответ против экспрессирующихся антигенов этих вирусов. Они эффективно вызывают как гуморальный, так и клеточный иммунный ответы, а также стимулируют биохимические пути, опосредуемые цитокинами и хемокинами. Поэтому, живые аттенуированные вирусы обладают определенными преимуществами по сравнению с композициями вакцин, основанными либо на инактивированных иммуногенах, либо на отдельных субъединицах иммуногенов, которые, как правило, стимулируют лишь гуморальную часть иммунной системы.

Для вакцинации животных и людей от различных инфекционных заболеваний вирусы различных семейств могут использоваться в качестве векторов, экспрессирующих чужеродные геномные последовательности. Применение векторов возможно в тех случаях, когда традиционные убитые или живые вакцины не могут быть получены или их эффективность не позволяет контролировать то или иное заболевание. Среди существующих систем доставки антигенов вирусные векторы занимают особое место, поскольку обладают следующими свойствами: имеют природный механизм взаимодействия с клеткой и проникновения в нее, переносят чужеродный генетический материал в ядро клетки, способны обеспечивать длительную экспрессию антигена, вирусная оболочка защищает генетический материал, кодирующий антиген.

Не все вирусы обладают свойствами, необходимыми для создания векторов для получения эффективных аттенуированных рекомбинантных вакцин. Для создания вакцин на основе вирусных векторов в настоящее время наиболее широко используются поксвирусы (Poxviridae) [J. Gen. Virol. 2005. V. 86. № 11. P. 2925–2936], вирус болезни Ньюкасла (NDV) [Virol. 2001. V. 75. № 23. P. 11868–11873] и аденовирусы (Adenoviridae) [Биотехнология. 2007. Т.5. С. 38–44]. Среди поксвирусов, используемых в качестве вирусного вектора, наиболее популярен вирус осповакцины, к преимуществам которого относятся простота и дешевизна получения, а также высокая пакующая емкость (до 25 т.п.н.) [J. Gen. Virol. 2005. V. 86. № 11. P. 2925–2936]. Серьезный недостаток векторов на основе вируса осповакцины – предсуществующий иммунитет к этому вирусу, который сформировался в человеческой популяции в результате иммунизации против оспы. Поэтому целесообразно использовать векторы на основе таких поксвирусов, как вирус оспы канарейки (Canarypox) и вирус оспы домашней птицы (Flowpox). Однако Canarypox и Flowpox индуцируют более слабый иммунный ответ на целевые антигены, чем вирус осповакцины, и требуют многократного введения или использования адъювантов [Vaccine. 1991. V.9. № 5. P. 303–308]. Существенным недостатком вакцинного вектора NDV является то, что последствия введения рекомбинантных NDV недостаточно изучены, и не ясно, безопасны ли вакцины на основе NDV для человека. Кроме того, NDV характеризуется низкой пакующей емкостью и сложностью получения векторов, несущих несколько целевых антигенов [Chem. Biodivers. 2010. V 7. № 3. P.677–689]. Аденовирусы также имеют ряд недостатков ограничивающих их применение в качестве векторов для переноса генов. Основными недостатками аденовирусных векторов считаются: (1) неоднородность распределения вирусных рецепторов на поверхности клеток в организме, что делает множество клеток нечувствительными к аденовирусной инфекции (2) наличие мощного защитного популяционного иммунитета к известным аденовирусным векторам (3) теоретическая возможность интеграции ДНК-вого генома аденовирусов в хромосомы человека (Stephen SL, Montini E, Sivanandam VG, Al-Dhalimy M, Kestler HA, Finegold M, Grompe M, Kochanek S. Chromosomal integration of adenoviral vector DNA in vivo. J Virol. 2010 Oct;84(19):9987-94. doi: 10.1128/JVI.00751-10. Epub 2010 Aug 4).

Векторы, полученные на основе вируса гриппа, имеют ряд преимуществ по сравнению с другими вирусными векторами, поскольку:

- Вирусы гриппа не имеют ДНК-вой фазы в своем репликационном цикле и не могут встраиваться в геном человека или животного.

- Вирус гриппа вызывает системный и мукозальный В и Т клеточный ответ к своим антигенам при заражении клеток респираторного тракта человека.

- Множество различных подтипов вируса гриппа является доступным. Поскольку антитела против разновидности указанных подтипов не обладают перекрестной реактивностью, предсуществующий иммунитет к вирусному вектору у хозяина, что зачастую является проблемой в случае других живых векторов, можно обойти. Возможны также эффективные бустерные иммунизации различными подтипами вирусов гриппа, экспрессирующими одни и те же антигены.

- Существует несколько типов живых гриппозных вакцин для интраназального введения (УЛЬТРАВАК® ВАКЦИНА ГРИППОЗНАЯ АЛЛАНТОИСНАЯ ЖИВАЯ (РФ) и Flumist® (USA)) и индустриальная технология их производства с применением 10-дневных куриных эмбрионов (Guideline on Influenza Vaccines – Quality Module, European Medicines Acency, 25 April 2014 [Электронный ресурс]. URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2014/06/WC500167817.pdf (дата обращения 01.11.2015)).

Вирусы гриппа относятся к семейству Ortomyxoviridae, которое включает роды Influenza A, B, С. Геномы вирусов гриппа А и В имеют схожую структуру, состоящую из 8 геномных фрагментов РНК негативной полярности: PB2,PB1,PA,HA,NA,NP,M и NS. Полимеразный комплекс PB2,PB1,PA транскрибирует одну матричную РНК (мРНК) с каждого геномного фрагмента, транслируемую в одноименный белок. У геномных фрагментов M и NS матричные РНК могут быть альтернативно сплайсированы, образуя мРНК, кодирующие белки M2 и NEP, соответственно. Все белки, за исключением белка NS и PB1-f2 (имеется не у всех штаммов), являются структурными компонентами вирусных частиц. Неструктурный белок NS1 накапливается в цитоплазме зараженных клеток и имеет функцию ингибитора системы интерферона.

Фрагментированная природа генома вируса гриппа дает возможность образования реассортантов вируса гриппа – вирусов, имеющих фрагменты генома смешанного происхождения от разных штаммов. Это является одним из механизмов антигенного разнообразия вирусов гриппа в природе и причиной возникновения пандемий вируса гриппа. Антигенные свойства вируса гриппа определяются поверхностными гликопротеинами НА и NA. В соответствии с антигенной специфичностью поверхностных гликопротеидов HA и NA в настоящее время известно 18 подтипов HA и 9 подтипов нейраминидазы (NA) К настоящему моменту для вируса гриппа А известно 18 сероподтипов, которые подразделяются на две группы. К первой группе относятся подтипы НА H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18, тогда как H3, H4, H7, H10, H14 и H15 относятся ко второй. При этом только сероподтипы Н1, Н2 и Н3 вируса гриппа А и различные антигенные варианты вируса гриппа В способны к распространению в человеческой популяции, вызывая пандемии или сезонные эпидемии гриппа.

Специфический иммунитет, вырабатываемый после переболевания или вакцинации одним сероподтипом, слабо защищает от инфекции другим сероподтипом вируса гриппа А. Иммунитет к любому сероподтипу вируса гриппа А не защищает от вируса гриппа В и наоборот, иммунизация против гриппа В не эффективна в отношении вируса гриппа А. В связи с этим существует настоятельная необходимость создания универсальной гриппозной вакцины, эффективной по отношению ко всем известным антигенным разновидностям вируса гриппа А и В.

Известно, что экспрессия антигенов в носовой полости приводит к индукции системного и локального мукозального В- и Т-клеточного иммунного ответа. Были осуществлены многочисленные попытки использования вирусов гриппа в качестве векторов для доставки и экспрессии посторонних геномных последовательностей в клетках респираторного тракта животных. Среди 8 геномных фрагментов вирусов гриппа А или В только NS геномный фрагмент способен стабильно удерживать геномные вставки более 800 нуклеотидов в составе рамки считывания неструктурного белка NS1, без нарушения структуры образующихся вирионов (Kittel C, Sereinig S, Ferko B, Stasakova J, Romanova J, Wolkerstorfer A, Katinger H, Egorov A. Rescue of influenza virus expressing GFP from the NS1 reading frame. Virology. 2004 Jun 20;324(1):67-73. PubMed PMID: 15183054). Более того, из всех белков вируса гриппа, только NS1 белок, в норме содержащий 230-237 аминокислотных остатков, может быть подвергнут 50% укорочению с карбоксильного конца без существенного нарушения репродукционной активности вируса в культуре клеток, куриных эмбрионах или в респираторном тракте животных (Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova J, Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Alexandrova G, Katinger H, Muster T. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol. 1998 Aug;72(8):6437-41. PubMed PMID: 9658085; PubMed Central PMCID: PMC109801). Такое укорочение NS1 белка создает пространство для имплементации продолжительных вставок чужеродных геномных последовательностей без нарушения морфологии и основных функций вируса, что позволяет конструировать генетически стабильные векторы. В связи с этим были получены гриппозные векторы на основе вируса гриппа А, которые кодировали укороченную рамку считывания от 80 до 126 аминокислотных остатков NS1 белка, которая могла быть продолжена вставками последовательностей антигенов различных патогенов бактериальной и вирусной природы, например последовательности белков микобактерии туберкулеза, бруцеллы абортус или вируса иммунодефицита человека (Tabynov K, Sansyzbay A, Kydyrbayev Z, Yespembetov B, Ryskeldinova S, Zinina N, Assanzhanova N, Sultankulova K, Sandybayev N, Khairullin B, Kuznetsova I, Ferko B, Egorov A. Influenza viral vectors expressing the Brucella OMP16 or L7/L12 proteins as vaccines against B. abortus infection. Virol J. 2014 Apr 10;11:69. doi: 10.1186/1743-422X-11-69. PubMed PMID: 24716528; PubMed Central PMCID: PMC3997475; Sereinig S, Stukova M, Zabolotnyh N, Ferko B, Kittel C, Romanova J, Vinogradova T, Katinger H, Kiselev O, Egorov A. Influenza virus NS vectors expressing the mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein induce CD4+ Th1 immune response and protect animals against tuberculosis challenge. Clin Vaccine Immunol. 2006 Aug;13(8):898-904. PubMed PMID: 16893990; PubMed Central PMCID: PMC1539114; Ferko B, Stasakova J, Sereinig S, Romanova J, Katinger D, Niebler B, Katinger H, Egorov A. Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in mice. J Virol. 2001 Oct;75(19):8899-908. PubMed PMID: 11533153; PubMed Central PMCID: PMC114458). При этом оптимальными по параметрам репродукции в куриных эмбрионах и иммуногенности у животных оказались конструкции, несущие NS1 белок, укороченный до 124 аминокислотных остатков (далее - векторы NS1-124)(Ferko B, Stasakova J, Romanova J, Kittel C, Sereinig S, Katinger H, Egorov A. Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes. J Virol. 2004 Dec; 78(23):13037-45. PubMed PMID: 15542655; PubMed Central PMCID: PMC524997).

Конструкции с большим укорочением NS1 белка обладали сниженной способностью к росту в интерферон компетентных клетках (клетки MDCK, A549), включая 10-дневные куриные эмбрионы, и были пригодны для производства только в интерферон-дефицитных клетках Vero. С другой стороны, векторы с длиною NS1 в 124-126 аминокислотных остатков варьировали по уровню аттенуации и были недостаточно безопасны у животных. Например, уровень репродукции вирусных векторов, несущих в указанной позиции микобактериальный белок ESAT-6, в легких мышей мог достигать значений, близких к показателям патогенных вирусов гриппа (104 и более вирусных частиц на грамм ткани легкого). Более того, векторы NS1-124 при заражающей дозе >5.0 log/ мышь могли вызвать существенную репродукцию вируса в легочной ткани инфицированных мышей и образование видимой легочной патологии (Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova J, Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Alexandrova G, Katinger H, Muster T. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol. 1998 Aug;72(8):6437-41. PubMed PMID: 9658085; PubMed Central PMCID: PMC109801; Stukova MA, Sereinig S, Zabolotnyh NV, Ferko B, Kittel C, Romanova J, Vinogradova TI, Katinger H, Kiselev OI, Egorov A. Vaccine potential of influenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein. Tuberculosis (Edinb). 2006 May-Jul;86(3-4):236-46. PubMed PMID: 16677861). Таким образом, гриппозные векторы с укороченной рамкой считывания белка NS1 до 124 аминокислотных остатков не могут использоваться для вакцинации людей, поскольку не соответствуют параметрам безопасности, разработанным для живых гриппозных вакцин, где непременным условием является температурочувствительность вируса (сниженная способность размножаться при температуре 39°C) и отсутствие активной репродукции вируса в нижнем респираторном тракте животных (Maassab HF, Bryant ML. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev Med Virol. 1999 Oct-Dec;9(4):237-44. Review. PubMed PMID: 10578119; Gendon IuZ [Live cold-adapted influenza vaccine: state-of-the-art]. Vopr Virusol. 2011 Jan-Feb;56(1):4-17. Review. Russian. PubMed PMID: 21427948; Aleksandrova GI, Gushchina MI, Klimov AI, Iotov VV [Genetic basis for construction of the life influenza type A vaccine using temperature-sensitive mutants]. Mol Gen Mikrobiol Virusol. 1990 Mar;(3):3-8. Review. Russian. PubMed PMID: 2194119; Kendal AP. Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries? Eur J Epidemiol. 1997 Jul;13(5):591-609. Review. PubMed PMID: 9258574).

В отличие от лицензированных живых гриппозных вакцин (УЛЬТРАВАК® ВАКЦИНА ГРИППОЗНАЯ АЛЛАНТОИСНАЯ ЖИВАЯ (РФ) или Flumist® (USA)), известные гриппозные векторы NS1-124 и близкие к ним конструкции не обладали фенотипическим маркером температурочувствительности (ts фенотип) и имели уровень репродукции в легких мышей, близкий к уровню вируса дикого типа с полноразмерным NS1 белком.

Попытки использования вирусов гриппа с онколитическими целями предпринимались еще в 50-60-е года 20-го века и основывались на наблюдениях практических врачей об отдельных случаях ремиссии раковых заболеваний после переболевания гриппом (Lindenmann J, Klein PA. Viral oncolysis: increased immunogenicity of host cellantigen associated with influenza virus. J Exp Med. 1967 Jul 1;126(1):93-108).

С момента разработки генно-инженерных методов для вируса гриппа в конце 90-х годов появилась возможность создания онколитических гриппозных векторов с модифицированным NS1 белком. Было показано, что укорочение NS1 белка может приводить к усилению онколитического эффекта при введении рекомбинантного вируса в опухоль за счет стимуляции системы врожденного иммунитета, антагонистом которого NS1 белок является (Sturlan S, Stremitzer S, Bauman S, Sachet M, Wolschek M, Ruthsatz T, Egorov A,Bergmann M. Endogenous expression of proteases in colon cancer cells facilitate influenza A viruses mediated oncolysis. Cancer Biol Ther. 2010 Sep 15;10(6):592-9; Ogbomo H, Michaelis M, Geiler J, van Rikxoort M, Muster T, Egorov A, Doerr HW, Cinatl J Jr. Tumor cells infected with oncolytic influenza A virus prime natural killer cells for lysis of resistant tumor cells. Med Microbiol Immunol. 2010 May;199(2):93-101. doi: 10.1007/s00430-009-0139-0. Epub 2009 Dec 15. PubMed PMID: 20012989; Efferson CL, Tsuda N, Kawano K, Nistal-Villán E, Sellappan S, Yu D, Murray JL,García-Sastre A, Ioannides CG. Prostate tumor cells infected with a recombinant influenza virus expressing a truncated NS1 protein activate cytolytic CD8+ cells to recognize noninfected tumor cells. J Virol. 2006 Jan;80(1):383-94).

Более того, возможность генно-инженерных манипуляций с длиной NS1 белка вируса гриппа позволила создать векторы, эффективность которых усиливалась наличием экспрессии иммунопотенциирующего агента, например, интерлейкина-15 (van Rikxoort M, Michaelis M, Wolschek M, Muster T, Egorov A, Seipelt J, Doerr HW, Cinatl J Jr. Oncolytic effects of a novel influenza A virus expressing interleukin-15 from the NS reading frame. PLoS One. 2012;7(5):e36506).

К сожалению, в этих работах, использовались вирусы гриппа, способные к ограниченной репродукции в некоторых культурах клеток, не обладающие необходимой генетической стабильностью трансгена для широкомасштабного производства в куриных эмбрионах – субстрате, оптимальном для наработки гриппозных вакцинных препаратов.

Таким образом, сохраняется потребность в новых эффективных вирусных векторах, в частности, аттенуированных гриппозных векторах, характеризующихся отсутствием активной репродукции вируса в организмах животных и обладающих фенотипом температурочувствительности, которые могут быть использованы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к аттенуированному вирусу гриппа A, индуцирующему кросс-протективный ответ против вируса гриппа A и В, содержащему химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, происходящую от подтипа вируса гриппа А, отличающегося от подтипа указанного аттенуированного вируса гриппа А.

В частности, настоящее изобретение относится к аттенуированному вирусу гриппа А, в котором указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 80-130 аминокислотных остатков, более предпочтительно, в котором указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к аттенуированному вирусу гриппа А, в котором указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетeрологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа H2N2.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к аттенуированному вирусу гриппа А, содержащему химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, причем указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетeрологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа H2N2, и где указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка.

Изобретение относится также к аттенуированному гриппозному вектору, экспрессирующему антиген или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из антигенов или их фрагментов патогенных бактерий, вирусов или простейших, содержащему аттенуированный вирус гриппа А по изобретению, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего антиген или его фрагмент патогенных бактерий, вирусов или простейших.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к аттенуированному гриппозному вектору, экспрессирующему антиген или его фрагмент, которые выбраны из группы, состоящей из антигенов вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса герпеса, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании, хламидий, возбудителя бруцеллеза или их комбинаций.

Следующим вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, экспрессирующий антиген или его фрагмент патогенных бактерий, вирусов или простейших, где размер указанного антигена или его фрагмента составляет от 10 до 400 аминокислот.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, в котором вставка кодирует участок белка НА вируса гриппа, предпочтительно, где участок белка НА представляет собой участок субъединицы HA2, выбранный из группы, состоящей из 1-185 а.к. из вируса гриппа А, 1-186 а.к. из вируса гриппа В, 23-185 а.к. из вируса гриппа А или 65-222 а.к. из вируса гриппа А.

Следующим вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, в котором вставка кодирует последовательность участка субъединицы НА2 вируса гриппа А или вируса гриппа В от 1 до 21 а.к. и последовательность участка белка NP вируса гриппа А от 243 до 251 а.к.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, где вставка кодирует белок микобактерии туберкулеза ESAT-6, Ag85A, Ag85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 или 10.4 или их фрагменты, в частности, где геномная последовательность вируса дополнительно содержит последовательность, кодирующую саморасщепляющийся 2А-пептид, между последовательностями, кодирующими NS1-124 и ESAT6.

Изобретение также относится к аттенуированному гриппозному вектору, экспрессирующему антиген или его фрагмент вируса гриппа, содержащему аттенуированный вирус гриппа А, содержащий химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, причем указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетeрологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа H2N2, и где указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей 1-21 а.к. белка НА2 вируса гриппа В и 243-251 а.к. белка NP вируса гриппа А.

Другим объектом изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, обладающий онколитической активностью, содержащий аттенуированный вирус гриппа А по изобретению, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего антиген или его фрагмент патогенных бактерий, вирусов или простейших.

Одним из вариантов осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, имеющий онколитическую активность, в котором вставка кодирует антиген или его фрагмент, выбранные из группы, состоящей из антигенов или их фрагментов вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса герпеса, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании, хламидий или их комбинаций.

Следующим вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, имеющий онколитическую активность, где размер кодируемого антигена или его фрагмента составляет от 10 до 400 аминокислот.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, имеющий онколитическую активность, где вставка кодирует белок микобактерии туберкулеза ESAT-6, Ag85A, Ag85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 или 10.4 или их фрагменты, в частности, где укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей белок микобактерии туберкулеза ESAT-6, еще более предпочтительно, где укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей саморасщепляющийся 2А-пептид, и последовательности, кодирующей белок микобактерии туберкулеза ESAT-6.

Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, содержащая в эффективном количестве аттенуированный вирус гриппа А по изобретению или аттенуированный гриппозный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним из вариантов осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая 6–9,5 log ЭИД 50/мл аттенуированного вируса гриппа А по изобретению или аттенуированного гриппозного вектора по изобретению и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс.% моновалентной соли, 0-5 масс.% L-карнозина, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2 масс.% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала. Предпочтительным вариантом является фармацевтическая композиция, где буферный раствор содержит 0,5-1,5 масс.% моновалентной соли, 0,01-5 масс.% L-карнозина, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01-2 масс. % аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала, предпочтительно, где моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу, белковый компонент представляет собой человеческий рекомбинантный альбумин, казитон, гидролизат лактальбумина или желатин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, глицин или глутамат натрия.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания, где инфекционное заболевание вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой млекопитающее или птицу, в частности, субъект представляет собой человека.

Изобретение также относится к вакцине против инфекционного заболевания, содержащей в эффективном количестве аттенуированный вирус гриппа А по изобретению или аттенуированный гриппозный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним из вариантов осуществления изобретения является вакцина, содержащая 6–9,5 log ЭИД 50/мл аттенуированного вируса гриппа А по изобретению или аттенуированного гриппозного вектора по изобретению и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс.% моновалентной соли, 0-5 масс.% L-карнозина, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2 масс.% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала, в частности, буферный раствор, содержащий 0,5-1,5 масс.% моновалентной соли, 0,01-5 масс.% L-карнозина, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01-2 масс. % аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала. В предпочтительном варианте осуществления в указанном буферном растворе моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу, белковый компонент представляет собой человеческий рекомбинантный альбумин, казитон, гидролизат лактальбумина или желатин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, глицин или глутамат натрия.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к вакцине против инфекционного заболевания, где инфекционное заболевание вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза.

Изобретение также относится к применению аттенуированного вируса гриппа А по изобретению, аттенуированного гриппозного вектора по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у субъекта, в частности, для лечения и/или профилактики заболевания, вызванного патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса и вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой млекопитающее или птицу, в частности, субъект представляет собой человека.

Изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение в эффективном количестве аттенуированного вируса гриппа А по изобретению, аттенуированного гриппозного вектора по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению указанному субъекту, предпочтительно к способу лечения заболевания, которое вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой млекопитающее или птицу, в частности, субъект представляет собой человека.

Следующим объектом изобретения является фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний у субъекта, содержащая аттенуированный вирус гриппа А по изобретению или аттенуированный вектор по изобретению в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним из вариантов осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая 8,5-10,5 log ЭИД 50/мл аттенуированного вируса гриппа А по изобретению или аттенуированного гриппозного вектора по изобретению и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс. % моновалентной соли, 0-5 масс.% L-карнозина, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала, причем в предпочтительном варианте осуществления изобретения буферный раствор содержит 0,5-1,5 масс.% раствора моновалентной соли, 0,01-5 масс.% L-карнозина, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01-2% аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала.

Другим вариантом осуществления является фармацевтическая композиция, в которой в буферном растворе моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой крахмал, белковый компонент представляет собой человеческий рекомбинантный альбумин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин.

Следующим объектом настоящего изобретения является применение аттенуированного вектора по изобретению, аттенуированного гриппозного вектора по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для лечения онкологических заболеваний у субъекта, в частности, заболеваний, выбранных из группы, состоящей из колоректального рака, кардиоэзофагеального рака, панкреатического рака, холангиоцеллюлярного рака, глиомы, глиобластомы и меланомы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой человека.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения онкологических заболеваний у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение в эффективном количестве аттенуированного вируса гриппа А по изобретению, аттенуированного гриппозного вектора по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению, предпочтительно, к способу лечения онкологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, кардиоэзофагеального рака, панкреатического рака, холангиоцеллюлярного рака, глиомы, глиобластомы и меланомы.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное введение представляет собой внутриопухолевое введение или введение в лакуну, образовавшуюся после хирургического удаления опухоли.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение химерных вирусов гриппа по NS геномному фрагменту и соответствующих гриппозных векторов, обладающих высокой безопасностью для людей и животных, в частности, векторов, характеризующихся отсутствием активной репродукции вируса в организме животного и обладающих фенотипом температурочувствительности, и которые могут быть использованы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний. Кроме того, техническим результатом является высокий потенциал роста полученных вирусов гриппа и гриппозных векторов в 10-дневных куриных эмбрионах. Еще одним техническим результатом является получение гриппозных векторов, которые обладают свойствами универсальной гриппозной вакцины. Также техническим результатом является получение вирусов гриппа и гриппозных векторов, обладающих онколитической активностью.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показан принцип конструирования гриппозного аттенуированного вектора. В А представлена схема NS геномного фрагмента вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). В Б представлена схема генетически модифицированного химерного NS геномного фрагмента, где рамка считывания белка NS1 укорочена и может продолжаться вставкой чужеродной последовательности. Последовательность, кодирующая белок Nep, заменена на гетерологичную от другого подтипа вируса гриппа А.

На Фиг.2 представлены нуклеотидные последовательности геномных NS фрагментов вируса дикого типа и примеры двух генетических конструкций химерной природы. В А представлен NS фрагмент вируса гриппа А/PR/8/34 (H1N1). В Б представлен химерный NS фрагмент вируса гриппа А, где рамка считывания белка NS1 укорочена, а последовательность Nep, выделенная жирным шрифтом, заимствована от вируса А/Singapore/1/57 (H2N2).

В представлен химерный NS фрагмент вируса гриппа А, где рамка считывания белка NS1 укорочена, а последовательность Nep, выделенная жирным шрифтом, заимствована от вируса А/Leningrad/134/47/57 (H2N2).

На Фиг.3 представлены аминокислотные последовательности белков, транслируемых в рамке считывания NS1 химерных гриппозных векторов, содержащих гетерологичный Nep от вируса А/Leningrad/134/47/57 (H2N2).

На Фиг.4 представлены данные, демонстрирующие патогенность и ts-фенотип вирусов с гетерологичным Nep геном. В А показаны данные репродукции вирусов при оптимальной 34°C и повышенной 39°C температуре в клетках Vero. В Б представлены данные репродукции вирусов в легких мышей на 2-е сутки после заражения.

На Фиг.5 приведены графики, демонстрирующие летальность мышей после однократной иммунизации векторами, экспрессирующими части субъединицы НА2 с рамки считывания белка NS1, и контрольного заражения гетерологичными патогенными штаммами вируса гриппа. В А показана летальность при контрольном заражении вирусом A/Mississippi/85/1(H3N2), в В - летальность при контрольном заражении вирусом В/ Lee/40.

На Фиг.6 представлены данные по онколитическому действию рекомбинантных вирусов гриппа в отношении меланомы мышей, индуцированной введением 1х10⁶ клеток В16 в стопу задней лапы. Терапия проводилась путем внутриопухолевого введения вируса на 5 день после имплементации опухоли. В А представлен средний размер стопы на 20 день после имплементации опухоли и 4х-кратной терапии онколитическими векторами, в Б - выживаемость мышей после проведенной 4х-кратной терапии онколитическими векторами.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к полученным генно-инженерными методами аттенуированным вирусам гриппа A, которые могут применяться для лечения и/или профилактики инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний.

В частности, настоящее изобретение относится к аттенуированному вирусу гриппа А, индуцирующему кросс-протективный ответ против вируса гриппа A и В, содержащему химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, происходящую от подтипа вируса гриппа А, отличающегося от подтипа указанного аттенуированного вируса гриппа А. Таким образом, подтип вируса А для последовательности, кодирующей укороченный белок NS1, отличается от подтипа вируса А, из которого получена последовательность, кодирующая белок Nep. В частности, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к аттенуированному вирусу гриппа А, в котором указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетeрологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа от H2 до Н18 человеческого или животного происхождения.

Указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 80-130 аминокислотных остатков, более предпочтительно, указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка.

Настоящее изобретение основано в частности на том, что авторы неожиданно обнаружили, что проблема недостаточной аттенуации (отсутствие температурочувствительности и высокий уровень репродукции в легких мышей) гриппозных векторов, в частности вектора NS1-124, может быть решена с помощью модификации второго сплайсированного белкового продукта NS геномного фрагмента вируса гриппа – белка Nep (NS2). Ока