Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы

Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в лекарственном средстве, таком как терапевтическое и/или профилактическое средство, против рака поджелудочной железы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Злокачественная опухоль является основной причиной смерти. Это заболевание в настоящее время лечат в основном с помощью хирургического вмешательства в комбинации с лучевой терапией или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов или открытие новых средств против злокачественной опухоли в последнее время, исход существующих способов лечения злокачественных опухолей улучшился в недостаточной мере, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате последних достижений в молекулярной биологии и иммунологии злокачественных опухолей, были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, гены, кодирующие такие антигены злокачественных опухолей, что увеличило ожидания в отношении специфической терапии злокачественной опухоли, нацеленной на антигены злокачественных опухолей (непатентный документ 1).

Для уменьшения неблагоприятных явлений терапии злокачественной опухоли, желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, редко встречались в нормальных клетках, но специфически существовали в злокачественных клетках. В 1991 году, Boon et al (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-положительными Т-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реактивные в отношении злокачественных опухолей (непатентный документ 2). В дальнейшем был описан способ SEREX (серологическая идентификация антигенов путем рекомбинантного клонирования на основе экспрессии), который основан на подходе клонирования генов на основе экспрессии, для идентификации опухолевых антигенов, распознаваемых антителами, продуцированными в ответ на аутологичную злокачественную опухоль in vivo у пациента со злокачественной опухолью (непатентный документ 3 и патентный документ 1). С помощью этого способа были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые редко экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в злокачественных клетках (непатентные документы 4-9). Кроме того, проводятся клинические испытания клеточной терапии с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, или иммунотерапии, специфичной в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин и т.п., содержащих антигены злокачественных опухолей.

В последние годы во всем мире были выпущены различные лекарственные средства на основе антител для лечения злокачественных опухолей, которые нацелены на антигенные белки на злокачественных клетках. Эти лекарственные средства привлекли внимание вследствие их определенной эффективности в качестве терапевтических средств, специфичных к злокачественной опухоли. Однако большинство антигенных белков, на которые нацелены лекарственные средства, также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антител повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, что является отрицательным результатом и приводит к неблагоприятным явлениям. Следовательно, можно ожидать, что если бы можно было идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественных клеток, и использовать антитела, нацеленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, тогда эти лекарственные средства на основе антител обеспечивали бы лечение, вызывая меньше неблагоприятных явлений. С точки зрения технических общих принципов, специалистам в данной области известно, что рак поджелудочной железы трудно лечить. Эффективное лекарственное средство, обладающее достаточными эффектами на рак поджелудочной железы, еще не было разработано.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен в качестве внутриклеточного белка, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся клеток и формирует внутриклеточные стрессовые гранулы с внутриклеточной РНК для участия в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфически экспрессируется на поверхности злокачественных клеток, таких как клетки рака молочной железы, и, таким образом, его исследуют в качестве мишени для лекарственных средств на основе антител для лечения злокачественных опухолей (патентный документ 2). Однако в патентном документе 2, не подтверждается, что CAPRIN-1 экспрессируется на клетках рака поджелудочной железы, и ни описано, ни предложено, что CAPRIN-1 может служить в качестве антигенного белка для рака поджелудочной железы.

Список литературы

Патентная литература

Патентный документ 1: Патент США № 5698396.

Патентный документ 2: Международная публикация № WO 2010/016526.

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 551-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan).

Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991).

Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995).

Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997).

Непатентный документ 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998).

Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998).

Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999).

Непатентный документ 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996).

Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genet 6: 33-39 (1997).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМА, РЕШАЕМАЯ НАСТОЯЩИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Задачей настоящего изобретения является идентификация антигенного белка злокачественной опухоли, специфически экспрессируемого на поверхности клеток рака поджелудочной железы, и обеспечение применения антитела, нацеленного на этот белок, в качестве терапевтического и/или профилактического средства против рака поджелудочной железы.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ

В результате тщательных исследований, авторы настоящего изобретения получили кДНК, кодирующую белок, специфически связывающийся с антителом, находящимся в сыворотке, полученной от организма, имеющего опухоль, с помощью способа SEREX, используя библиотеки кДНК, происходящей из ткани семенников собак, и сыворотки от собак со злокачественной опухолью молочной железы, а затем получили CAPRIN-1, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, и большое количество антител против этих белков CAPRIN-1, исходя из полученного гена и его гомологичных генов человека, животных семейства бычьих, лошади, мыши и курицы. Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что сегменты белка CAPRIN-1 специфически экспрессируются на поверхности клеток рака поджелудочной железы, и также открыли, что антитело против CAPRIN-1 повреждает клетки рака поджелудочной железы, экспрессирующие CAPRIN-1. На основании этих открытий, было осуществлено настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение имеет следующие аспекты:

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, содержащей в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, которые специфически обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1 или его фрагмента, содержащего 7-12 или более последовательно расположенных аминокислотных остатков.

В одном варианте осуществления белок CAPRIN-1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 97-99% или более идентичностью последовательности с этой аминокислотной последовательностью.

В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

В следующем варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

В следующем варианте осуществления антитело представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 273, 266, 270, 272 или 269, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 97-99% или более идентичностью последовательности с этой аминокислотной последовательностью, или его фрагмента.

В следующем варианте осуществления антитело представляет собой любое из следующих антител (a)-(y) и обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, или фармацевтическая композиция предназначена для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы и характеризуется антителом в качестве эффективного ингредиента:

(a) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области (CDR) SEQ ID NO: 37, 38 и 39 и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 41, 42 и 43;

(b) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 47, 48 и 49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 51, 52 и 53;

(c) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 57, 58 и 59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 61, 62 и 63;

(d) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 67, 68 и 69, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 71, 72 и 73;

(e) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 77, 78 и 79, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 81, 82 и 83;

(f) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 87, 88 и 89, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 91, 92 и 93;

(g) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 97, 98 и 99, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 101, 102 и 103;

(h) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 107, 108 и 109, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 111, 112 и 113;

(i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 117, 118 и 119, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 121, 122 и 123;

(j) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 127, 128 и 129, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 121, 122 и 123;

(k) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 132, 133 и 134, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 136, 137 и 138;

(l) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 142, 143 и 144, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 146, 147 и 148;

(m) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 142, 143 и 144, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 152, 153 и 154;

(n) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 157, 158 и 159, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 161, 162 и 163;

(o) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 171, 172 и 173;

(p) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 177, 178 и 179;

(q) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 182, 183 и 184;

(r) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 187, 188 и 189;

(s) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 167, 168 и 169, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 192, 193 и 194;

(t) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 197, 198 и 199, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 201, 202 и 203;

(u) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 207, 208 и 209, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 211, 212 и 213;

(v) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 217, 218 и 219, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 221, 222 и 223;

(w) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 227, 228 и 229, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 231, 232 и 233;

(x) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 237, 238 и 239, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 241, 242 и 243; и

(y) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 247, 248 и 249, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO: 251, 252 и 253.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения антитело или его фрагмент конъюгированы с противоопухолевым средством.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации, содержащей фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, включающему введение фармацевтической композиции или фармацевтической комбинации по настоящему изобретению индивидууму.

Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, повреждает клетки рака поджелудочной железы. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 является пригодным для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитело против белка CAPRIN-1, в частности, полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, используемое в рамках настоящего изобретения, можно оценивать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования роста опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования ex vivo присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, проявляемой антителом против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих белки, состоящий из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO с четными номерами (т.е. SEQ ID NO: 2, 4, 6, …, 28 и 30) среди SEQ ID NO: 2-30, представлены в SEQ ID NO с нечетными номерами (т.е. SEQ ID NO: 1, 3, 5, …, 27 и 29) среди SEQ ID NO: 1-29, соответственно.

Аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и 14 в списке последовательностей, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в качестве полипептидов, специфически связывающихся с антителами, присутствующими в сыворотке собаки, имеющей опухоль; аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 2 и 4, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в качестве их гомологичных факторов (гомологов или ортологов) человека; аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 16, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1, выделенную в качестве их гомологичного фактора животных семейства бычьих; аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 18, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1, выделенную в качестве их гомологичного фактора лошади; аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 20-28, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в качестве их гомологичных факторов мыши; и аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 30, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1, выделенную в качестве их гомологичного фактора курицы (см. пример 1, описанный ниже). Известно, что CAPRIN-1 экспрессируется при активации или делении покоящихся нормальных клеток.

Исследование в рамках настоящего изобретения показало, что белок CAPRIN-1 экспрессируется на поверхности клеток рака поджелудочной железы. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно используют антитело, связывающееся с участком в каждой молекуле белка CAPRIN-1, экспрессируемым на поверхности клеток рака поджелудочной железы. Примеры частичного пептида белка CAPRIN-1, экспрессируемого на поверхности клеток рака поджелудочной железы, включают полипептиды, каждый из которых состоит из 7-12 или более, например, 8-11 или более, последовательно расположенных аминокислотных остатков в области номеров аминокислотных остатков (а.к.) 50-98, номеров аминокислотных остатков (а.к.) 233-343, или от номера аминокислотного остатка (а.к.) 527 до C-конца аминокислотной последовательности, соответствующей любому четному числу (за исключением SEQ ID NO: 6 и 18) среди SEQ ID NO: 2-30 в списке последовательностей, и конкретно включают: аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 271 или 273 (предпочтительно, например, область аминокислотной последовательности, соответствующая SEQ ID NO: 274 или 275 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 273); аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 266 (предпочтительно, например, область аминокислотной последовательности, соответствующая SEQ ID NO: 267 или 268 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 266), 270, 272 или 269 в качестве частичного пептида белка CAPRIN-1, экспрессируемого на поверхности злокачественных клеток; и аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более, например, 96% или более, 97% или более, 98% или более, или 99% или более идентичностью последовательности с любой из указанных выше аминокислотных последовательностей. Антитело, используемое в рамках настоящего изобретения, включает все антитела, которые связываются с этими пептидами и проявляют противоопухолевую активность.

Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, может представлять собой любой тип антитела, который проявляет противоопухолевую активность, и включает, например, моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, например, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, диантитело и триантитело), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), антитела человека и их фрагменты антител, например, Fab, F(ab')₂ и Fv. Эти антитела и их фрагменты можно получать способами, в основном известными специалистам в данной области. Желательно, антитело в соответствии с настоящим изобретением представляет собой антитело, способное специфически связываться с белком CAPRIN-1, и предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Можно использовать поликлональное антитело при условии, что могут стабильно продуцироваться гомогенные антитела. В случае, когда индивидуумом является человек, является желательным антитело человека или гуманизированное антитело для предотвращения или подавления отторжения.

Как используют в рамках изобретения, выражение "специфическое связывание с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфически связывается с белком CAPRIN-1, по существу без связывания с другими белками.

Антитело, которое можно использовать в рамках настоящего изобретения, можно исследовать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования роста опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования in vitro присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, которую проявляет антитело против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Индивидуумом, которому проводят лечение и/или профилактику рака поджелудочной железы в соответствии с настоящим изобретением, является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, скот или спортивное животное, предпочтительно человек.

Далее, описано получение антигена, получение антитела и фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением.

Получение антигена для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, не ограничиваются видом животного, служащего их источником, включая, например, людей, собак, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс или кур. Однако, белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительными являются белки, происходящие из млекопитающих. В частности, предпочтительными являются белки, происходящие из человека. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их частичные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов могут быть получены, например, путем доступа в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

В соответствии с настоящим изобретением, в тех случаях, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1 человека используют в качестве основной последовательности, мишенями являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно, на 80%-100%, более предпочтительно, на 90%-100%, и, еще более предпочтительно, на 95%-100%, например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части эталонной последовательности. Как используют в рамках изобретения, термин "% идентичность последовательностей" означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или оснований), от общего числа аминокислот (или оснований), когда две последовательности выравнивают так, чтобы могла достигаться максимальная степень сходства или идентичность, с внесением пропусков или без него.

Фрагменты каждого белка CAPRIN-1 имеют длину в диапазоне от аминокислотной длины эпитопа (или антигенной детерминанты), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, до менее чем полноразмерного белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно людей. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислотных остатков, например, 8-11 аминокислотных остатков. Его конкретные примеры включают аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 273, 266, 270, 272 или 269, и аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще предпочтительно 95% или более, еще более предпочтительно 97-99% или более идентичностью последовательности с этой аминокислотной последовательностью.

Полипептиды, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил) или способ tBoc (трет-бутилоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также эти пептиды могут быть синтезированы общепринятыми способами с использованием целого ряда коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов.

Альтернативно можно получать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, с использованием подходов генной инженерии, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.) и встраивать их в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева, так чтобы клетки-хозяева продуцировали полипептиды. Таким образом, можно получать представляющие интерес полипептиды.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, легко могут быть получены с помощью подходов генной инженерии, известных в данной области, или общепринятых способов с использованием коммерчески доступных устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, можно получать с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1. Условия реакции для этой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, но не ограничиваются ими, 30 циклов, каждый из которых вовлекает стадии реакции, состоящие из: 94°C в течение 30 секунд (денатурация); 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг); и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимераза) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Подход ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также можно получать соответствующие зонды или праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях и аминокислотных последовательностях, соответствующих SEQ ID NO: 1-30 в списке последовательностей, представленном в настоящем описании, и использовать при скрининге, например, библиотеки кДНК человека, для выделения желаемой ДНК. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белки, представленные в SEQ ID NO: 2-30 с четными номерами. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников или из злокачественных опухолей, или из опухолей, таких как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких, рак ободочной и прямой кишки, и рак поджелудочной железы. Эти действия, включающие получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области, и они могут быть выполнены в соответствии со способами, описанными, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (ibid.). Из ДНК, полученных таким образом, можно получать ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека и их частичные пептиды.

Клетки-хозяева могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваясь ими: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичников китайского хомячка CHO; линию клеток эмбриональной почки человека HEK293; линию клеток эмбриональной кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как почкующиеся дрожжи и делящиеся клетки дрожжей; клетки тутового шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus.

В тех случаях, когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используемый экспрессирующий вектор имеет ориджин, который позволяет репликацию в прокариотических клетках, промотор, участок связывания с рибосомой, участок множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ген ауксотрофной комплементарности и т.п. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, экспрессирующие системы pET и экспрессирующие системы pGEX. ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептиды, кодируемые этими ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом полипептиды могут быть экспрессированы в качестве белков, слитых с другими белками.

В тех случаях, когда в качестве клеток-хозяев используют эукариотические клетки, в качестве экспрессирующих векторов используют экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, участок добавления поли(А) и т.п. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогично тому, как описано выше, ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы в эукариотических клетках-хозяевах экспрессировались полипептиды, кодируемые этими ДНК. В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы, такие как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептиды могут быть экспрессированы в качестве различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP и т.п.

Экспрессирующие векторы можно вводить в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, инфицирование вирусом, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Представляющий интерес полипептид можно выделять и очищать из клеток-хозяев с помощью комбинации методик разделения, известных в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, обработку денатурирующим веществом (например, мочевина) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращено-фазовую хроматографию.

Структура антитела

В основном, антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, каждый из которых содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Антитела, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером приблизительно 150 кДа, каждый из которых содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном конце, за которым следует несколько последовательно расположенных константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи расположена параллельно первой константной области тяжелой цепи, в то время как вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Конкретные области вариабельного домена антитела, которые называются "определяющими комплементарность областями (CDR)", демонстрируют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Относительно консервативные участки в вариабельной области называются "каркасными областями (FR)". Каждый полный вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи содержит четыре FR, соединенные друг с другом посредством трех CDR. Эти три CDR обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, в указанном порядке от N-конца тяжелой цепи. Аналогично, в легкой цепи CDR обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 наиболее важна для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются вблизи друг от друга FR областями, и они вносят вклад в формирование антигенсвязывающего центра в антителе вместе с CDR на другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитела с антигеном, однако они проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечение в антителозависимую клеточноопросредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредуемый связыванием с Fcγ-рецептором, период полужизни/скорость выведения через неонатальный Fc рецептор (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC) через компонент C1q в каскаде реакций системы комплемента.

Получение антитела

Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полноразмерного белка CAPRIN-1 или его фрагмента.

Как используют в рамках изобретения, "иммунологическая реактивность" означает свойство антитела связываться с антигеном CAPRIN-1 in vivo. Путем такого связывания антитело проявляет функцию повреждения (например, уничтожения, подавления или регрессии) опухоли. В частности, тип антитела, используемого в рамках настоящего изобретения, не ограничен при условии, что антитело может повреждать рак поджелудочной железы в результате связывания с белком CAPRIN-1.

Примеры антитела включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Также антитело представляет собой любой класс молекулы иммуноглобулина, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любой подкласс, например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ или IgA₂.

Кроме того, антитело может быть модифицировано ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, пегилированием и т.п., в дополнение к гликозилированию.

Далее описаны примеры получения различных антител.

Когда антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, например, белок CAPRIN-1, клетки рака поджелудочной железы, экспрессирующие CAPRIN-1, или их клеточную линию (например, Capan-2), вводят каждой мыши для иммунизации. Из этих мышей извлекают селезенку. После выделения клеток селезенки клетки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Из полученных слитых клеток (гибридом) отбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток (гибридомы). Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток, выделяют и культивируют. Представляющее интерес антитело можно получать путем очистки из культурального супернатанта в соответствии с общим способом аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, можно получать, например, следующим образом: сначала животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном способом, известным в данной области. Этот способ иммунизации обычно включает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разбавляют или суспендируют в PBS (фосфатно-буферный солевой раствор), физиологическом растворе и т.п. до получения в результате подходящего количества, а затем смешивают, если желательно, с соответствующим количеством общепринятого адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования полученную эмульсию вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые от 4 до 21 суток. Альтернативно для иммунизации сенсибилизирующими антигенами можно использовать подходящий носитель.

После подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке млекопитающего, иммунизированного таким образом, иммуноциты