Композиции и способы, имеющие отношение к мутантному токсину из clostridium difficile

Композиции и способы, имеющие отношение к мутантному токсину из clostridium difficile

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 61/716605, поданной 21 октября 2012 г., которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, имеющим отношение к мутантным токсинам из Clostridium difficile.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Clostridium difficile (С. difficile) представляет собой грамположительную анаэробную бактерию, которую ассоциируют с желудочно-кишечным заболеванием у людей. Колонизация С. difficile обычно происходит в толстой кишке, если природная кишечная флора сокращается в результате лечения антибиотиками. Инфекция может приводить к антибиотикоассоциированной диарее и иногда к псевдомембранозному колиту вследствие выделения гликозилированных токсинов, токсина А и токсина В (308 и 270 кДа, соответственно), которые являются первичными факторами вирулентности С. difficile.

Токсин А и токсин В кодируются в пределах локуса патогенности (PaLoc) размером 19 тысяч оснований (т.о.) генами tcdA и tcdB, соответственно. В непатогенных штаммах С. difficile этот локус заменен альтернативной последовательностью, состоящей из 115 пар оснований.

Токсин А и токсин В оба являются мощными цитотоксинами. Эти белки гомологичны глюкозилтрансферазам, которые инактивируют малые ГТФазы (гуанозинтрифосфатазы) семейства Rho/Rac/Ras. Вытекающий из этого сбой в передаче сигналов вызывает утрату межклеточных контактов, нарушение регуляции актинового цитоскелета и/или апоптоз, что приводит к секреторной диарее в тяжелой форме, которая ассоциирована с инфекциями Clostridium difficile (CDI).

За последнее десятилетие число и тяжесть вспышек заболеваний, обусловленных С. difficile, в больницах, лечебно-реабилитационных центрах для престарелых и инвалидов и других лечебных учреждениях для хронических больных резко возросло. Ключевые факторы этого возрастания включают появление гипервирулентных патогенных штаммов, более широкое применение антибиотиков, усовершенствование методов обнаружения и увеличение случаев контакта с источниками спор, передающихся воздушно-капельным путем, в медицинских учреждениях.

Применение метронидазола и ванкомицина представляет собой принятый в настоящее время стандарт оказания медицинской помощи по лечению антибиотиками заболевания, ассоциированного с С. difficile (CDAD). Однако примерно у 20% пациентов, получающих такое лечение, случается рецидив инфекции после первого эпизода CDI, и примерно до 50% этих пациентов страдают от повторных рецидивов. Лечение рецидивов представляет собой очень серьезную проблему, и большинство рецидивов обычно происходит в течение одного месяца с момента предшествующего эпизода.

Соответственно, существует потребность в иммуногенных и/или терапевтических композициях и способах, которые направлены на С. difficile.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эти и другие задачи решаются настоящим изобретением.

В одном из аспектов изобретение относится к мутантному токсину А из С. difficile. Мутантный токсин А содержит мутацию в остатках по положениям 285, 287, 700, 972 и 978 по сравнению с токсином А дикого типа. В одном из воплощений мутантный токсин А содержит SEQ ID NO: 183. В одном из воплощений мутантный токсин А является менее цитотоксичным, чем соответствующий токсин А дикого типа. В одном из воплощений мутантный токсин А содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, который химически модифицирован. В одном из аспектов изобретение относится к выделенному полипептиду, который содержит SEQ ID NO: 183.

В другом аспекте изобретение относится к мутантному токсину В из С. difficile. Мутантный токсин В содержит мутацию в остатках 286, 288, 698, 970 и 976 по сравнению с токсином В дикого типа. В одном из воплощений мутантный токсин В содержит SEQ ID NO: 184. В одном из воплощений мутантный токсин В является менее цитотоксичным, чем соответствующий токсин В дикого типа. В одном из воплощений мутантный токсин В содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, который химически модифицирован. В одном из аспектов изобретение относится к выделенному полипептиду, который содержит SEQ ID NO: 184.

Изобретение также относится к композициям и способам для применения при культивировании С. difficile и получении токсинов С. difficile. В одном из аспектов изобретение относится к культуральной среде, включающей гидролизат растительных белков и клетку С. difficile. В предпочтительном воплощении гидролизатом является гидролизат сои. Более предпочтительно, гидролизат сои представляет собой гидролизат сои SE50MK.

В другом аспекте изобретение относится к культуральной среде, включающей источник азота и клетку С. difficile. В одном из воплощений источником азота является дрожжевой экстракт. Предпочтительно, дрожжевой экстракт представляет собой HY YEST 412 (Kerry Biosciences).

В следующем аспекте изобретение относится к культуральной среде, включающей гидролизат растительных белков, дрожжевой экстракт и клетку С. difficile. В одном из воплощений среда не содержит источника углерода.

В предпочтительном воплощении среда дополнительно содержит источник углерода. Авторы изобретения открыли, что ферментация С. difficile в культуральной среде, содержащей по меньшей мере один источник углерода, обеспечивает высокие значения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀) и высокие выходы по продукту токсину по сравнению с ферментацией в отсутствие источника углерода. В одном из воплощений источником углерода является глюкоза, маннит, фруктоза и/или манноза.

В одном из воплощений клетка С. difficile не является генетически модифицированной. В другом воплощении клетка С. difficile является рекомбинантной клеткой С. difficile. В одном из воплощений в клетке С. difficile отсутствует эндогенный полинуклеотид, кодирующий токсин. В другом воплощении эта клетка содержит конститутивный промотор. В предпочтительном воплощении промотор представляет собой промотор фередоксина (fdx) Clostridium sporogenes. В дополнительном воплощении эта клетка не содержит нативного, регулируемого хромосомального промотора.

В другом аспекте изобретение относится к способу культивирования С. difficile. Способ включает культивирование клетки С. difficile в среде. В одном из воплощений среда содержит гидролизат сои и/или дрожжевой экстракт. В предпочтительном воплощении среда дополнительно содержит источник углерода. Предпочтительно, источником углерода является глюкоза.

В одном из воплощений стадию культивирования осуществляют в анаэробных условиях.

В одном из воплощений С. difficile выращивают в качестве посевной культуры. В одном из воплощений выращивание посевной культуры начинают путем инокуляции исходной культурой, которая была выращена в данной среде.

В одном из воплощений С. difficile выращивают в качестве ферментируемой культуры. В одном из воплощений ферментируемую культуру инокулируют посевной культурой, которая была выращена в данной среде. В альтернативном аспекте изобретение относится к способу культивирования С. difficile. Способ включает культивирование клетки С. difficile в среде для моноклональных антител (mAb).

В одном из аспектов изобретение относится к способу получения токсина С. difficile. Способ включает культивирование клетки С. difficile в среде. Способ дополнительно включает выделение токсина С. difficile из указанной среды.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1А-Н. Выравнивание последовательностей токсина А С. difficile дикого типа из штаммов 630, VPI10463, R20291, CD196 и мутантного токсина А, имеющего SEQ ID NO: 4, с использованием выравнивания CLUSTALW с параметрами по умолчанию.

Фиг. 2A-F. Выравнивание последовательностей токсина В дикого типа С. difficile из штаммов 630, VPI10463, R20291, CD196 и мутантного токсина В, имеющего SEQ ID NO: 6, с использованием выравнивания CLUSTALW с параметрами по умолчанию.

Фиг. 3. График, показывающий идентификацию токсин-негативных штаммов С. difficile дикого типа. Культуральные среды 13 штаммов С. difficile тестировали посредством ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ) в отношении токсина А. Как проиллюстрировано, семь штаммов экспрессировали токсин А, а 6 штаммов нет (штаммы 1351, 3232, 7322, 5036, 4811 и VPI 11186).

Фиг. 4А и В. Результаты SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), иллюстрирующие, что тройной мутант A (SEQ ID NO: 4), двойной мутант В (SEQ ID NO: 5) и тройной мутант В (SEQ ID NO: 6) не глюкозилируют ГТФазы Rac1 или RhoA в анализах глюкозилирования in vitro с использованием уридиндифосфат(УДФ)-¹⁴С-глюкозы; тогда как токсин В дикого типа в количестве от 10 мкг до 1 нг глюкозилирует Rac1.

Фиг. 5. Вестерн-блот, показывающий устранение активности цистеиновой протеазы у мутантных токсинов А и В (SEQ ID NO: 4 и 6, соответственно) по сравнению с наблюдаемыми фрагментами расщепления токсинов А и В дикого типа (SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно). См. пример 13.

Фиг. 6. Графики, показывающие, что тройные мутантные токсины А и В (SEQ ID NO: 4 и 6, соответственно) демонстрируют остаточную цитотоксичность при тестировании в высоких концентрациях (например, приблизительно 100 мкг/мл) в анализе цитотоксичности in vitro на клетках IMR-90.

Фиг. 7. График, показывающий, что величины ЕС₅₀ аналогичны для тройного мутантного токсина В (SEQ ID NO: 6) и мутантного по семи положениям токсина В (SEQ ID NO: 8).

Фиг. 8. График, представляющий результаты тестирований цитотоксичности in vitro, на котором изображена зависимость уровней АТФ (аденозинтрифосфат) (RLU) от возрастающих концентраций тройного мутантного TcdA (SEQ ID NO: 4) (верхняя панель) и тройного мутантного TcdB (SEQ ID NO: 6) (нижняя панель). Остаточную цитотоксичность мутантного токсина А и В можно полностью устранить, используя нейтрализующие антитела, специфичные к мутантному токсину А (верхняя панель - рАb (поликлональное антитело) А и mAb А3-25+А60-22) и к мутантному токсину В (нижняя панель - рАb В).

Фиг. 9. Изображения морфологического строения клеток IMR-90 через 72 часа после обработки. На панели А показаны ложнообработанные контрольные клетки. На панели В показано морфологическое строение клеток после обработки мутантным TcdB (SEQ ID NO: 6), инактивированным формалином. На панели С показано морфологическое строение клеток после обработки мутантным TcdB (SEQ ID NO: 6), инактивированным EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид). На панели D показано морфологическое строение клеток после обработки токсином В дикого типа (SEQ ID NO: 2). На панели Ε показано морфологическое строение клеток после обработки тройным мутантным TcdB (SEQ ID NO: 6). Схожие результаты наблюдали для обработок с использованием TcdA.

Фиг. 10. График, показывающий титры нейтрализующих антител, как описано в примере 25 (исследование muCdiff2010-06).

Фиг. 11А-В. График, показывающий титры нейтрализующих антител, как описано в примере 26 (исследование muCdiff2010-07).

Фиг. 12. График, показывающий нейтрализующие антительные ответы на токсины А и В у хомяков после четырех иммунизаций, как описано в примере 27 (исследование hamС. difficile2010-02).

Фиг. 13А-В. График, показывающий нейтрализующие антительные ответы у хомяков после вакцинации химически инактивированными генетически мутантными токсинами и токсоидами от List Biologicals, как описано в примере 27 (исследование hamС. difficile e2010-02).

Фиг. 14. Кривые выживаемости для трех иммунизированных групп хомяков по сравнению с неиммунизированными контролями, как описано в примере 28 (исследование hamС. difficile 2010-02, продолжение).

Фиг. 15. График, показывающий относительный нейтрализующий антительный ответ на разные композиции мутантных токсинов из С. difficile у хомяков (исследование hamС. difficile 2010-03), как описано в примере 29.

Фиг. 16А-В. Графики, показывающие сильный относительный нейтрализующий антительный ответ на химически инактивированные генетически мутантные токсины А и В (SEQ ID NO: 4 и 6, соответственно) у яванских макак, как описано в примере 30.

Фиг. 17. Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей из mAb А3-25 IgE. Сигнальный пептид выделен в рамку; CDR (определяющие комплементарность участки) выделены курсивным шрифтом и подчеркнуты; константный участок выделен жирным шрифтом и подчеркнут (полная последовательность не показана).

Фиг. 18. График, показывающий титрование индивидуальных моноклональных антител к токсину А в анализе нейтрализации токсинов с использованием уровней АТФ (количественно определенных посредством относительных световых единиц (RLU)) в качестве индикатора жизнеспособности клеток. В случае сравнения с токсином (4×EC₅₀) в качестве в качестве контроля, моноклональные антитела (mAb) А80-29, А65-33, А60-22 и А3-25 показывали усиление нейтрализующего действия на токсин А при возрастании концентрации, но не достигали уровня кроличьего антитела к токсину А, взятого в качестве положительного контроля. MAb А50-10, А56-33 и А58-46 не оказывали нейтрализующего действия на токсин А. Для контроля, состоящего только из клеток, получали 1-1,5×10⁶ RLU.

Фиг. 19. Картирование 8 групп эпитопов токсина В для mAb с использованием BiaCore.

Фиг. 20А-С. Синергетические нейтрализующие активности комбинаций mAb к токсину А: добавление нейтрализующих антител А60-22, А65-33 и А80-29 в различных разведениях к mAb А3-25 в возрастающих концентрациях синергетически усиливало нейтрализацию токсина А независимо от разведения. Проиллюстрированы значения RLU для контроля, состоящего только из токсина А, (4×ЕС₅₀) (меньше 0,3×10⁶) и для контролей, состоящих только из клеток, которые составляли 2-2,5×10⁶ RLU, как изображено на графиках, показанных на Фиг. 20В и Фиг. 20С.

Фиг. 21. Синергетические нейтрализующие активности mAb к токсину В: нейтрализация токсина В под действием mAb 8-26, В60-2 и В59-3 проиллюстрирована на Фиг. 21 А. Нейтрализация токсина В синергетически возрастала после объединения В8-26 с В59-3 в разных разведениях (Фиг. 21В).

Фиг. 22. Вестерн-блот, показывающий, что экспрессия ГТФазы Rac1 ослаблена в экстрактах клеток, культивированных от 24 до 96 часов, обработанных генетически мутантным токсином В (SEQ ID NO: 6), но не в экстрактах клеток, обработанных токсином В дикого типа (SEQ ID NO: 2). Этот блот также показывает, что Rac1 глюкозилируется в обработанных токсином В экстрактах клеток, но не в экстрактах клеток, обработанных генетически мутантным токсином В.

Фиг. 23А-К. График, представляющий результаты тестирования цитотоксичности in vitro, на котором изображена зависимость уровней АТФ (RLU) от возрастающих концентраций: смеси культуральных сред для С. difficile и сывороток крови хомяков (■); смеси неочищенного токсина (сбора из культуральной среды) из соответствующего штамма и сывороток крови хомяков (●); смеси очищенного токсина (коммерческого препарата токсина, полученного от List Biologicals) и сывороток крови хомяков (▲); неочищенного токсина (▼) в качестве контроля и очищенного токсина (♦) в качестве контроля. Токсины из соответствующих штаммов добавляли к клеткам в концентрации 4×EC₅₀. Фиг. 23 показывает, что иммуногенная композиция, содержащая мутантный TcdA (SEQ ID NO: 4) и мутантный TcdB (SEQ ID NO: 6), причем мутантные токсины были инактивированы с использованием EDC согласно, например, примеру 29, Таблице 15, как изложено в данном описании, индуцировала нейтрализующие антитела, которые демонстрировали нейтрализующую активность в отношении токсинов по меньшей мере из следующих 16 разных штаммов С. difficile, полученных из Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), по сравнению с соответствующим контролем, состоящим только из токсина: 2007886 (Фиг. 23А), 2006017 (Фиг. 23 В), 2007070 (Фиг. 23С), 2007302 (Фиг. 23D), 2007838 (Фиг. 23Е), 2007886 (Фиг. 23F), 2009292 (Фиг. 23G), 2004013 (Фиг. 23Н), 2009141 (Фиг. 23I), 2005022 (Фиг. 23J), 2006376 (Фиг. 23К).

Фиг. 24. Иллюстрация типичной индуцированной EDC/NHS (N-гидроксисукцинимид) инактивации мутантных токсинов из С. difficile, в результате которой образуются по меньшей мере три возможных типа модификаций: сшивки, глициновые аддукты и бета-аланиновые аддукты. Панель А иллюстрирует образование сшивок. Карбоксильные группы тройных мутантных токсинов активируют путем добавления EDC и NHS. Активированные сложные эфиры взаимодействуют с первичными аминами с образованием стабильных амидных связей, в результате чего образуются внутри- и межмолекулярные сшивки. Панель В иллюстрирует образование глициновых аддуктов. После инактивации оставшиеся активированные эфиры гасят путем добавления глицина с образованием стабильных амидных связей. Панель С иллюстрирует образование бета-аланиновых аддуктов. Три моля NHS могут взаимодействовать с одним молем EDC с образованием активированного бета-аланина. Затем его приводят во взаимодействие с первичными аминами с образованием стабильных амидных связей.

Фиг. 25. Иллюстрация типичной EDC/NHS-индуцированной инактивации мутантных токсинов из С. difficile, в результате которой образуется по меньшей мере один из следующих типов модификаций: (А) сшивки, (В) глициновые аддукты и (С) бета-аланиновые аддукты.

Фиг. 26. График, представляющий результаты анализа цитотоксичности in vitro, на котором изображена зависимость уровней АТФ (RLU) (анализ АТФ, 72 ч) от возрастающих концентраций TcdB дикого типа, приобретенного у List Biologicals (□), тройного мутантного TcdB (SEQ ID NO: 86) (●) и мутантного по пяти положениям TcdB (SEQ ID NO: 184) (■). Клетки IMR-90 (*) использовали в качестве контроля.

Фиг. 27. График, показывающий конкурентное ингибирование опосредуемой тройным мутантным токсином В (SEQ ID NO: 86) цитотоксичности под действием мутантного по пяти положениям токсина В (SEQ ID NO: 184) на клетках IMR-90 (анализ АТФ, 72 ч). -●- представляет собой мутантный по пяти положениям токсин В (SEQ ID NO: 184) («РМ-В»); -▲- представляет собой тройной мутантный (ТМ) токсин в концентрации 200 нг/мл.

Фиг. 28. График, показывающий конечное значение OD и титр для тройного мутантного токсина В (мг/л) после перфузионной ферментации (CDF-5126). -●- представляет OD_{600 нм}; -▲- представляет скорость потока перфузионной жидкости (количество объемов ферментера/2,0 ч); -■- представляет глюкозу (г/л); -●- представляет токсоид В (тройной мутантный, SEQ ID NO: 86).

Фиг. 29. График, показывающий конечное значение OD и титр для тройного мутантного токсина В (мг/л), полученные в результате другого перфузионного культивирования (CDF-5127). -●- представляет OD_{600 нм}; -▲- скорость потока перфузионной жидкости (количество объемов ферментера/2,0 ч); -■- представляет глюкозу (г/л); -●- представляет токсоид В (тройной мутантный, SEQ ID NO: 86).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В SEQ ID NO: 1 приведена аминокислотная последовательность для токсина А из С. difficile (TcdA) 630 дикого типа.

В SEQ ID NO: 2 приведена аминокислотная последовательность для токсина В из С. difficile (TcdB) 630 дикого типа.

В SEQ ID NO: 3 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdA, имеющего мутацию в положениях 285 и 287, по сравнению с SEQ ID NO: 1.

В SEQ ID NO: 4 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdA, имеющего мутацию в положениях 285, 287 и 700, по сравнению с SEQ ID NO: 1.

В SEQ ID NO: 5 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdB, имеющего мутацию в положениях 286 и 288, по сравнению с SEQ ID NO: 2.

В SEQ ID NO: 6 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdB, имеющего мутацию в положениях 286, 288 и 698, по сравнению с SEQ ID NO: 2.

В SEQ ID NO: 7 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdA, имеющего мутацию в положениях 269, 272, 285, 287, 460, 462 и 700, по сравнению с SEQ ID NO: 1.

В SEQ ID NO: 8 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdB, имеющего мутацию в положениях 270, 273, 286, 288, 461, 463 и 698, по сравнению с SEQ ID NO: 2.

В SEQ ID NO: 9 приведена последовательность ДНК, кодирующую токсин А из С. difficile (TcdA) 630 дикого типа.

В SEQ ID NO: 10 приведена последовательность ДНК, кодирующую токсин В из С. difficile (TcdB) 630 дикого типа.

В SEQ ID NO: 11 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 3.

В SEQ ID NO: 12 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 4.

В SEQ ID NO: 13 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 5.

В SEQ ID NO: 14 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 6.

В SEQ ID NO: 15 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile R20291 дикого типа.

В SEQ ID NO: 16 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 15.

В SEQ ID NO: 17 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile CD196 дикого типа.

В SEQ ID NO: 18 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ IDNO: 17.

В SEQ ID NO: 19 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile VP110463 дикого типа.

В SEQ ID NO: 20 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 19.

В SEQ ID NO: 21 приведена аминокислотная последовательность для Tcd В из С. difficile R20291 дикого типа.

В SEQ ID NO: 22 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 21.

В SEQ ID NO: 23 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile CD196 дикого типа.

В SEQ ID NO: 24 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 23.

В SEQ ID NO: 25 приведена аминокислотная последовательность для TcdB С. difficile VP110463 дикого типа.

В SEQ ID NO: 26 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 25.

В SEQ ID NO: 27 приведена последовательность ДНК для локуса патогенности С. difficile VPI10463 дикого типа.

В SEQ ID NO: 28 приведена аминокислотная последовательность для остатков 101-293 в SEQ ID NO: 1.

В SEQ ID NO: 29 приведена аминокислотная последовательность для остатков 1-542 в SEQ ID NO: 1.

В SEQ ID NO: 30 приведена аминокислотная последовательность для остатков 101-293 в SEQ ID NO: 2.

В SEQ ID NO: 31 приведена аминокислотная последовательность для остатков 1-543 в SEQ ID NO: 2.

В SEQ ID NO: 32 приведена аминокислотная последовательность для остатков 543-809 в SEQ ID NO: 1.

В SEQ ID NO: 33 приведена аминокислотная последовательность для остатков 544-767 в SEQ ID NO: 2.

В SEQ ID NO: 34 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdA, где остатки 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655 и 700 могут представлять собой остатки любой аминокислоты.

В SEQ ID NO: 35 приведена аминокислотная последовательность для мутантного Tcd В, где остатки 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 и 751 могут представлять собой остатки любой аминокислоты.

В SEQ ID NO: 36 приведена аминокислотная последовательность для вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела для TcdA из С. difficile (mAb А3-25).

В SEQ ID NO: 37 приведена аминокислотная последовательность для вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела для TcdA из С. difficile (mAb А3-25).

В SEQ ID NO: 38 приведена аминокислотная последовательность для CDR1 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела для TcdA из С. difficile (mAb А3-25).

В SEQ ID NO: 39 приведена аминокислотная последовательность для CDR2 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела для TcdA из С. difficile (mAb А3-25).

В SEQ ID NO: 40 приведена аминокислотная последовательность для CDR3 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела для TcdA из С. difficile (mAb А3-25).

В SEQ ID NO: 41 приведена аминокислотная последовательность для CDR1 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела для TcdA из С. difficile (mAb А3-25).

В SEQ ID NO: 42 приведена аминокислотная последовательность для CDR2 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела для TcdA из С. difficile (mAb А3-25).

В SEQ ID NO: 43 приведена аминокислотная последовательность для CDR3 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела для TcdA из С. difficile (mAb А3-25).

В SEQ ID NO: 44 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 3.

В SEQ ID NO: 45 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ IDNO: 4.

В SEQ ID NO: 46 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 5.

В SEQ ID NO: 47 приведена последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 6.

В SEQ ID NO: 48 приведена нуклеотидная последовательность содержащего CpG (динуклеотид, состоящий из остатков цитозина и гуанидина, соединенных фосфатной группой) иммуностимулирующего олигонуклеотида ODN 24555.

В SEQ ID NO: 49 приведена аминокислотная последовательность для вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 50 приведена аминокислотная последовательность для сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 51 приведена аминокислотная последовательность для CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 52 приведена аминокислотная последовательность для CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 53 приведена аминокислотная последовательность для CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 54 приведена аминокислотная последовательность для константного участка вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 55 приведена аминокислотная последовательность для вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 56 приведена аминокислотная последовательность для сигнального пептида вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 57 приведена аминокислотная последовательность для CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 58 приведена аминокислотная последовательность для CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 59 приведена аминокислотная последовательность для CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В8-26).

В SEQ ID NO: 60 приведена аминокислотная последовательность для вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 61 приведена аминокислотная последовательность для сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 62 приведена аминокислотная последовательность для CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 63 приведена аминокислотная последовательность для CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 64 приведена аминокислотная последовательность для CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 65 приведена аминокислотная последовательность для константного участка вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 66 приведена аминокислотная последовательность для вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 67 приведена аминокислотная последовательность для сигнального пептида вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 68 приведена аминокислотная последовательность для CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 69 приведена аминокислотная последовательность для CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 70 приведена аминокислотная последовательность для CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В59-3).

В SEQ ID NO: 71 приведена аминокислотная последовательность для вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 72 приведена аминокислотная последовательность для сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 73 приведена аминокислотная последовательность для CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 74 приведена аминокислотная последовательность для CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 75 приведена аминокислотная последовательность для CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 76 приведена аминокислотная последовательность для константного участка вариабельной области тяжелой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 77 приведена аминокислотная последовательность для вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 78 приведена аминокислотная последовательность для сигнального пептида вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 79 приведена аминокислотная последовательность для CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 80 приведена аминокислотная последовательность для CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 81 приведена аминокислотная последовательность для CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела, нейтрализующего TcdB из С. difficile, (mAb В9-30).

В SEQ ID NO: 82 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdB, где остаток в положениях 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 и 751 может представлять собой остаток любой аминокислоты.

В SEQ ID NO: 83 приведена аминокислотная последовательность для мутантного TcdA, имеющего мутацию в положениях 269, 272, 285, 287, 460, 462 и 700, по сравнению с SEQ ID NO: 1, где метионин в положении 1 отсутствует.

В SEQ ID NO: 84 приведена аминокислотная последовательность для мутантного токсина А из С. difficile, имеющего мутацию в положениях 285, 287 и 700 по сравнению с SEQ ID NO: 1, где метионин в положении 1 отсутствует.

В SEQ ID NO: 85 приведена аминокислотная последовательность для мутантного токсина В из С. difficile, имеющего мутацию в положениях 270, 273, 286, 288, 461, 463 и 698, по сравнению с SEQ ID NO: 2, где метионин в положении 1 отсутствует.

В SEQ ID NO: 86 приведена аминокислотная последовательность для мутантного токсина В из С. difficile, имеющего мутацию в положениях 286, 288 и 698, по сравнению с SEQ ID NO: 2, где метионин в положении 1 отсутствует.

В SEQ ID NO: 87 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2004013 дикого типа.

В SEQ ID NO: 88 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2004111 дикого типа.

В SEQ ID NO: 89 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2004118 дикого типа.

В SEQ ID NO: 90 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2004205 дикого типа.

В SEQ ID NO: 91 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2004206 дикого типа.

В SEQ ID NO: 92 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2005022 дикого типа.

В SEQ ID NO: 93 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2005088 дикого типа.

В SEQ ID NO: 94 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2005283 дикого типа.

В SEQ ID NO: 95 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2005325 дикого типа.

В SEQ ID NO: 96 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2005359 дикого типа.

В SEQ ID NO: 97 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2006017 дикого типа.

В SEQ ID NO: 98 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2007070 дикого типа.

В SEQ ID NO: 99 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2007217 дикого типа.

В SEQ ID NO: 100 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2007302 дикого типа.

В SEQ ID NO: 101 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2007816 дикого типа.

В SEQ ID NO: 102 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2007838 дикого типа.

В SEQ ID NO: 103 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2007858 дикого типа.

В SEQ ID NO: 104 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2007886 дикого типа.

В SEQ ID NO: 105 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2008222 дикого типа.

В SEQ ID NO: 106 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2009078 дикого типа.

В SEQ ID NO: 107 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2009087 дикого типа.

В SEQ ID NO: 108 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2009141 дикого типа.

В SEQ ID NO: 109 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 2009292 дикого типа.

В SEQ ID NO: 110 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2004013 дикого типа.

В SEQ ID NO: 111 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2004111 дикого типа.

В SEQ ID NO: 112 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2004118 дикого типа.

В SEQ ID NO: 113 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2004205 дикого типа.

В SEQ ID NO: 114 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2004206 дикого типа.

В SEQ ID NO: 115 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2005022 дикого типа.

В SEQ ID NO: 116 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2005088 дикого типа.

В SEQ ID NO: 117 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2005283 дикого типа.

В SEQ ID NO: 118 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2005325 дикого типа.

В SEQ ID NO: 119 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2005359 дикого типа.

В SEQ ID NO: 120 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2006017 дикого типа.

В SEQ ID NO: 121 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2006376 дикого типа.

В SEQ ID NO: 122 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2007070 дикого типа.

В SEQ ID NO: 123 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2007217 дикого типа.

В SEQ ID NO: 124 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2007302 дикого типа.

В SEQ ID NO: 125 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2007816 дикого типа.

В SEQ ID NO: 126 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2007838 дикого типа.

В SEQ ID NO: 127 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2007858 дикого типа.

В SEQ ID NO: 128 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2007886 дикого типа.

В SEQ ID NO: 129 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2008222 дикого типа.

В SEQ ID NO: 130 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2009078 дикого типа.

В SEQ ID NO: 131 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2009087 дикого типа.

В SEQ ID NO: 132 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2009141 дикого типа.

В SEQ ID NO: 133 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 2009292 дикого типа.

В SEQ ID NO: 134 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 014 дикого типа.

В SEQ ID NO: 135 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 015 дикого типа.

В SEQ ID NO: 136 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 020 дикого типа.

В SEQ ID NO: 137 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 023 дикого типа.

В SEQ ID NO: 138 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 027 дикого типа.

В SEQ ID NO: 139 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 029 дикого типа.

В SEQ ID NO: 140 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 046 дикого типа.

В SEQ ID NO: 141 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 014 дикого типа.

В SEQ ID NO: 142 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 015 дикого типа.

В SEQ ID NO: 143 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 020 дикого типа.

В SEQ ID NO: 144 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 023 дикого типа.

В SEQ ID NO: 145 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 027 дикого типа.

В SEQ ID NO: 146 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 029 дикого типа.

В SEQ ID NO: 147 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 046 дикого типа.

В SEQ ID NO: 148 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 001 дикого типа.

В SEQ ID NO: 149 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 002 дикого типа.

В SEQ ID NO: 150 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 003 дикого типа.

В SEQ ID NO: 151 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 004 дикого типа.

В SEQ ID NO: 152 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 070 дикого типа.

В SEQ ID NO: 153 приведена аминокислотная последовательность для Tc из С. difficile 075 дикого типа.

В SEQ ID NO: 154 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 077 дикого типа.

В SEQ ID NO: 155 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 081 дикого типа.

В SEQ ID NO: 156 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 117 дикого типа.

В SEQ ID NO: 157 приведена аминокислотная последовательность для TcdA из С. difficile 131 дикого типа.

В SEQ ID NO: 158 приведена аминокислотная последовательность для TcdB из С. difficile 001 дикого типа.

В SEQ ID NO: 159 приведена аминокислотная последовательность д