Слитые белки для применения в качестве иммуногенных усиливающих агентов для индуцирования антигенспецифического т-клеточного ответа

Слитые белки для применения в качестве иммуногенных усиливающих агентов для индуцирования антигенспецифического т-клеточного ответа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится в целом к слитым белкам, и более конкретно - к слитым белкам для усиления опосредованных Т-клетками иммунных ответов.

Предшествующий уровень техники

Молекулярная биология обеспечила производство субъединичных вакцин, в которых иммуноген является фрагментом или субъединицей исходного белка или комплекса. Желательна разработка стабильной вакцины, которая могла бы вызвать ответы, опосредованные сенсибилизированными Т-клетками, и которая была бы достаточно гибкой для включения в нее последовательностей из многих штаммов инфекционных агентов.

Сущность изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему:

(a) домен связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК) или домен связывания с рецептором CD91, расположенный на N-конце слитого белка;

(b) домен трансдукции белка, расположенный на С-конце домена связывания с АПК или домена связывания с рецептором CD91, причем домен трансдукции белка выбран из группы, состоящей из:

(i) слитого полипептида, содержащего пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, линкер и транслокационный пептид, причем:

(1) пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, расположен на N-конце слитого полипептида;

(2) линкер содержит последовательность SEQ ID NO: 15, связывающую пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, и транслокационный пептид; и

(3) транслокационный пептид имеет длину от 34 до 112 аминокислотных остатков и содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 3, 20 или 4;

(ii) пептида, трансдуцирующего сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки; и

(iii) транслокационного пептида, длина которого равна 34-46 аминокислотным остаткам, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 3 или 20; и

(с) антиген патогена, расположенный на С-конце домена трансдукции белка,

причем:

- пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, имеет длину от 28 до 53 аминокислотных остатков и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, в которой Хаа⁸ соответствует I или L; Хаа¹⁰ соответствует V, F или А, Хаа¹¹ Соответствует М или L, Хаа¹⁷ соответствует L или I; и

- домен связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК) или домен связывания с рецептором CD91 не содержит аминокислотной последовательности домена I связывания экзотоксина A Pseudomonas (РЕ; от англ. Pseudomonas exotoxin), если домен трансдукции белка является транслокационным пептидом (biii).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен связывания с АПК или домен связывания с рецептором CD91 является полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 5, 9, 6, 7 и 8. Альтернативно, домен связывания с АПК выбран из группы, состоящей из домена III рецептор-ассоциированного белка-1 (RAP1; от англ.: receptor-associated protein-1), белка, ассоциированного с рецептором альфа-2-макроглобулина (А2М; от англ.: alpha-2-macroglobulin), белка Tat ВИЧ, белков теплового шока (HSPs; от англ.: heat shock proteins) и домена I связывания экзотоксина A Pseudomonas (РЕ).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок не содержит последовательности аминокислот домена I связывания экзотоксина А Pseudomonas (РЕ).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит последовательность, обеспечивающую удержание в эндоплазматическом ретикулуме, расположенную на С-конце слитого белка.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения последовательность, обеспечивающая удержание в эндоплазматическом ретикулуме, содержит последовательность аминокислот Lys-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 14). Последовательность, обеспечивающая удержание в эндоплазматическом ретикулуме, может содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14 и с 16 по 19. Альтернативно, последовательность, обеспечивающая удержание в эндоплазматическом ретикулуме, может состоять из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 16 по 19.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок не содержит последовательности, обеспечивающей удержание в эндоплазматическом ретикулуме, на его С-конце, если антиген содержит 10 или более эпитопов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен трансдукции белка является слитым полипептидом (bi).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен трансдукции белка является пептидом, трансдуцирующим сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки (bii).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок дополнительно содержит дополнительный линкер, расположенный между доменом трансдукции белка и антигеном, причем дополнительный линкер содержит последовательность SEQ ID NO: 15.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен трансдукции белка является транслокационным пептидом (biii).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок дополнительно содержит дополнительный линкер, расположенный между доменом связывания АПК или доменом связывания рецептора CD91 и транслокационным пептидом, причем дополнительный линкер содержит последовательность SEQ ID NO: 15.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен трансдукции белка содержит последовательность SEQ ID NO: 30.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен связывания АПК содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 9, 6, 7 и 8.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен связывания АПК или домен связывания рецептора CD91 является полипептидом, содержащим последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 9, 6, 7 и 8.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 2.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения транслокационный пептид содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения транслокационный пептид имеет длину от 34 аминокислотных остатков до 61 аминокислотного остатка.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен трансдукции белка, входящий в состав слитого белка, как указано выше, обладает следующими свойствами: (i) пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 или 2; и (и) транслокационный пептид содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 3.

Пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, обладает способность индуцировать появления антитела, которое распознает и связывается с последовательностью аминокислот K¹(X)²E³(X)⁴(X)⁵Y⁶P⁷P⁸P⁹Y¹⁰ (SEQ ID NO: 32) рецептора CD28 Т-клеток, причем (X)² соответствует I или L; (X)⁴ соответствует V, F или А, и (X)⁵ соответствует М или L.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, состоящему из:

(a) домена связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК) или домена связывания с рецептором CD91, расположенного на N-конце слитого белка;

(b) домена трансдукции белка, расположенного на С-конце домена связывания с АПК или домена связывания с рецептором CD91, причем домен трансдукции белка выбран из группы, состоящей из:

(i) слитого полипептида, содержащего пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, линкер и транслокационный пептид, причем:

(1) пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, расположен на N-конце слитого полипептида;

(2) линкер содержит последовательность SEQ ID NO: 15, связывающую пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, и транслокационный пептид; и

(3) транслокационный пептид имеет длину от 34 до 112 аминокислотных остатков и содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 3, 20 или 4;

(ii) пептида, трансдуцирующего сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки; и

(iii) транслокационного пептида, длина которого равна 34-46 аминокислотным остаткам, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 3 или 20; и

(c) антигена патогена, расположенного на С-конце домена трансдукции белка,

причем:

- пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, имеет длину от 28 до 53 аминокислотных остатков и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, в которой Хаа⁸ соответствует I или L; Хаа¹⁰ соответствует V, F или А, Хаа¹¹ соответствует М или L, Хаа¹⁷ соответствует L или I; и

- домен связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК) или домен связывания с рецептором CD91 не содержит аминокислотной последовательности домена I связывания экзотоксина A Pseudomonas (РЕ; от англ. Pseudomonas exotoxin), если домен трансдукции белка является транслокационным пептидом (biii).

Антигенпрезентирующая клетка (АПК) может быть выбрана из группы, состоящей из дендритных клеток, макрофагов, В-клеток и моноцитов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клеточная мембрана АПК содержит рецептор CD91.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции вакцины, содержащей: (а) терапевтически эффективное количество слитого белка, описанного выше, и (b) адъювант.

Адъювант является либо агентом, обеспечивающим доставку антигена, либо иммуностимулятором. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция вакцины содержит агент, обеспечивающий доставку антигена, и не содержит иммуностимулятора.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу индуцирования усиленных антигенспецифических Т-клеточных ответов против патогена, включающему: введение композиции вакцины, содержащей терапевтически эффективное количество слитого белка, описанного выше, нуждающемуся в этом субъекту и индуцирование за счет этого усиленного антигенспецифического Т-клеточного ответа против патогена.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу уничтожения болезненной клетки, которая презентирует антиген через молекулы класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС; от англ.: major histocompatibily complex) на клеточной мембране болезненной клетки, включающему: введение композиции вакцины, содержащей терапевтически эффективное количество слитого белка, описанного выше, нуждающемуся в этом субъекту и уничтожение за счет этого болезненной клетки, которая презентирует антиген через молекулы класса I МНС на клеточной мембране болезненной клетки.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения болезненная клетка является раковой клеткой.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу профилактики или лечения инфекции, вызванной патогеном, и/или минимизации симптомов, вызванных инфекцией, включающему: введение композиции вакцины, содержащей терапевтически эффективное количество вышеуказанного слитого белка, нуждающемуся в этом субъекту и за счет этого профилактику или лечение инфекции, вызванной патогеном, и/или минимизацию симптомов, вызванных инфекцией. Изобретение также относится к слитому белку или композиции вакцины, описанным выше, для применения для индуцирования усиленных антигенспецифических Т-клеточных ответов против патогенов или для применения для уничтожения болезненной клетки, которая презентирует антиген через молекулы класса I МНС на клеточной мембране болезненной клетки, или для применения для профилактики или лечения инфекции, вызванной патогеном, и/или для минимизации симптомов, вызванных инфекцией.

Патоген может быть по меньшей мере одним патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса папилломы человека (HPV; от англ.: human papillomavirus), вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV; от англ.: porcine reproductive and respiratory syndrome virus), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), вируса гриппа, вируса болезни Денге, вируса гепатита С (HCV; от англ.: hepatitis С virus), вируса гепатита В (HBV; от англ.: hepatitis В virus) и цирковируса 2 свиней (PCV2; от англ.: porcine circovirus 2).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вышеописанный слитый белок предназначен для применения для усиления антигенспецифического цитотоксичего Т-клеточного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Слитый белок также может быть предназначен для применения для усиления антигенспецифического CD4+ Т-клеточного ответа или для применения в качестве иммуногенного усилителя для индуцирования усиленного ответа в форме повышения титра антигенспецифического антитела у нуждающегося в этом субъекта.

Эти и другие аспекты станут очевидными из приведенного ниже описания предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения совместно с приведенными ниже графическими материалами, хотя возможны вариации и модификации настоящего изобретения без отклонения от сущности и объема новых идей раскрытия сущности изобретения.

Прилагаемые графические материалы иллюстрируют один или более вариантов осуществления настоящего изобретения и совместно с письменным описанием служат для разъяснения принципов настоящего изобретения. Насколько это возможно, на всех графических материалах использованы одинаковые ссылочные номера для обозначения одинаковых или сходных элементов настоящего изобретения.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 является картой вектора транскрипции.

Фиг. 2 является фотографией, демонстрирующей результаты анализа слитых белков способом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE; от англ.: sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis).

Фиг. 3 является картой вектора транскрипции.

Фиг. 4 является схематическим изображением, иллюстрирующим вариант осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 5А демонстрирует графики иммунизации.

Фиг. 5В является фотографией, демонстрирующей результаты анализа слитых белков способом SDS-PAGE.

Фиг. 5С-5D являются графиками, изображающими кривые размеров опухолей и процент мышей, не имеющих опухолей, в группах животных, вакцинированных различными слитыми белками или плацебо, соответственно.

Фиг. 6 изображает технологическую схему (левая часть) получения слитых белков и фотографию (правая часть), демонстрирующую результаты анализа слитых белков способом SDS-PAGE.

Фиг. 7 является схематическим изображением, иллюстрирующим механизмы действия слитых белков, сенсибилизирующих Т-клетки.

Фиг. 8 демонстрирует линейные последовательности CD28 различных видов.

Фиг. 9А изображает графики иммунизации.

Фиг. 9В-9С демонстрируют кривые размеров опухолей и выживаемость, в группах животных, вакцинированных различными слитыми белками или плацебо, соответственно.

Фиг. 10 является схематическим изображением, демонстрирующим вектор, содержащий RAP1, используемый для получения плазмид, содержащих ДНК-вставку из патогеном.

Фиг. 11 является схематическим изображением, иллюстрирующим конструкции слитых белков, содержащих антигены различных патогенов.

Фиг. 12А-12F являются фотографиями, демонстрирующими результаты анализа различных слитых белков способом SDS-PAGE.

Фиг. 13А-13В демонстрируют группы животных, вакцины и дозировки, использованные для иммунизации животных, а также графики иммунизации.

Фиг. 14А-14D являются таблицами, демонстрирующими результаты анализов ex vivo антигенспецифических иммунных ответов CD3+/CD4+ спленоцитов и CD3+/CD8+ спленоцитов из групп животных, показанных на Фиг. 13А, вакцинированных плацебо или слитым белком, содержащим антигены Е7₁₆, Е7₁₈, HCVcore или НВх.

Фиг. 15А-15J демонстрирует количества IFN_γ+ клеток в анализах ex vivo антигенспецифических иммунных ответов CD3+/CD8+ спленоцитов и CD3+/CD4+ спленоцитов из групп животных, показанных на Фиг. 13А, вакцинированных плацебо или слитым белком, содержащим антигены PCV2 (15А и 15В) или PRRSV (с 15С по 15J).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Настоящее изобретение более конкретно описано в приведенных ниже примерах, которые являются исключительно иллюстративными, поскольку специалистам в данной области техники будут очевидными многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения. Далее подробно описаны различные варианты осуществления настоящего изобретения. Что касается графических материалов, то одинаковые номера обозначают одинаковые компоненты на всех графических материалах. При использовании в описании и в приведенной ниже формуле настоящего изобретения значение артиклей «a», «an» и «the» включает множественное число, если контекст однозначно не указывает иное. Также при использовании в описании и в приведенной ниже формуле настоящего изобретения значение предлога «in» включает «в» и «на», если контекст однозначно не указывает иное. Более того, для удобства читателя в описании могут быть использованы заголовки и подзаголовки, которые не оказывают влияния на объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые термины, использованные в описании, более конкретно определены ниже.

Определения

Термины, использованные в данном описании, в целом имеют стандартные значения, используемые в данной области техники, в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, в котором использован каждый термин. Некоторые термины, использованные для описания настоящего изобретения, обсуждены ниже или в других местах описания в качестве дополнительного руководства для практиков, касающегося описания настоящего изобретения. Для удобства некоторые термины могут быть выделены, например, с использованием курсивного шрифта и/или кавычек. Использование выделения не оказывает влияния на объем и смысл термина; объем и смысл термина остаются одинаковыми в одном и том же контексте, независимо от того, выделен термин или нет. Следует понимать, что одно и то же понятие может быть сформулировано более чем одним способом. Вследствие этого альтернативные языки и синонимы могут быть использованы для одного или более терминов, обсуждаемых в данной публикации, и им не может быть придано никакое особое значение, независимо от того, конкретизированы эти термины или обсуждены в данной публикации. Приведены синонимы некоторых терминов. Указание одного или более синонимов не исключает использования других синонимов. Использование примеров в любой части данного описания, включая примеры любых терминов, обсуждаемых в данной публикации, является исключительно иллюстративным и ни в коей мере не ограничивает объем и содержание изобретения или любого приведенного термина. Сходным образом, изобретение не ограничено различными вариантами его осуществления, приведенными в данном описании.

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данной публикации, имеют те значения, которые обычно используют специалисты в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае конфликта определяющее значение имеет настоящий документ, включая приведенные в нем определения.

При использовании в контексте настоящего изобретения термины «около», «порядка» или «примерно» обычно означают «в пределах 20 процентов», предпочтительно - «в пределах 10 процентов», и более предпочтительно - «в пределах 5 процентов» от указанного значения или диапазона. Численные значения, приведенные в данной публикации, являются примерными, так что, если в явном виде не указано иное, то можно подразумевать термины «около», «порядка» или «примерно».

Термин «антигенпрезентирующая клетка (АПК) или вспомогательная клетка (А-клетка)» относится к клетке, которая презентирует чужеродные антигены в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС; от англ.: major histocompatibility complex) на своей поверхности. Т-клетки могут распознавать эти комплексы с использованием рецепторов Т-клеток (TCR; от англ.: T-cell receptors). Эти клетки перерабатывают антигены и презентируют их Т-клеткам. Основными типами специализированных антигенпрезентирующих клеток являются дендритные клетки (DC; от англ.: dendritic cells), макрофаги, моноциты и некоторые В-клетки.

Термин «домен связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК)» относится к домену, который может связываться с антигенпрезентирующей клеткой (АПК). Домен связывания с АПК может быть полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 и 9. Домен связывания с АПК является лигандом, который распознает рецептор АПК и связывается с ним.

Кластер дифференциации 91 (CD91) является белком, который образует рецептор в мембране клеток и участвует в рецептор-опосредованном эндоцитозе.

Термин «домен трансдукции белка» относится к полипептиду или слитому полипептиду, выполняющему функцию сенсибилизации Т-клеток и, за счет этого, усиления антигенспецифических Т-клеточных ответов и/или направления или ориентации (то есть нацеливания) антигена по пути презентации антигена, связанному с молекулами класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС-1) (то есть, по пути, связанному с цитотоксическими Т-клетками).

Термин «сенсибилизация Т-клеток» в целом означает, что CD8+ и CD4+ Т-клетки сенсибилизируются, и в результате этого усиливаются ответы, опосредованные CD8+ (CTL) и CD4+ Т-клетками, на нагрузку антигеном. Антигенспецифический клеточно-опосредованный иммунный ответ измеряют посредством количественного определения продукции ангигенспецифического индуцированного γ-интерферона в ответ на антиген. Например, без сигнала сенсибилизации (то есть, без домена трансдукции белка) антиген сам по себе может индуцировать слабый клеточно-опосредованный иммунный ответ или вообще не индуцировать его, то есть индуцировать слабую продукцию антигенспецифического γ-интерферона CD8+ и CD4+ Т-клетками или вообще ее не индуцировать, тогда как в присутствии сигнала сенсибилизации (домена трансдукции белка) антиген может индуцировать усиленный клеточно-опосредованный иммунный ответ. Таким образом, функция сигнала сенсибилизации (домена трансдукции белка) состоит в сенсибилизации CD4+ и CD8+ Т-клеток организма-хозяина, так что, когда организм-хозяин впоследствии нагружается антигеном, антиген может индуцировать усиленный антигенспецифический клеточно-опосредованный иммунный ответ вследствие предварительной сенсибилизации CD4+ и CD8+ Т-клеток.

Домен трансдукции белка может быть пептидом и/или полипептидом, выбранным из группы, состоящей из:

(i) слитого полипептида, содержащего пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, линкер и транслокационный пептид, причем:

(1) пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, расположен на N-конце слитого полипептида;

(2) линкер содержит последовательность SEQ ID NO: 15, связывающую пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, и транслокационный пептид; и

(3) транслокационный пептид имеет длину от 34 до 112 аминокислотных остатков и содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 3, 20 или 4;

(ii) пептида, трансдуцирующего сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки; и

(iii) транслокационного пептида, длина которого равна 34-112 аминокислотным остаткам, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 3, 20 или 4.

Домен трансдукции белка может быть «слитым полипептидом», причем слитый полипептид содержит пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, линкер и транслокационный пептид. Например, слитый полипептид может быть полипептидом «CD28convPE_t».

Термин «CD28conv» относится к консервативной области CD28, которая является «пептидом, трансдуцирующим сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки». Это эпитоп для индуцирования агонистического антитела к CD28.

Термин «PE_t» или «центральная часть PE_t» относится к центральной части транслокационного домена РЕ длиной 34 аминокислотных остатка.

Линкер находится между «CD28conv» и «PE_t». Ориентация или расположение слитого полипептида «CD28convPE_t» важна, поскольку область «CD28conv» (или пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки) должна предшествовать PE_t (или транслокационному пептиду), то есть PE_t должен находиться на С-конце «CD28conv» для получения усиленных Т-клеточных ответов. «CD28convPE_t» может повышать титр IgG (называемого CD28-специфическим агонистическим антителом), специфического в отношении CD28Conv, до гораздо более высокого уровня, чем слитый пептид PE_tCD28conv с обратной ориентацией. CD28-специфическое агонистическое антитело может сенсибилизировать как CD4+, так и CD8+ Т-клетки. Слитый полипептид CD28convPE_t правильной ориентации содержит линкер (RXRXKR) между доменами CD28conv и PE_t. Линкер содержит сайт Lys-Arg (KR) разрезания протеазой (катепсином L), специфической в отношении антигенпрезентирующей клетки (АПК). Поэтому слитый белок RAP1-CD28convPE_t-антиген-К3 может быть расщеплен на два фрагмента: RAP1-CD28conv и PE_t-антиген-К3. Фрагмент RAP1-CD28conv может быть дальше расщеплен в лизосоме, и эпитоп CD28conv затем презентируется на поверхности АПК по пути МНС II, что в свою очередь вызывает гуморальный иммунный ответ, продуцирующий агонистическое антитело к CD28. Таким образом, агонистическое антитело к CD28 продуцируется В-клетками. Это агонистическое антиело к CD28 может связываться с CD28 на поверхности Т-клеток и преактивировать Т-клетки (CD4+ и CD8+ Т-клетки).

«Пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки» имеет длину от 28 аминокислотных остатков до 53 аминокислотных остатков и содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 31, в которой Хаа⁸ соответствует I или L; Хаа¹⁰ соответствует V, F или А, Хаа¹¹ соответствует М или L, Хаа¹⁷ соответствует L или I.

Пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки, содержит критическую область K¹(I/L)²E³(V/F/A)⁴(M/L)⁵Y⁶P⁷P⁸P⁹Y¹⁰ (SEQ ID NO: 32), где (X)² соответствует I или L; (X)⁴ соответствует V, F или А, (X)⁵ соответствует М или L.

В приведенных ниже примерах был использован пептид, трансдуцирующий сигнал, сенсибилизирующий Т-клетки (TDIYFCKIEFMYPPPYLDNEKSNGTIIH; SEQ ID NO: 31, где X⁸ соответствует I, X¹⁰ соответствует F, X¹¹ соответствует М), который является специфическим для мышей.

Фиг. 7 является схематическим изображением, иллюстрирующим механизмы действия сенсибилизирующих Т-клетки слитых белков с использованием в качестве примера слитый белок RAP1-CD28convPE_t-E7-K3. RAP1-CD28convPE_t-E7-K3 содержит по направлению от N-конца к С-концу: (1) домен III полномерного RAP1 на N-конце, (2) CD28conv, (3) линкер, (4) модифицированный транслокационный пептид из экзотоксина A Pseudomonas, (5) полномерный белок Е7 HPV типа 16, и (6) тройную последовательность KDEL в качестве сигнала удержания в эндоплазматическом ретикулуме на С-конце. Белок HPV16 Е7 процессируется до эпитопов в клетках субъекта, иммунизированного слитым белком. RAP1-CD28convPE_t-E7-K3 может вызывать лучший цитотоксический Т-клеточный (CTL; от англ.: cytotoxic T-lymphocyte) ответ, чем станжартные вакцины, которые содержат только антиген. Белок RAP1-CD28convPE_t-E7-K3 предназначен улучшения захвата АПК-клетками (такими как дендритные клетки) и усиления процессинга HPV16E7 антигена по протеасомному пути и последующей презентации через комплексы с молекулами МНС I. Механизм действия иммунного CTL-ответа, специфического в отношении HPV16E7 белка, вызываемого вакциной RAP1-CD28convPE_t-E7-K3, проиллюстрирован на Фиг. 7: (а) вакцина связывается с поверхностным рецептором (CD91) АПК (например, дендритной клетки) и интернализуется посредством эндоцитоза; (b1) RAP1-CD28convPE_t-E7-K3 претерпевает протеолитический гидролиз за счет расщепления протеазой катепсином L на участке, расположенном перед транслокационным пептидом PE_t; (b2) или рециркулируется в ЭР и подвергается протеолитическому гидролизу фуриновой протеазаой на участке, расположенном перед транслокационным пептидом PE_t; (b3) тем временем RAP1-CD28conv расщепляется лизосомальной протеазой, и эпитопы CD28conv презентируются на поверхности клетки через МНС II и вызывают продукцию агонистических антител к CD28, которые могут преактивировать Т-клетки; (с) наиболее важной стадией является трансмембранная транслокация PE_t-Е7-K3 в цитоплазматический компартмент из лизосомы транслокационным пептидом (PE_t); (d) PE_t-Е7-K3 подвергается расщеплению по протеасомному пути, затем эпитопы Е7 презентируются МНС I комплексом и вызывают опосредованный Е7-специфическими клетками иммунный ответ.

Фиг. 8 демонстрирует линейную последовательность консервативных областей CD28 различных видов животных и консенсусную последовательность. Подчеркнутая последовательность (KIEVMYPPPY; SEQ ID NO: 32, где X² соответствует I, X⁴ соответствует V, X⁵ соответствует М) внутри консенсусной последовательности является критической областью для распознавания и связывания агонистических антител к CD28. Эта последовательность критической области может быть представлена как K¹(I/L)²E³(V/F/A)⁴(M/L)⁵Y⁶P⁷P⁸P⁹Y¹⁰, в которой только четвертый аминокислотный остаток является видоспецифическим и должен соответствовать V у человека, крысы, свиньи, коровы, овцы, собаки и лошади, F - у мыши и V - у индейки. Последовательность критической области может быть представлена как K¹(X)²E³(X)⁴(X)⁵Y⁶P⁷P⁸P⁹Y¹⁰ (SEQ ID NO: 32), где (X)² соответствует I или L; (X)⁴ соответствует V, F или А, (X)⁵ соответствует М или L.

Транслокационный пептид РЕ может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 3 или 20. Например, аминокислотная последовательность транслокационого пептида РЕ может содержать аминокислоты с 280 по 313 (SEQ ID NO: 3), с 268 по 313 (SEQ ID NO: 20), с 253 по 313 или с 253 по 364 (SEQ ID NO: 4) РЕ. Это значит, что аминокислотная последовательность транслокационного пептида РЕ может содержать любую область домена II РЕ (аминокислоты с 253 по 364; SEQ ID NO: 4), если она содержит эссенциальный фрагмент с аминокислотами с 280 по 313 (SEQ ID NO: 3).

Антиген может быть белком, полипептидом или пептидом патогена, который ответственен за болезнь, вызываемую патогеном, или способен индуцировать иммунологический ответ в организме-хозяине, инфицированном патогеном, или опухолеассоциированным антигеном (ТАА; от англ.: tumor-associated antigen), который является полипептидом, специфически экспрессируемым в опухолевых клетках. Антиген может быть выбран из патогенов или раковых клеток, включающих, но не ограничивающихся этим, вирус папилломы человека (HPV; от англ.: human papilloma virus), вирус репродуктивного и респираторнаого синдрома свиней (PRRSV), вирус-1 иммунодефицита человека (HIV-1; от англ.: human immunodeficiency virus-1), вирус гриппа, вирус лихорадки Денге, вирус гепатита С (HCV; от англ.: hepatitis С virus), вирус гепатита В (HBV; от англ.: hepatitis В virus), цирковирус 2 свиней (PCV2), немелкоклеточный рак легкого, карциному молочной железы, меланому, лимфомы, карциному толстого кишечника, гепатоклеточную карциному и любые их комбинации. Например, для разработки вакцины были выбраны белок Е7 HPV (Е7), белок ядра HCV (HCV core), белок X HBV (НВх). Антиген может быть слитым антигеном, полученным посредством слияния двух или более антигенов, выбранных из одного или более белков патогенов. Например, он может быть слитым антигеном, состоящим из фрагментов PRRSV ORF6 и ORF5, или результатом слияния антигенных белков из патогенов PRRSV и PCV2.

Функция последовательности, обеспечивающей удержание в эндоплазматическом ретикулуме, состоит в том, чтобы способствовать транслокации антигена из эндоцитотического компартмента в ЭР и удержания его в просвете. Она содержит последовательность Lys Asp Glu Leu (KDEL) или RDEL. Последовательность, обеспечивающая удержание в ЭР, может содержать или по существу состоит или состоит из последовательности KKDLRDELKDEL (SEQ ID NO: 16), KKDELRDELKDEL (SEQ ID NO: 17), KKDELRVELKDEL (SEQ ID NO: 18).

Рецептор-ассоциированный белок (RAP1) с молекулярной массой, равной 39 кДа, является резидентным белком эндоплазматического ретикулума и молекулярным шапероном для белка, связанного с рецептором липопротеинов низкой плотности (LDL; от англ.: low density lipoprotein receptor). Он обладает высоким сродством связывания с CD91 (Kd~3 нМ) и состоит из трех функционально сходных доменов.

Изобретение относится к открытию индуцирования и усиления опосредованных Т-клетками иммунных ответов слитыми белками по настоящему изобретению. При использовании в качестве примера слитого белка RAP1-CD28convPE_t-E7-K3 стратегия вакцины на основе RAP1-CD28convPE_t-E7-K3 сфокусирована в первую очередь на стимулировании продукции и активации Т-клеток, которые способны распознавать клетки, инфицированные HPV16 и экспрессирующие целевой антиген Е7. За счет доставки антигена к дендритным клетками можно получить антигенспецифические CD8+ Т-клетки и CD4+ Т-клетки. CD4+ Т-клетки-хелперы 1 типа, в частности, способны эффективно стимулировать и усиливать иммунный ответ цитотоксических CD8+ Т-клеток. Совместно эти две ветви адаптивной иммунной системы обладают специфичностью и способность убивать клетки, инфицированные HPV16, или ассоциированные с HPV16 опухолевые клетки во многих участках организма, не вызывая значительного повреждения нормальных тканей.

Термин «субъект» относится к человеку или нечеловекообразному животному.

Термин «обработка» или «лечение» относится к введению эффективного количества слитого белка нуждающемуся в этом субъекту, имеющему рак или инфекционное заболевание или симптом или предрасположенность к такому заболеванию, с целью лечения, облегчения симптомов, помощи, устранения, улучшения состояния или профилактики заболевания, его симптомов или предрасположенности к нему. Такой субъект может быть выявлен профессиональным медиком на основании результатов любого подходящего диагностического метода.

Термин «эффективное количество» относится к количеству активного соединения, которое необходимо для оказания терапевтического эффекта на субъект, проходящий лечение. Эффективные дозы будут различными, как известно специалистам в данной области техники, в зависимости от пути введения, использования наполнителя и возможности совместного использования с другими терапевтическими процедурами.

Аббревиатуры: CD28 - кластер дифференциации 28.

Описание примеров осуществления изобретения

Далее приведены не ограничивающие объем настоящего изобретения характерные приборы, аппаратура, способы и связанные с ними результаты в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Учтите, что в примерах для удобства читателя могут быть использованы заголовки и подзаголовки, которые никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Кроме того, в данной публикации предложены и раскрыты некоторые теории, однако, независимо от того, являются ли они верными или неверными, они никоим образом не должны ограничивать объем настоящего изобретения, поскольку изобретение осуществляют согласно настоящему изобретению безотносительно к какой-либо конкретной теории или схеме действия.

Пример 1

Конструкции векторов экспрессии

Фиг. 1 демонстрирует вектор экспрессии для слитого белка RAP1-РЕ_268-313-Е7-K3, который содержит домен 3 RAP1 (SEQ ID NO: 5), минимальный эссенциальный транслокационный пептид (РЕ_268-313; SEQ ID NO: 20), антиген Е7 и последовательность, обеспечивающую удержание в эндоплазматическом ретикулуме (K3, или сигнал KDEL; SEQ ID NO: 16, 17, 18 или 19). Минимальный эссенциальный транслокационный пептид (РЕ_268-313; SEQ ID NO: 20) получен из области полипептидной последовательности (SEQ ID NO: 10) от аминокислоты 268 до аминокислоты 313.

Этот вектор экспрессии был сконструирован с использованием плазмиды RAP1-K3, изображенной на Фиг. 10. Плазмида RAP1-K3 (Фиг. 10), которая содержит слитый ген домена 3 RAP-1 и K3, была получена следующим образом: Фрагмент ДНК, кодирующий ^NdelRAP1-^{(EcoRl, Xhol)}-K3^Xho1, синтезировали способом ПЦР и лигировали в скелет плазмиды pUC18