Способ культивирования клеток слюнной железы человека

Способ культивирования клеток слюнной железы человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

[001] Изобретение относится к области клеточной биологии. В частности, изобретение относится к культивированию клеток человека.

Уровень техники

[002] Культивирование клеток человека с целью наращивания биомассы целевой клеточной культуры в ряде случаев представляет собой непростую задачу. Значительные проблемы существуют при культивировании эпителиальных прогениторных клеток слюнной железы человека. Известны методы культивирования клеток слюнной железы млекопитающих, таких как крыса [Okumura K. et al., Hepatology. 2003. 38. 104-113], мышь [Hisatomi Y. et al., Hepatology. 2004. 39(3). 667-675; Ikeura, K. et al., Plos One. 2016, e0147407], свинья [Matsumoto S., et al., Cloning and Stem Cells. 2007. 9. 176-190]. Однако методы, подходящие для клеток животных оказываются неприменимы для длительного культивирования эпителиальных прогениторных клеток слюнных желез человека. Показано, что эти клетки человека при культивировании in vitro склонны к спонтанной дифференцировке, в результате которой они приобретают большие размеры, зернистую цитоплазму, теряют способность к пролиферации. Таким образом, длительное культивирование эпителиальных клеток слюнных желез становится невозможным [Sabatini, L.M., et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 1991 27A 939-948]. Например, эпителиальные клетки слюнной железы мыши легко культивируются и проходят более 90 пассажей на среде DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, тогда как клетки человека на данной среде вообще не способны к длительному культивированию.

[003] Таким образом, востребованы способы длительного культивирования эпителиальных клеток слюнных желез человека, позволяющие поддерживать эти клетки в недифференцированном состоянии в течение большего числа пассажей, например, не менее 15 пассажей. Такие методы позволят наращивать большую клеточную массу (более 200 млн. клеток) из небольшого биоптата (объемом 0,5-3 см³).

[004] В некоторых работах описаны способы культивирования мезенхимных клеток из слюнной железы человека. Так в работе [Jeong J. et al., Exp. Mol. Med. 2013. 45:e58] описан способ культивирования клеток из околоушной или поднижнечелюстной слюнных желез человека: клетки были выделены с помощью коллагеназы, посажены на культуральные флаконы, покрытые коллагеном I типа, и культивированы в среде DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% инсулина-трансферрина-селенита, 10 мМ никотинамида, 100 нМ дексаметазона, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 20 нг/мл EGF (epidermal growth factor), 20 нг/мл HGF (hepatocyte growth factor), 20 нг/мл онкостатина M, 1000 Uml LIF (leukemia inhibitory factor). Эти клетки экспрессировали маркеры мезенхимных клеток, такие как CD44, CD49f, CD90 и CD105. Кроме того, они были способны к адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировке. Клетки были способны проходить 10 пассажей.

[005] В другой работе [Schwarz S., Rotter N. Methods Mol. Biol. 2012. 879. 403-442] клетки культивировали на пластике в среде DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Клетки имели типичную фибробластоподобную морфологию, экспрессировали CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и были способны к дифференцировке в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях.

[006] Таким образом, при применении описанных в работах Jeong J. И соавторов и Schwarz S., Rotter N. [Jeong J. et al., Exp. Mol. Med. 2013. 45:e58; Schwarz S., Rotter N. Methods Mol. Biol. 2012. 879. 403-442] среды подходят для культивирования мезенхимных клеток, а рост эпителиальных клеток слюнных желез человека не наблюдается.

[007] Описан способ получения линий человеческих иммортализованных эпителиальных клеток из околоушной слюнной железы [Патент США №5462870 от 31.10.1995 «Human diploid salivary gland epithelial cell lines»]. Линии представляют собой диплоидные клетки, полученные из нормальной околоушной слюнной железы мужчины (HPAM1) и женщины (HPAF1). Клетки способны к длительному культивированию в безсывороточной среде KBM (Keratinocyte Basal Medium) с добавлением 5 мкг/мл инсулина, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл EGF (эпидермальный ростовой фактор, от epidermal growth factor), 25 мкг/мл экстракта гипофиза быка (bovine pituitary extract), 100 IU/ml пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Для пассирования клетки промывают HBSS, снимают с пластика 0,125% трипсином и инкубируют с КВМ, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки для ингибирования трипсина. Затем клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в безсывороточной ростовой среде, описанной выше. Клеточные линии способны к криозаморозке и длительному криохранению. Клетки экспрессируют α-кератин, амилазу и proline-rich protein (PRP).

[008] Иммортализованные клеточные линии можно использовать для изучения различных процессов: биохимических и молекулярных механизмов роста и дифференцировки, межклеточных взаимодействий, онкотрансформации, цитотоксичности различных веществ, экспрессии цитокинов и др. Однако такие клетки неприменимы в медицинских приложениях при клеточной терапии из соображений безопасности.

[009] Известен способ получения стволовых клеток слюнной железы человека [WO 2014092575 от 19.06.2014 «Means and methods for obtaining salivary gland stem cells and use thereof»]. Данный способ относится к получению стволовых клеток слюнной железы человека (предпочтительно поднижнечелюстной и околоушной слюнных желез), и их трансплантации с целью клеточной терапии, в том числе, ксеростомии. Биоптат слюнной железы механически измельчают на кусочки размером 1-5 мм³, затем обрабатывают коллагеназой и гиалуронидазой, пропускают через фильтр с размером пор 100 мкм для получения моноклеточной суспензии. Из клеток можно отсортировать стволовые клетки с наибольшим потенциалом, экспрессирующие, в том числе, маркеры EpCAM, c-Kit, CD49f, CD29, CD133 и CD24. Затем клетки подвергают суспензионному культивированию для получения салисфер - трехмерных округлых структур. В среду культивирования вносят следующие добавки: антибиотик, глутамин, 20 нг/мл EGF, 20 нг/мл FGF (fibroblast growth factor), 10 мкг/мл инсулин, 1 мкМ дексаметазон и N-2. Полученные из одной клетки салисферы можно подвергать дальнейшему культивированию обработав их трипсином. После ресуспендирования и получения моноклеточной суспензии, клетки в среде культивирования с вышеописанными добавками помещают на 3D матрикс с целью получения второй генерации салисфер. В качестве 3D матрикса используют белки компонентов базальной мембраны, такие как коллагены IV типа и ламинины, например, матригель. От матрикса салисферы можно отделить диспазой, а затем, обработав трипсином, получить следующую генерацию салисфер. Для роста салисфер до размера 50-80 мкм в диаметре необходимо около 10 дней. Салисферы можно дифференцировать, получая из них органоиды - аналоги структур организма. Для этого единичные салисферы помещают на матригель, содержащий коллаген I типа в среде, описанной выше, к которой добавляют ингибитор гамма-секретазы или 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Салисферы дифференцируют около 1 месяца для получения органоида. Из недостатков указанного способа можно указать следующие: данный способ подразумевает трехмерное культивирование клеток, что довольно трудоемко и сложно технически. Известно, что в трехмерных структурах часть клеток гибнет, часть клеток дифференцируется и теряет свой пролиферативный потенциал [Lin R.Z., Chang H.Y. Biotechnol. J. 2008. 3(9-10). 1172-1184]. По этой причине прирост клеточной массы при пассировании оказывается очень малым. Для дифференцировки способ предлагает культивировать единичные салисферы, что технически сложно и дорого. Процесс получения органоида занимает около месяца, таким образом, весь процесс культивирования и дифференцировки довольно длительный. Таким образом, с помощью указанного способа невозможно наращивать большие объемы клеточного материала (более 200 млн клеток). Кроме того, в процессе культивирования и дифференцировки способ предлагает использование матригеля в качестве матрикса, что не соответствует нормам биологической безопасности, так как матригель получают из опухолевого материала.

[010] Известна работа, в которой получали клетки из малых слюнных желез человека [Jang S.I. et al., J. Dent. Res. 2015. 94(2). 304-311]. Клетки культивировали в покрытых коллагеном культуральных флаконах в среде Keratinocyte growth medium (KGM) с добавлением экстракта гипофиза быка, EGF, инсулина, гидрокортизона, гентамицина, эпинефрина и трансферрина. Клетки имели типичную эпителиальную морфологию, маленькие размеры и были способны проходить более 10 пассажей. Клетки экспрессировали цитокератины 5 и 18 и nanog. Таким образом, недостатком данного метода является сложность приготовления среды для культивирования и ее относительная дороговизна.

[011] Наиболее близким аналогом является способ получения стволовых клеток из больших слюнных желез человека [WO 2004074465 от 02.09.2004 Human salivary gland-origin stem cell]. Материал биопсии слюнных желез человека массой 2-4 г механически измельчают на кусочки размером 1-2 мм, затем обрабатывают коллагеназой и гиалуронидазой, после этого - диспазой. Моноклеточную суспензию трижды промывают средой Williams'E и подвергают магнитной сепарации по маркеру CD49f. Отсортированные клетки высаживают на культуральные чашки, покрытые коллагеном I типа в среде Williams'E с добавлением 20 нг/мл EGF, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10^-8 М инсулина, 10^-6 М дексаметазона, 100 U/мл пенициллина, 100 μU/мл стрептомицина. Клетки в данных условиях имеют склонность терять эпителиальную морфологию и пролиферативную активность. Для предотвращения морфологических изменений и увеличения способности к пассированию, авторы предлагают: (1) сохранять высокую концентрацию клеток при пассировании (не менее 1×10⁴ кл/см²), (2) использовать кондиционированную среду при субкультивировании. При соблюдении этих условий клетки проходят не менее 10 пассажей. Клетки слюнной железы при определенных условиях могли быть дифференцированы в (1) нестин- и альбумин-экспрессирующие, (2) инсулин-экспрессирующие и (3) глюкагон-экспрессирующие. Из недостатков указанного способа можно указать следующие: использование среды, содержащей высокие концентрации кальция и сыворотку, приводит к низкому уровню пролиферации эпителиальных клеток слюнной железы и способствуют их дифференцировке. Кроме того, в данной среде происходит пролиферация мезенхимных клеток, которые остаются в первичной культуре в виде примесей. Таким образом, используемые в ближайшем аналоге методы культивирования клеток слюнной железы человека не являются оптимальными и не способствуют проведению большого числа пассажей с сохранением недифференцированного состояния клеток и их высокого пролиферативного потенциала. Данный способ не подходит для получения большой клеточной массы клеток слюнных желез человека.

Настоящее изобретение направлено на расширение технических средств культивирования эпителиальных прогениторных клеток больших слюнных желез человека, позволяющего получить культуру пролиферирующих эпителиальных клеток, проходящих более 20-ти пассажей и способных к наращиванию значительного объема клеток (не менее 200 млн на 2-6 пассажах из биоптата размером 0,5-1 см³).

Сущность изобретения

[012] Настоящее изобретение относится к способам культивирования эпителиальных прогениторных клеток человека.

[013] В предпочтительных воплощениях, способ включает:

(а) получение эпителиальных прогениторных клеток слюнных желез человека от организма-реципиента;

(б) перенос клеток в среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium и культивацию в указанной среде в культуральных флаконах, обеспечивающих адгезию клеток, при 37°C в присутствии 5% CO₂ с заменой среды каждые 2-4 суток до достижения клетками монослоя;

(в) пассаж клеток с разведением 1:3-1:5, включающий снятие клеток с поверхности культурального флакона раствором трипсина в ЭДТА и перенос в новые культуральные флаконы;

(г) дальнейшее культивирование клеток как описано в (б) с заменой среды каждые 2-4 сутки в ходе культивирования и пассажами по достижении клетками монослоя как описано в п. (в) с разведением не более 1:2-1:3, где первая замена среды после каждого пассажа производится не позднее чем через 8-24 часа.

В преимущественных воплощениях в данном методе используется среда культивирования, выбранная из группы: PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07 (CELLnTEC, Швейцария); Epidermal Keratinocyte Medium CnT-09 (CELLnTEC, Швейцария); Epidermal Keratinocyte Medium CnT-57 (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime, Epithelial Culture Medium CnT-PR (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime 2D Diff, Epithelial Culture Medium CnT-PR-D (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime Calcium Free, Epithelial Culture Medium CnT-PR-CA (CELLnTEC, Швейцария); Gingival Epithelium Progenitors, Pooled HGEPp (CELLnTEC, Швейцария); Gingival Epithelium Progenitors, Single Donor HGEPs (CELLnTEC, Швейцария).

[014] В преимущественных воплощениях способа инкубацию клеток по пунктам (б-г) осуществляют также в присутствии 5% O₂.

[015] В некоторых воплощениях сразу после получения клеток проводят их инкубацию в течение 6-48 ч в среде DMEM/F12 1:1, содержащий по крайней мере следующие добавки: глутамин и эмбриональную телячью сыворотку, где инкубация производится при 37°C в присутствии 5% CO₂. После чего среду меняют на PCT Epidermal Keratinocyte Medium.

[016] В преимущественных воплощениях среда DMEM/F12 1:1 содержит глутамин в конечной концентрации 1-4 мМ и эмбриональную телячью сыворотку в конечной концентрации 5-20%.

[017] В преимущественных воплощениях в среду культивирования DMEM/F12 1:1 также добавляют все или некоторые компоненты, выбранные из группы: инсулин, трансферрин, селенит натрия, эпидермальный фактор роста (EGF).

[018] В некоторых воплощениях в среду культивирования PCT Epidermal Keratinocyte Medium также добавляют все или некоторые компоненты, выбранные из группы: инсулин, трансферрин, селенит натрия, эпидермальный фактор роста.

[019] В некоторых воплощениях инсулин, трансферрин и селенит натрия добавляют в среду культивирования в виде коммерчески доступной добавки ITS (Insulin-Transferrin-Selenium), в других воплощениях - в виде отдельных компонентов.

[020] Технический результат - увеличение числа пассажей эпителиальных прогениторных клеток слюнной железы человека, поддержание их недифференцированного состояния и высокого пролиферативного потенциала в процессе культивирования, достигается за счет оптимизации условий культивирования клеток, использования оптимальной среды культивирования.

Краткое описание фигур

[021] Фигура 1 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на стандартной ростовой среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США), 1xITS (Invitrogen, США), +2 мМ глутамина (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США), клетки через 2 дня культивирования (0 пассаж).

[022] Фигура 2 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на стандартной ростовой среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США), 1xITS (Invitrogen, США), +2 мМ глутамина (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) после 1-го пассажа.

[023] Фигура 3 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 16 часов культивирования (0 пассаж).

[024] Фигура 4 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 1 день культивирования (0 пассаж).

[025] Фигура 5 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 2 дня культивирования (0 пассаж).

[026] Фигура 6 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 3 дня культивирования (0 пассаж).

[027] Фигура 7 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 6 дней культивирования (0 пассаж).

[028] Фигура 8 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 7 дней культивирования (1 пассаж).

[029] Фигура 9 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 10 дней культивирования (3 пассаж).

[030] Фигура 10 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 13 дней культивирования (3 пассаж).

[031] Фигура 11 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 16 часов культивирования (0 пассаж).

[032] Фигура 12 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 1 день культивирования (0 пассаж).

[033] Фигура 13 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 2 дня культивирования (0 пассаж).

[034] Фигура 14 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 3 дня культивирования (0 пассаж).

[035] Фигура 15 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 6 дней культивирования (0 пассаж).

[036] Фигура 16 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 7 дней культивирования (1 пассаж).

[037] Фигура 17 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 10 дней культивирования (4 пассаж).

[038] Фигура 18 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 13 дней культивирования (4 пассаж).

[039] Фигура 19 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 21 день культивирования (4 пассаж).

[040] Фигура 20 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 21 день культивирования (4 пассаж).

[041] Фигура 21 показывает фотографию клеток слюнной железы человека через 5 дней после выделения при культивировании на среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США), 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) (0 пассаж).

[042] Фигура 22 показывает фотографию клеток слюнной железы человека через 5 дней после выделения при культивировании первые 3 дня на среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США), 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США), следующие 2 дня культивировали на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) (0 пассаж).

[043] Фигура 23 показывает фотографию клеток слюнной железы человека через 10 дней после выделения при культивировании первые 2 дня на среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США), 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США), следующие 8 дней культивировали на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) (0 пассаж).

[044] Фигура 24 показывает фотографию клеток слюнной железы человека через 10 дней после выделения при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) (0 пассаж).

[045] Фигура 25 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после магнитной селекции по маркеру EpCAM: клетки через 5 дней после селекции по маркеру EpCAM (2 пассаж).

[046] Фигура 26 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после магнитной селекции по маркеру EpCAM: селектированные по EpCAM клетки через 7 дней культивирования после 3-го пассажа.

[047] Фигура 27 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при длительном культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 5 дней после 4-го пассажа.

[048] Фигура 28 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при длительном культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 5 дней после 20-го пассажа.

[049] Фигура 29 показывает кариотип метафазной пластинки клеток слюнной железы человека на 5 пассаже (G-бендинг).

[050] Фигура 30 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к цитокератину 8 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и цитокератин в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

[051] Фигура 31 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к цитокератину 14 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и цитокератин в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

[052] Фигура 32 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к цитокератину 18 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и цитокератин в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

[053] Фигура 33 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к цитокератину 19 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и цитокератин в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

[054] Фигура 34 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к маркеру прогениторных клеток GRP 49 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

[055] Фигура 35 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к маркеру прогениторных клеток EpCAM (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

[056] Фигура 36 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к маркеру прогениторных клеток AFP (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

[057] Фигура 37 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к поверхностному маркеру CD49f (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

[058] Фигура 38 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к поверхностному маркеру c-Met (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).

Подробное описание изобретения

[059] Как указано выше, настоящее изобретение направлено на способы культивирования эпителиальных прогениторных клеток человека. Способы настоящего изобретения включают получение эпителиальных прогениторных клеток слюнных желез человека от организма-реципиента и их культивирование при условиях, позволяющих достичь увеличения числа пассажей, поддержания недифференцированного состояния клеток и их высокого пролиферативного потенциала в процессе культивирования с целью наращивания большой клеточной массы из небольшого биоптата.

Определения

[060] Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.

[061] Термин «маркер» или «биомаркер» относится к белку или мРНК, которые присутствуют в определенном типе клеток и отличает его от другого типа клеток. Так для клеток, относящихся к настоящему изобретению, характерен определенный набор маркеров.

[062] Термины «прогениторный» или «недифференцированный» или подобный по отношению к клеткам обозначают стволовые клетки, детерминированные на дифференцировку в определенные типы клеток (однако не терминально дифференцированные). Прогениторные клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом при культивировании in vitro и имеют биомаркеры, которые позволяют отличить их от клеток других типов.

[063] Используются прогениторные эпителиальные клетки из больших слюнных желез человека, селекция которых может быть проведена по следующим маркерам: EpCAM (NCBI Gene ID: 4072), c-Kit (NCBI Gene ID: 3815), CD49f (NCBI Gene ID: 3655), LGR5 (NCBI Gene ID: 8549).

[064] Термин «дифферон» означает совокупность клеточных форм, составляющих ту или иную линию дифференцировки, включающую несколько различных типов популяций клеток, например, (стволовые клетки, делящиеся клетки, простые транзитные клетки), т.е. гистогенетический ряд.

[065] Термин «эпителиальный» по отношению к клеткам обозначает клетки, полученные из эпителиальных тканей (эпителия) - совокупности дифферонов полярно дифференцированных клеток, тесно расположенных в виде пласта на базальной мембране, на границе с внешней или внутренней средой, а также образующих большинство желез организма. Различают две группы эпителиальных тканей: поверхностные эпителии (покровные и выстилающие) и железистый эпителий, составляющий основную ткань большинства желез.

[066] Термин «мезенхимный» обозначает тип клеток мезодермального происхождения, экспрессирующих по крайней мере следующие маркеры: CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, а также способных при определенных условиях культивирования к адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировкам in vitro.

[067] Термин «иммортализованный» обозначает клеточные линии, которые способны к неограниченному количеству клеточных делений при культивировании in vitro, как правило, за счет активации теломеразы. Профиль экспрессии генов иммортализованных клеток отличается от профиля экспрессии неиммортализованных клеток.

[068] Термин «пассаж» или «пассирование» обозначает процедуру снятия адгезивных клеточных культур с культуральной посуды (как правило, с применением протеолитических ферментов), перевод клеток в суспензионное состояние для переноса их в новую культуральную посуду с последующим культивированием до образования адгезивной культуры. В терминах настоящего изобретения «нулевой («0») пассаж» в отношении клеточной культуры означает период инкубации до первого пассажа, «1 пассаж» - период инкубации после 1-го пассажа и до второго пассажа и т.д.

[069] Термин «адгезивная культура» относится к клеткам, которые находятся в прикрепленном к поверхности состоянии.

[070] Термин «биоптат» обозначает биологический материал, полученный путем биопсии от организма донора.

[071] Термин «культивирование» обозначает совокупность методов и протоколов, посредством которых поддерживают жизнеспособность и пролиферативные свойства клеток in vitro.

[072] Культивирование клеток осуществляется в культуральной среде. Культуральная среда - это питательная среда, обычно содержащая композицию незаменимых аминокислот, солей, витаминов, минералов, микроэлементов, Сахаров, липидов и нуклеотидов. Среда культивирования обеспечивает клетки компонентами, необходимыми для удовлетворения потребностей в питании и росте клеток. Для различных типов клеток, клеток и клеточных культур различной плотности используют среды, отличающиеся составом питательных веществ, pH и осмолярностью. В литературе описаны многочисленные культуральные среды. Многие среды коммерчески доступны, их идентификация проводится по названию и в ряде случаев каталожному номеру среды.

[073] Среды культивирования могут быть дополнены любыми компонентами, необходимыми, чтобы поддержать нужную клетку или культуру клеток. Например, в среду могут быть добавлены стимуляторы роста или ингибиторы роста клеток, гормоны, сыворотка крови млекопитающих, содержащая факторы роста, альбумин, глобулины и другие компоненты.

Получение эпителиальных прогениторных клеток из слюнной железы

[074] Биоптат из слюнной железы получают с помощью биопсии или хирургической операции способами хорошо известными из уровня техники. В преимущественных воплощениях забор клеток и/или тканей при биопсии осуществляется прижизненно. Если дальнейшее использование клеток предполагает медицинские цели, то донор тканевого материала не должен нести инфекционных заболеваний (ВИЧ, гепатиты B и C, сифилис), а также не должен иметь онкологических заболеваний.

[075] Биоптат сразу после забора переносят в стерильных условиях в чашку Петри, содержащую культуральную среду или изотонический раствор и антибиотик. Например, для нужд настоящего изобретения могут быть использованы культуральные среды DMEM/F12 1:1, 199, DMEM, ИГЛА, Alpha-MEM, Ham, F12, IMDM, RPMI-1640 и др., или изотонические растворы: фосфатно-солевой буфер, раствор Хенкса, физиологический раствор, раствор Версена и т.д. Составы изотонических растворов хорошо известны исследователям в данной области. В качестве антибиотика используют гентамицин в конечной концентрации 1-100 мкг/мл, например, в конечной концентрации 40 мкг/мл, или другие антибиотики: пенициллин в конечной концентрации 5-200 ед/мл, например, в конечной концентрации 50 ед/мл, стрептомицин в конечной концентрации 5-200 мкг/мл, например, в конечной концентрации 50 мкг/мл.

[076] Из уровня техники известно, что различия в условиях выделения клеток не оказывают существенного воздействия на качество дальнейшего культивирования.

[077] Изотонические растворы - растворы, обеспечивающие следующие свойства: pH: от 7,3 до 7,7; осмолярность: 280+/-20 мосмоль/кг; буферная емкость: не менее 1,4 мл.

[078] Все дальнейшие манипуляции проводят в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP (Good Manufacturing Practice). Эпителиальную ткань слюнной железы механически измельчают стерильными инструментами (скальпелем, пинцетами и др.) до небольших кусочков, например размером около от 0,5 до 10 мм³, чаще размером 1-5 мм³. Затем кусочки ткани дважды промывают изотоническим раствором (например, фосфатно-солевым буфером, Версеном, физиологическим раствором, раствором Хенкса, 7,5% раствором бикарбоната натрия и т.д.), осаждают центрифугированием, инкубируют с 0,1-10 мг/мл коллагеназы IV типа (оптимально 2 мг/мл коллагеназы) в среде DMEM/F12 1:1 с 1-4 мМ глутамина 20-60 минут при 37°C. После этого суспензию клеток пропускают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждают клетки центрифугированием.

[079] Способы центрифугирования клеток хорошо известны из уровня техники, например, используется центрифугирование в течение 5-15 минут при 100-400 g.

[080] Далее проводят отбор популяции клеток, обогащенных эпителиальными прогениторными клетками. Для этого могут быть использованы различные методики, известные из уровня техники. Например, клетки могут быть отсортированы по маркеру EpCAM (а также по маркерам с-Kit, CD49f, LGR5) с помощью магнитной селекции или флуоресцентной селекции.

[081] Например, клетки могут быть получены с помощью магнитной сепарации. Для этого суспензию клеток инкубируют с антителами anti-human EpCAM, коньюгированными с магнитными частицами. Манипуляции проводят по инструкциям производителя антител. Например, инкубацию проводят при температуре около 4°C (на льду) в течение 10-60 мин, как правило, 15-40 мин, используя антитела из расчета 0,1-10 мкг антитела на 10⁶ клеток. Отсортированные клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в культуральной ростовой среде, промывают фосфатно-солевым буфером и проводят магнитную сепарацию на колонках по инструкциям производителя.

Культивирование эпителиальных прогениторных клеток из слюнной железы

[082] Культивирование клеток осуществляют в специализированных стерильных культуральных флаконах, способных обеспечить адгезию клеток. В преимущественных воплощениях используются пластиковые флаконы. Как правило, для повышения адгезивной способности внутреннюю поверхность флакона покрывают биосовместимым матриксом, например, коллагеном I типа, коллагеном IV типа, фибронектином, или ламинином.

[083] Как правило, используют коммерчески доступные флаконы для культивации.

[084] Полученные, клетки переносят в культуральную среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium и культивируют в культуральных флаконах при 37°C в присутствии 5% CO₂ с заменой среды каждые 2-4 суток до достижения клетками монослоя.

[085] В некоторых воплощениях клетки сперва переносят в среду DMEM/F12 1:1, содержащую, по крайней мере, следующие добавки: глутамин и эмбриональную телячью сыворотку. В преимущественных воплощениях конечная концентрация глутамина в среде составляет 1-4 мМ, чаще 1,5-3 мМ, например, 2 мМ. В преимущественных воплощениях конечная концентрация эмбриональной телячьей сыворотки составляет 2-25%, чаще 5-20%, как правило 8-12%, например, 10%. В указанных воплощениях клети культивируют в среде DMEM/F12 не более 24 часов, чаще не более 18 часов, как правило 10-17 часов, после чего заменяют среду культивирования на PCT Epidermal Keratinocyte Medium.

В преимущественных воплощениях в данном методе используется среда культивирования, выбранная из группы: PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07 (CELLnTEC, Швейцария); Epidermal Keratinocyte Medium CnT-09 (CELLnTEC, Швейцария); Epidermal Keratinocyte Medium CnT-57 (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime, Epithelial Culture Medium CnT-PR (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime 2D Diff, Epithelial Culture Medium CnT-PR-D (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime Calcium Free, Epithelial Culture Medium CnT-PR-CA (CELLnTEC, Швейцария); Gingival Epithelium Progenitors, Pooled HGEPp (CELLnTEC, Швейцария); Gingival Epithelium Progenitors, Single Donor HGEPs (CELLnTEC, Швейцария), например используется среда PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07.

[086] Культивация в присутствии 5% CO₂ осуществляется в специализированном инкубаторе, поддерживающим постоянный газовый состав (95% воздух и 5% CO₂), постоянный температурный режим 37°C и влажность 95-100%.

[087] Для уменьшения гибели клеток в процессе процедуры пассирования, культивирование осуществляется также в присутствии 5% O₂.

[088] Для повышения митотической активности и сохранения клеток в недифференцированном состоянии, в среды культивирования DMEM/F12 и/или PCT Epidermal Keratinocyte Medium могут быть добавлены все или некоторые добавки, выбранные из группы: инсулин, трансферрин, селенит натрия, эпидермальный фактор роста. Использование этих добавок приводит к увеличению числа пассажей, которые клетки могут пройти до деградации культуры, и к увеличению темпов пролиферации клеток.

[089] Инсулин, трансферрин и/или селенит натрия добавляют в среду культивирования в конечной концентрации не боле 30 мкг/мл, чаще не более 20 мкг/мл, как правило, не более 10 мкг/мл, например, 5-7 мкг/мл. В некоторых воплощениях инсулин, трансферрин и селенит натрия добавляют в среду культивирования в виде коммерчески доступной добавки ITS (Insulin-Transferrin-Selenium), в других воплощениях - в виде отдельных компонентов.

[090] EGF добавляют в среду культивирования в конечной концентрации не более 200 нг/мл, чаще не более 100 нг/мл, как правило, не более 50 нг/мл, например, 10 нг/мл.

[091] Процесс пассирования клеток осуществляют с целью обеспечения клеточной пролиферации при достижении клетками конфлюэнтного монослоя. Для пассирования из культурального флакона удаляют среду культивирования, промывают флакон с клетками изотоническим раствором для удаления остатков среды культивирования. Удаляют изотонический раствор, добавляют в культуральный флакон 0,05-0,25% раствор трипсина в ЭДТА в количестве 0,5-5 мл. Клетки с раствором трипсина инкубируют при 37°C, контролирую переход клеток в суспензионное состояние визуальным осмотром и осмотром под микроскопом. После того, как все клетки открепляются от пластика, суспензию клеток осаждают центрифугированием.

[092] Удаляют супернатант, клетки ресуспендируют в свежей культуральной среде и рассаживают в новые стерильные культуральные флаконы, способные обеспечить адгезию клеток. Клетки рассаживают из расчета 1-50 тыс клеток на 1 см² площади культурального флакона, например, 5 тыс клеток на 1 см² площади культурального флакона. Инкубируют клетки в среде культивирования в тех же условиях, что были описаны выше для первого пассажа.

[093] В некоторых воплощениях промывку культуральных флаконов изотоническим раствором проводят дважды, для лучшего удаления остатков среды культивирования.

[094] В преимущественных воплощениях через 8-24 часа после процедуры пассирования меняют среду культивирования на свежую для удаления мертвых клеток. Мертвые клетки после пассирования не прикрепляются и остаются в среде культивирования. Содержимое мертвых клеток, выделяемое в среду культивирования, может способствовать спонтанной дифференцировк