Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака

Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в качестве лекарственного средства, такого как терапевтическое и/или профилактическое средство против рака.

Уровень техники

Рак является первой лидирующей причиной смертности. Указанное заболевание в настоящее время, главным образом, лечат, используя хирургическое вмешательство в сочетании с лучевой терапией и/или химиотерапией. Несмотря на разработку новых хирургических приемов и открытие новых противораковых средств в последние годы, существующее лечение раковой опухоли дает недостаточно хорошие результаты, за исключением некоторых типов раковой опухоли. В связи с недавними успехами в молекулярной биологии или иммунологии раковых опухолей были идентифицированы антитела, которые специфично взаимодействуют с раковой опухолью, раковые антигены, которые распознаются цитотоксическими T-клетками, гены, кодирующие такие раковые антигены и тому подобное, что привело к повышению вероятности разработки специфичной терапии раковых опухолей, нацеленной на раковые антигены (непатентная литература 1).

Для снижения неблагоприятной реакции на противораковую терапию желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов раковой опухоли, почти не присутствовали в нормальных клетках, но присутствовали специфично в раковых клетках. В 1991 году Boon с соавторами (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE1, узнаваемый CD8-позитивными T-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии с использованием аутологичных линий раковых клеток и реактивных по отношению к опухоли T-клеток (непатентная литература 2). Впоследствии появилось сообщение о способе SEREX (серологическая идентификация антигенов посредством основанного на экспрессии рекомбинантов клонирования), который включает в себя способ основанного на экспрессии клонирования генов для идентификации опухолевых антигенов, узнаваемых антителами, которые продуцируются in vivo в ответ на аутологичную раковую опухоль у пациента с раковой опухолью (непатентная литература 3 и патентная литература 1). Согласно такому способу были выделены некоторые раковые антигены, которые практически не экспрессируются в нормальных клетках, но специфично экспрессируются в раковой опухоли (непатентная литература 4-9). Кроме того, основанная на использовании части ракового антигена в качестве мишени клеточная терапия с использованием иммуноцитов, специфично взаимодействующих с раковыми антигенами, или специфичная по отношению к раковой опухоли иммунотерапия с использованием вакцин или тому подобного, содержащих раковые антигены, подвергаются клиническим испытаниям, нацеленным на некоторые выделенные раковые антигены.

Тем временем, в последние годы во всем мире появились различные лекарства для лечения раковых опухолей на основе антител, мишенью которых являются антигенные белки на раковых клетках. Такие лекарственные средства привлекли внимание, поскольку вследствие определенной эффективности в качестве специфичных для раковых опухолей терапевтических средств. Однако подавляющее большинство антигенных белков, которые являются мишенями лекарственных средств, также экспрессируются в нормальных клетках. В результате введения антител нормальные клетки, экспрессирующие антигены, а также раковые клетки повреждаются, приводя к неблагоприятной реакции. Таким образом, если можно будет идентифицировать антигены раковой опухоли, специфично экспрессируемые на поверхности раковых клеток, и можно будет использовать в качестве лекарственных средств антитела, нацеленные на антигены, то можно ожидать, что такие основанные на антителах лекарственные средства позволят осуществлять лечение с меньшими нежелательными реакциями.

Цитоплазматический ассоциированный с активацией и пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен как внутриклеточный белок, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся нормальных клеток, и образует цитоплазматические стрессовые гранулы с РНК в клетке, принимая участие в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что указанный белок специфично экспрессируется на поверхности раковых клеток, и его исследуют в качестве мишени для основанных на антителах лекарственных средств, предназначенных для лечения раковой опухоли (патентная литература 2).

Список ссылок

Патентная литература

Патентная литература 1: патент США № 5698396.

Патентная литература 2: WO2010/016526.

Непатентная литература

Непатентная литература 1:

Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 55-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan).

Непатентная литература 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991).

Непатентная литература 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995).

Непатентная литература 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997).

Непатентная литература 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998).

Непатентная литература 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998).

Непатентная литература 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999).

Непатентная литература 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996).

Непатентная литература 9: Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является получение антитела, мишенью которого является CAPRIN-1, специфично экспрессируемый на поверхности раковых клеток, и которое обладает более высокой противоопухолевой активностью по сравнению с обычными антителами, и обеспечение его применения в качестве терапевтического и/или профилактического средства против раковой опухоли.

Решение проблемы

Настоящее изобретение имеет следующие характерные признаки:

настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, который является иммунологически реактивным по отношению к неполному полипептиду CAPRIN-1, имеющему аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, и фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака, содержащей антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента.

В указанном выше варианте раковая опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

В одном варианте антитело является моноклональным антителом или поликлональным антителом.

В другом варианте антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифичное антитело (например, биспецифичное антитело).

Настоящее описание охватывает содержание, включенное в описание и/или чертежи заявки на выдачу патента Японии № 2012-035238, на которой основан приоритет настоящей заявки.

Полезные эффекты изобретения

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению сильнее повреждает раковые клетки, чем обычные антитела против CAPRIN-1. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению применимо для лечения или профилактики рака.

Описание вариантов осуществления изобретения

Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое узнает и связывается с предварительно определяемым неполным полипептидом CAPRIN-1 и обладает противоопухолевой активностью. Более конкретно, антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое узнает (т.е. обладает иммунологической реактивностью) неполный полипептид белка CAPRIN-1 (неполный полипептид CAPRIN-1), состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в виде SEQ ID NO: 5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. В настоящем изобретении было показано, что такое антитело проявляет противоопухолевую активность более сильную, чем обычное антитело против белка CAPRIN-1. Настоящее изобретение относится ко всем антителам, которые связываются с фрагментами белков CAPRIN-1, которые описаны выше, и проявляют противоопухолевую активность.

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению может быть антителом любого типа, которое может проявлять противоопухолевую активность, и включает, например, рекомбинантные антитела (например, синтетические антитела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv)), человеческие антитела и фрагменты таких антител (например, Fab, F(abʹ)₂ и Fv). Такие антитела и их фрагменты могут быть получены способами, общеизвестными специалистам в данной области. Желательно, чтобы антитело согласно настоящему изобретению обладало иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1 или его неполному полипептиду, т.е. связывалось (предпочтительно, специфично связывалось) с белком CAPRIN-1 в результате взаимодействия антиген-антитело. В данном контексте фраза «специфично связывающееся с белком CAPRIN-1» означает, что антитело специфично связывается с белком CAPRIN-1 и при этом по существу не связывается с другими белками. Антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело, но однако может быть и поликлональным антителом, при условии, что могут быть стабильно продуцированы гомогенные антитела. В том случае, когда субъектом для тестирования является человек, желательно человеческое антитело или гуманизированное антитело, чтобы избежать или подавить неблагоприятную реакцию.

Антитело против полипептида CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению можно оценивать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, исследуя ингибирование опухолевого роста in vivo, у несущего раковую опухоль животного или исследуя ex vivo присутствие или отсутствие опосредованной иммуноцитами- или комплементом цитотоксической активности, проявляемой антителом против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Тестируемым субъектом, получающим лечение и/или профилактику раковой опухоли согласно настоящему изобретению является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, сельскохозяйственное животное или используемое в спорте животное, и предпочтительно человек.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

Получение антигена для получения антитела

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению, не ограничены видами животных, служащих в качестве их источника, включая человека, собак, кошек, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс и цыплят. Однако белки или их фрагменты предпочтительно выбирают с точки зрения совместимости с исходными клетками, используемыми для слияния клеток. В общем, предпочтительны белки, полученные от млекопитающих. В частности, предпочтительны белки, полученные от человека. Например, когда CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их неполные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и их гомологи можно получить, например, войдя в систему GenBank (NCBI, USA) и используя такой алгоритм, как BLAST или FASTA (Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; и Altschul с соавторами, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

В настоящем изобретении при указании нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1, целевой CAPRIN-1 представляет собой нуклеиновую кислоту или белок, состоящий из последовательности, имеющей от 70% до 100%, предпочтительно от 80% до 100%, более предпочтительно от 90% до 100%, еще более предпочтительно от 95% до 100%, например, от 97% до 100%, от 98% до 100%, от 99% до 100% или от 99,5% до 100% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью ORF или зрелого белка эталона (следует отметить, что аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 при сравнении друг с другом отличаются аминокислотными остатками в положении 690 и после него). В данном контексте термин «идентичность последовательностей в %» означает количество в процентах (%) идентичных аминокислот (или оснований) от общего количества (включая количество пробелов) аминокислот (или оснований) при выравнивании двух последовательностей так, чтобы можно было добиться максимальной степени сходства или идентичности в случае введения или без введения пробелов.

Фрагмент, который содержит эпитоп (или антигенную детерминанту), который является минимальной единицей, узнаваемой антителом, и имеет длину в диапазоне от длины аминокислоты эпитопа до менее чем полной длины белка CAPRIN-1, можно использовать в качестве фрагмента белка CAPRIN-1. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно у человека. Его минимальная единица состоит примерно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот. Фрагмент белка CAPRIN-1 для применения в препарате антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой фрагмент, который распознается антителом согласно настоящему изобретению и содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5 (которая соответствует последовательности от положения 429 до положения 444 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или 4) или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью или содержит, по меньшей мере, эпитоп, состоящий примерно из 7-12 следующих друг за другом аминокислот, например, 8-11 следующих друг за другом аминокислот в любой из таких аминокислотных последовательностей.

Указанные выше белки CAPRIN-1 человека и полипептидные фрагменты, содержащие их неполные пептиды, могут быть синтезированы способами химического синтеза, например, способами на основе Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил) и tBoc (трет-бутилоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification и Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также такие полипептиды могут быть синтезированы обычными способами с использованием различных коммерчески доступных синтезаторов пептидов.

Альтернативно полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, могут быть получены с использованием способов генетического конструирования, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.) и введены в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева так, что клетки-хозяева продуцируют полипептиды. Таким образом могут быть получены представляющие интерес белки CAPRIN-1 человека или их полипептиды.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, могут быть легко получены способами генетической инженерии, известными в данной области, или обычными способами с использованием коммерчески доступных синтезаторов нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность гена CAPRIN-1 человека, может быть получена в ПЦР с использованием хромосомной ДНК человека или библиотеки кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность. Условия реакции для данной ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры таких условий включают без ограничения 30 циклов, каждый из которых включает в себя стадии реакции при 94°C в течение 30 секунд (денатурация), 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, полимеразы Taq или полимеразы Pfu) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Способ ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также могут быть получены подходящие зонды или праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях генов CAPRIN-1 и аминокислотных последовательностей белков CAPRIN-1 и использованы, например, для скрининга библиотеки кДНК человека, чтобы выделить требуемую ДНК. Предпочтительно, такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белки CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани, полученные из раковых опухолей или опухолей, таких как рак семенников, лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак почки, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, фибросаркома, мастоцитома или меланома. Такие способы, включая получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области и могут быть осуществлены согласно способам, описанным, например, Sambrook с соавторами (Molecular Cloning, the 2^nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989)) и Ausubel с соавторами (выше). ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека, и их неполные пептиды могут быть получены из полученной таким образом ДНК.

Клетки-хозяева, принимающие экспрессирующие векторы, могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать описанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают без ограничения E. coli. Примеры эукариотических клеток включают без ограничения: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1, клетки яичника китайского хомячка CHO, линия клеток эмбриональной почки человека HEK293, линия клеток кожи эмбриона мыши NIH3T3, дрожжевые клетки, такие как почкующиеся дрожжевые клетки и делящиеся дрожжевые клетки, клетки тутового шелкопряда и яйцеклетки Xenopus.

В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев применяемые экспрессирующие векторы имеют начало, которое обеспечивает возможность репликации в прокариотических клетках, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт множественного клонирования, терминатор, ген лекарственной резистентности, ген, комплементирующий ауксотрофность и т.д. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, системы экспрессии pET и системы экспрессии pGEX. ДНК, кодирующие описанные выше полипептиды, могут быть включены в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева с последующим культивированием получаемых трансформантов так, чтобы полипептиды, кодируемые ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом полипептиды могут быть экспрессированы в виде слитых белков с другими белками.

В случае использования эукариотических клеток в качестве клеток-хозяев в качестве экспрессирующих векторов применяют экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, сайт добавления поли(A) и т.д. Примеры таких экспрессирующих векторов могут включать векторы pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Подобно описанному выше случаю, ДНК, кодирующие указанные выше полипептиды, могут быть включены в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева с последующим культивированием получаемых трансформантов так, чтобы полипептиды, кодируемые ДНК, экспрессировались в эукариотических клетках-хозяевах. В случае использования таких экспрессирующих векторов как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, или pEGFP-C1 полипептиды могут быть экспрессированы в виде различных слитых белков, меченых His-меткой (например, (His)₆ - (His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP или тому подобным.

Экспрессирующие векторы могут быть введены в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, основанный на использовании фосфата кальция способ, основанный на липосомах способ, основанный на DEAE-декстране способ, микроинъекция, вирусная инфекция, липофекция и связывание с проникающими в клетки пептидами.

Представляющий интерес полипептид может быть выделен и очищен из клеток-хозяев с использованием сочетания способов разделения, известных в данной области. Примеры способов включают без ограничения обработку денатурирующим средством (например, мочевиной) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, обессоливание, фракционирование и преципитацию в растворителях, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование, электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращенно-фазовую хроматографию.

Полученные таким образом антигены могут быть использованы в качестве сенсибилизирующих антигенов, как описано далее, для получения антитела согласно настоящему изобретению.

Структура антитела

Антитела (иммуноглобулины) обычно представляют собой гетеромультимерные гликопротеиды, каждый из которых содержит, по меньшей мере, две тяжелых цепи и две легких цепи. Иммуноглобулины, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеидами с молекулярной массой примерно 150 кД, каждый из которых состоит из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Обычно каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в разных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь или каждая легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (VH-область) на одном конце, за которой следует несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL-область) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи совмещена с первой константной областью тяжелой цепи, тогда как вариабельный домен легкой цепи совмещен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Особые области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) в вариабельных доменах антител проявляют специфичную вариабельность и придают специфичность связывания антителу. Части, относительно консервативные в вариабельных областях, называют каркасными областями (FR). Каждый из полных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей содержат четыре FR, соединенные тремя CDR. Указанные три CDR называют CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в указанном порядке, начиная с N-конца тяжелой цепи. Подобным образом, CDR называют CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в легкой цепи. CDRH3 является наиболее важной для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются рядом друг с другом FR-областями и вносят вклад в образование участка связывания антигена в антителе вместе с CDR в другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитело-антиген, но проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечены в зависимую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредованный связыванием с рецептором Fcγ, время полужизни/скорость клиренса, опосредованного неонатальным Fc-рецептором (FcRn), и зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC), опосредованную компонентом C1q в каскаде комплемента.

Получение антитела

Анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью по отношению к полноразмерному белку CAPRIN-1 или его фрагменту. В частности, анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое иммунологически связывается с неполным полипептидом белка CAPRIN-1 (неполным полипептидом CAPRIN-1), который является пептидом, состоящим из содержащей эпитоп аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению узнает эпитоп, состоящий приблизительно из 7-12 следующих друг за другом аминокислот, например, 8-11 следующих друг за другом аминокислот, в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Такое анти-CAPRIN-1-антитело согласно настоящему изобретению способно специфично связываться с полноразмерным белком CAPRIN-1. Антитело согласно настоящему изобретению может быть получено путем отбора антитела, которое иммунологически связывается с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, согласно обычному способу из антител, получаемых с использованием белков CAPRIN-1 или их фрагментов в качестве антигенов.

В данном контексте «иммунологическая реактивность» означает свойство антитела связываться с антигеном CAPRIN-1 (полноразмерным белком CAPRIN-1 или его неполным полипептидом) in vivo. Благодаря такому связыванию с CAPRIN-1 антитело согласно настоящему изобретению осуществляет функцию повреждения (например, убивания, подавления или регрессии) опухолевых клеток. Антитело согласно настоящему изобретению может повреждать опухоль, например, рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника (например, рак ободочной кишки), рак легкого, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому посредством связывания с белком CAPRIN-1.

Антитело согласно настоящему изобретению может быть антителом любого типа. Примеры типов антител согласно настоящему изобретению включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифичные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (например, Fab, F(abʹ)₂, и Fv). Также антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина любого класса, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, или IgY, или любого подкласса, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Антитело может быть дополнительно модифицировано ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, пегилированием или тому подобным в дополнение к гликозилированию.

Далее будут показаны примеры получения различных антител.

Когда антитело согласно настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, например, линию раковых клеток молочной железы SK-BR-3, экспрессирующих CAPRIN-1, вводят каждой мыши для иммунизации. Из мыши выделяют селезенку. После разделения клеток селезенки клетки сливают с клетками миеломы мыши. Отбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие ингибирующим рост раковых клеток действием, из полученных слитых клеток (гибридом). Альтернативно могут быть отобраны клоны, продуцирующие антитела, связывающиеся с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую идентичность последовательности с такой аминокислотной последовательностью. Можно выделять и культивировать гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, оказывающие ингибирующий рост раковых клеток, или гибридомы, продуцирующие моноклональное антитела против полипептида SEQ ID NO: 5 или тому подобного. Антитело согласно настоящему изобретению может быть получено в результате очистки из надосадка культуры согласно обычному способу аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, могут быть получены, например, следующим образом: сначала животных иммунизируют сенсибилизирующими антигенами согласно способу, известному в данной области. Такой способ иммунизации обычно включает в себя внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разбавляют или суспендируют в PBS (фосфатно-солевом буфере), физиологическом растворе или тому подобном, в соответствующем количестве и затем, при необходимости, смешивают с подходящим количеством обычного адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования полученную эмульсию вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые 4-21 день. Альтернативно можно использовать подходящий носитель для иммунизации сенсибилизирующим антигеном.

После подтверждения повышения уровня требуемого антитела в сыворотке иммунизированного таким образом млекопитающего от такого млекопитающего получают иммуноциты и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

Клетки миеломы млекопитающих используют в качестве исходной клетки-партнера для слияния с иммуноцитами. Различные линии клеток, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology и Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. и Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. с соавторами, Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. с соавторами, Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. с соавторами, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. с соавторами, Nature (1979) 277, 131-133), 240E-1 и 240E-W предпочтительно используют в качестве клеток миеломы.

Клеточное слияние между иммуноцитами и клетками миеломы можно осуществлять в основном согласно способу, известному в данной области, например, способом of Kohler и Milstein (Kohler, G. и Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток осуществляют, например, в присутствии стимулятора клеточного слияния в обычной питательной среде. Например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или вирус Сендай (HVJ) используют в качестве стимулятора слияния. При необходимости может быть добавлено вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид, используемое для того, чтобы повысить эффективность слияния.

Соотношение между используемыми иммуноцитами и клетками миеломы может быть установлено произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно устанавливают так, чтобы оно было 1-10-кратным относительно клеток миеломы. Примеры среды, которую можно использовать при слиянии клеток, включают среду RPMI1640 и MEM, подходящую для роста линий клеток миеломы, а также обычную среду, применяемую для данного типа культуры клеток. Кроме того, можно использовать добавку сыворотки, такой как фетальная сыворотка теленка (FCS), в сочетании с такими средами.

Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы хорошо перемешивают в предварительно определяемом количестве среды. Раствор ПЭГ (средняя молекулярная масса: например, примерно 1000-6000), предварительно нагретый примерно до 37°, обычно добавляют к смеси в концентрации 30-60% (масс./об.) и перемешивают для образования представляющих интерес гибридом. Затем процедуры последовательного добавления подходящей среды и удаления надосадка центрифугированием предпочтительно повторяют, чтобы удалить агенты для слияния клеток или тому подобное, что может быть неблагоприятным для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют в обычной селективной среде, например, среде HAT (среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для селекции. Такое культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (обычно от нескольких дней до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Затем гибридомы, продуцирующие представляющее интерес антитело, подвергают скринингу и клонируют в виде отдельных клонов обычным способом лимитирующего разведения.

Кроме такого получения гибридом с помощью иммунизации животных, отличных от человека антигенами гибридомы, продуцирующие человеческие антитела, обладающие требуемой активностью (например, ингибирующей рост клеток активностью) можно получить, сенсибилизируя лимфоциты человека, например, инфицированные вирусом EB лимфоциты человека, белками, экспрессирующими белки клетками или их лизатами in vitro и сливая сенсибилизированные лимфоциты с клетками миеломы, полученными от человека, способными непрерывно делиться, например, U266 (№ регистрации TIB196).

Полученные таким образом продуцирующие моноклональное антитело гибридомы можно субкультивировать в обычной среде, а также можно хранить в течение длительного периода времени в жидком азоте.

В частности, требуемые антигены или клетки, экспрессирующие требуемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов в иммунизации согласно обычному способу иммунизации. Получаемые иммуноциты сливают с родительскими клетками, известными в данной области, согласно обычному способу слияния клеток. Продуцирующие моноклональное антитело клетки (гибридомы) могут быть подвергнуты скринингу обычным способом скрининга для получения представляющего интерес антитела.

Другим примером антитела, которое можно использовать в настоящем изобретении, является поликлональное антитело. Поликлональное антитело может быть получено, например, следующим образом:

сыворотку получают из некрупных животных, таких как мыши, продуцирующие человеческие антитела мыши или кролики, иммунизированные природными белками CAPRIN-1 или рекомбинантными белками CAPRIN-1, экспрессируемыми в виде белков, слитых с GST или тому подобным, в микроорганизмах, таких как E. coli, или их неполными пептидами. Альтернативно сыворотка может быть получена от млекопитающих, иммунизированных фрагментами CAPRIN-1, служащими в качестве сенсибилизирующих антигенов, т.е. полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью (предпочтительно, полипептидом, состоящим из любой из таких аминокислотных последовательностей), или полипептидом, содержащим эпитоп (предпочтительно, состоящим из эпитопа), состоящий примерно из 7-12 следующих друг за другом аминокислот, например, 8-11 следующих друг за другом аминокислот, из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Полученную таким образом сыворотку можно очистить, используя, например, преципитацию сульфатом аммония, колонки с белком A или белком G, ионообменную хроматографию на DEAE или аффинные колонки, на которых связаны белки CAPRIN-1 или синтетические пептиды, чтобы получить поликлональные анти-CAPRIN-1-антитела. Поликлональное антитело согласно настоящему изобретению включает антитела, полученные от животных, продуцирующих человеческие антитела (например, мышей), иммунизированных белками CAPRIN-1.

В