Способы и применение систем культуры ткани ex vivo

Способы и применение систем культуры ткани ex vivo

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.С. §119 по предварительной заявке No.61/492,609, поданной 2 июня 2011, и No.61/601,745, поданной 22 февраля 2012, полное содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

Перечень последовательностей

Заявка, рассматриваемая в данный момент, включает Перечень последовательностей, который был представлен в формате ASCII посредством EFS-Web и включены посредством ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 30 мая 2012, названа 00280606-txt и по размеру 7,292 байт.

Область техники

Технология, описанная в настоящей заявке, относится к способам и применению систем для живых органов, тканей и клеток ex vivo.

Уровень техники

Одним из ограничений технологии тканевой инженерии и стратегий роста ткани in vitro была проблема повторения естественных структур тканей и органов. Для того чтобы расти одинаково однородной тканью, должен быть достигнут совершенный баланс сложного состава из факторов роста, сигнальных молекул, питательных веществ, каркасов внеклеточного матрикса и механической силы, которые изменяются со временем, или клетки не смогут корректно формироваться в структуры ткани и органа. В ином случае, извлечение существующей структуры ткани или органа у субъекта с целью исследования или размножения ткани ех vivo может нарушить целостность ткани и восстановить правильное прохождение питательных веществ в ткань в культуре или в процессе транспортировки для трансплантации оказалось затруднительно.

Например, гемопоэтические стволовые клетки, применяемые в качестве источника терапевтического материала для трансплантации или для изготовления заменителей дифференциальных кровяных клеток (например, эритроцитов, тромбоцитов или лейкоцитов), не поддаются культивированию in vitro. Некоторые исследователи пытались культивировать и развивать гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) in vitro, но длительное приживление и проведение восстановления кроветворения из культивированных ГСК было крайне неэффективно (Csaszar, E. et al. Cell Stem Cell 10, 218-229 (2012); Boitano, A.E. et al. Science 329, 1345-348 (2010); Cook, M.M. et al. Tissue Eng, 18, 319-328 (2012)). Мультипотентные ГСК трудно поддерживать in vitro, потому что они в большинстве случаев дифференцируют при извлечении из ниши сложного костного мозга, которая содержит многочисленные химические, структурные, механические и пространственные сигналы, которые необходимы для поддержания особенности их стволовых клеток (Takagi, M. J. Biosci. Bioeng. 99, 189-196 (2005); Nichols, J.E. et al. Biomaterials 30, 1071-1079 (2009); Maggio, N.D. et al. Biomaterials 32, 321-329 (2011)).

Таким образом, существует необходимость в экспериментальных средствах и способах, которые способствуют сборке многоклеточных и многотканевых органо-подобных структур, которые обладают ключевой структурной организацией и физиологической функцией смоделированных тканей и органов и, которые смогут выжить и сохранить функционирование ex vivo.

Сущность изобретения

Технология, описанная в настоящей заявке, направлена на способы и устройства, которые могут быть использованы для стимуляции функциональных структур клетки, ткани и органа для формирования и/или развития в имплантируемом устройстве путем его имплантации в тело живого животного in vivo и позволяет клеткам и тканям наполнять имплантируемое устройство и обеспечивая нормальное микроокружение структуры и поверхностей раздела ткань-ткань и/или органоподобных структур и функций. Затем устройство целиком, включая содержащиеся клетки и ткани, может быть хирургическим путем извлечено. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетки, ткани и/или органоиды, которые сформированы и/или развиты в имплантируемом устройстве в то время, когда они были имплантированы или впоследствии и, необязательно, имплантируемое устройство может быть трансплантировано другому животному. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, ткани и/или органоиды, сформированные и/или развитые в имплантируемом устройстве в то время как они были имплантированы или впоследствии могут поддерживаться как жизнеспособные in vitro с помощью перфузии клеток, тканей и/или органоидов средой и/или газами, необходимыми для выживания клеток в имплантируемом устройстве или после извлечения из имплантируемого устройства, и помещали в микрофлюидное устройство. Сложный имитирующий орган может поддерживаться жизнеспособным in vitro посредством, например, непрерывной перфузии через микрофлюидные каналы и использоваться для изучения весьма сложных функций клеток и тканей в их обычном трехмерном окружении с уровнем сложности, невозможным с использованием любой существующей модельной системы in vitro. Он также может быть использован как производственная стратегия для получения трансплантируемых терапевтических микро-органов или как производственное устройство для производства клеток или продуктов клеток.

В соответствии с одним аспектом технологии, описанной в настоящей заявке, имплантируемое устройство, имеющее, по меньшей мере, одну камеру роста клеток, может быть имплантировано in vivo в животное. В некоторых вариантах осуществления изобретения имплантируемое устройство содержит соединения, индуцирующие рост желаемого типа или типов ткани в камере, которая имеет одно или более соответствующих отверстий в камере роста клеток (например, порты) в пространство окружающей ткани. В качестве примера, для того, чтобы индуцировать рост кости, имплантируемое устройство может содержать материалы, индуцирующие кость, например, деминерализованный костный порошок и/или костные морфогенетические белки (BMP). В результате заживления ран, соединительные ткани содержащие микрокапилляры и мезинхимальные стволовые клетки, могут расти в камере роста клеток имплантируемого устройства и при наличие материала, индуцирующего кости, могут формироваться кость с пространством, которое заполняется циркулирующими гемопоэтическими клетками-предшественниками для формирования полноценного клеточного мозга. В некоторых вариантах осуществления изобретения имплантируемое устройство может быть имплантировано подкожно. В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано под почечную капсулу. В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано внутрибрюшинно. В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано внутримышечно. В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано подкожно с, по меньшей мере, камерой роста клеток с одним отверстием (например, порт, позволяющий проникновение и/или выход клеток), обращенной к поверхности мышцы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, после того, как процесс прорастания ткани завершится место операции можно снова открыть, имплантируемое устройство с новообразованной и/или развитой ткани, подобной органным композитам, может быть отсечена от поверхности окружающих тканей. В некоторых вариантах осуществления клетки, ткани и/или органоиды, и необязательно, имплантируемое устройство может быть трансплантированы во второе животное. В некоторых вариантах осуществления клетки, ткани и/или сформированные и/или развитые органоиды могут быть извлечены из имплантируемого устройства и помещены в микрофлюидное устройство для перфузии новообразованных и/или развитых тканей и структур со средой, кислородом, питательными веществами и поддерживающими факторами, необходимыми для поддержания их жизнеспособности и функционирования in vitro. В некоторых вариантах осуществления клетки, ткани и/или органоиды и имплантируемое устройство могут быть извлечены и соединены с микрофлюидным устройством и/или системой для перфузии новообразованных и/или развитых тканей и структур со средой, кислородом, питательными веществами и поддерживающими факторами, необходимыми для поддержания их жизнеспособности и функционирования in vitro.

В соответствии с одним из аспектов технологии, описанной в настоящей заявке, имплантируемое устройство представляет собой микрофлюидное устройство. В некоторых вариантах осуществления изобретения микрофлюидное устройство, имеющее, по меньшей мере, одну камеру роста клеток и, по меньшей мере, один примыкающий канал миграции флюида, может быть имплантировано in vivo в животное, в котором имплантируемое устройство содержит соединения, индуцирующие рост желаемого типа или типов ткани в камере, которая имеет одно или несколько соответствующих отверстий в камере роста клеток (например, порты, позволяющие клеткам проникать и/или выходить из устройства) в пространство окружающей ткани. Камера роста клеток представляет собой часть микрофлюидного устройства, в котором клетки, ткани и/или органоиды формируются и/или развиваются. Канал миграции флюида представляет собой часть микрофлюидного устройства, посредством которого жидкость входит, проходит через и/или выходит из микрофлюидного чипа. В некоторых вариантах осуществления изобретения камера роста клеток является частью одного или нескольких каналов миграции флюида (например, канал миграции флюида может содержать камеру роста клеток). В некоторых вариантах осуществления изобретения камера роста клеток соединена с одним или несколькими каналами миграции флюида, но каналы миграции флюида не содержат камеру роста клеток. Канал миграции флюидов может быть закрыт в ходе имплантации с помощью закрытия его торцовых портов или заполнения его твердым удаляемым материалом, таким как твердый стержень или пробка. В качестве примера, для того, чтобы вызвать рост кости, имплантируемое устройство может содержать материалы, индуцирующие кость, например, деминерализованный костный порошок и/или костные морфогенетические белки (BMP). В результате заживления ран, соединительные ткани, содержащие микрокапилляры и мезинхимальные клетки могут расти в камере роста клеток имплантируемого устройства и, при наличии материала, индуцирующего кость, могут формировать и/или развивать кость с пространствами, которые заполняются циркулирующими гемопоэтическими клетками-предшественниками для формирования полноценного клеточного мозга. В некоторых вариантах осуществления микрофлюидное устройство может быть имплантировано подкожно. В некоторых вариантах осуществления микрофлюидное устройство может быть имплантировано под почечную капсулу. В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано внутрибрюшинно. В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано внутримышечно. В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано подкожно с, по меньшей мере, камерой роста клеток с одним отверстием, обращенного к поверхности мышцы.

В некоторых вариантах осуществления, как только процесс прорастания ткани завершится место операции можно снова открыть, и канал миграции флюида может быть открыт путем извлечения стержня или пробки и может затем быть соединен с резервуаром для жидкости так, чтобы культуральная среда, содержащая питательные вещества и газы, необходимые для выживания клеток, может закачиваться через канал миграции флюида и проходить сквозь поры разделительного компонента (например, мембрану или микрокапилляры) в камеру роста клеток, содержащую сформированную ткань. Целиком микрофлюидное устройство может затем быть вырезано без окружающей ткани и со средой, протекающей в микрофлюидном устройстве, может быть извлечено из животного и пассировано в инкубатор для тканевых культур и поддерживаться в культуре с, например, непрерывным потоком флюида через второй канал и дополнительный поток может быть добавлен к первому каналу, также, при желании, соединен с его входом и выходом портов.

Клетки, ткань и/или структуры органов, содержащиеся в имплантируемом устройстве, могут формироваться и/или развиваться правильной структуры и организации ткани и, следовательно, создавать сложное трехмерное микроокружение, которое более точно имитирует условия in vivo, чем другие технологии для культивирования клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления изобретения ткань, содержащаяся в имплантируемом устройстве, может затем применяться для исследования неповрежденной функции ткани in vitro как в контролируемой среде. В некоторых вариантах осуществления ткань, содержащаяся в имплантируемом устройстве, может затем применяться для проведения скрининга соединений для взаимодействия с этой тканью, включающее токсичность или изменение развития, функции, структуры, роста, выживаемости и/или дифференциации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ткань и/или клетки, содержащиеся в имплантируемом устройстве, могут затем применяться для получения клеток или факторов клеточного происхождения. В некоторых вариантах осуществления клетки или факторы клеточного происхождения, полученные таким образом, могут быть введены в субъект. В некоторых вариантах осуществления изобретения ткань, содержащаяся в имплантируемом устройстве, включает костный мозг. В некоторых вариантах осуществления гемопоэтические клетки или факторы костномозгового происхождения могут быть введены в субъект. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект может иметь злокачественную опухоль, гемопоэтическое заболевание или иммунодефицит. В некоторых вариантах осуществления субъект может подвергаться химиотерапии или радиотерапии.

В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано в животное, имеющее человеческие или гуманизированные клетки, тем самым обеспечивая человеческую или гуманизированную ткань и/или клетки в имплантируемом устройстве. В некоторых вариантах осуществления человеческие клетки в животном могут быть получены из злокачественной опухоли или человека, имеющего заболевание, которое влияет на тип клеток, растущих в имплантируемом устройстве.

В некоторых вариантах осуществления имплантируемое устройство может быть имплантировано в животное, имеющее человеческий или гуманизированный костный мозг и/или гемопоэтические клетки, тем самым обеспечивая человеческую или гуманизированную костномозговую ткань и/или гемопоэтические клетки в имплантируемом устройстве. В некоторых вариантах осуществления человеческие клетки в животном могут быть получены из костного мозга здорового испытуемого человека или человека со злокачественной опухолью или другим заболеванием, которое влияет на гемопоэтические клетки.

В некоторых вариантах осуществления ткань и/или клетки, содержащиеся в имплантируемом устройстве, или ткань и/или клетки, извлеченные из имплантируемого устройства, могут быть трансплантированы во второй субъект. В некоторых вариантах осуществления, костномозговая ткань и/или гемопоэтические клетки, содержащиеся в имплантируемом устройстве или костномозговая ткань и/или гемопоэтические клетки, извлеченные из имплантируемого устройства, могут быть трансплантированы во второй субъект. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субъект имеет злокачественную опухоль, гемопоэтическое заболевание, радиационную токсичность или иммунодефицит. В некоторых вариантах осуществления субъект может подвергаться химиотерапии и/или радиотерапии.

В некоторых вариантах воплощения изобретения более чем одно имплантируемое устройство, содержащее ткань и/или клетки, или более чем одну ткань можно имплантировать во второй субъект. В качестве неограничивающего примера, человеческий костный мозг в имплантируемом устройстве может быть имплантирован в мышь, а злокачественные клетки человека могут быть имплантированы либо в виде биопсии, либо содержаться во втором имплантируемом устройстве на втором участке той же мыши. Данная модель может применяться для исследования иммунного ответа человека на злокачественную опухоль. Еще одним неограничивающим примером является имплантация костного мозга человека в чип, а второй имплантат ткани человека, такой как кожа, на втором участке у субъекта в целях исследования аутоиммунного заболевания.

В некоторых вариантах воплощения изобретения первый субъект, в которого имплантируемое устройство имплантировано, может быть субъектом, не относящимся к человеку, имеющим человеческие или гуманизированные клетки. В некоторых вариантах воплощения первым субъектом и вторым субъектом может быть один и тот же субъект и способ, включающий дополнительный этап поддержания имплантируемого устройства, содержащего ткань и/или клетки in vitro между извлечением из участка имплантации и трансплантации обратно в субъект. В некоторых вариантах осуществления изобретения поддержание может включать в себя заморозку, охлаждение и/или соединение имплантируемого устройства с микрофлюидной системой и обеспечение перфузии жидкости к имплантируемому устройству после извлечения чипа из участка имплантации и после трансплантации его обратно в субъект.

Краткое описание чертежей

На Фигурах 1А-1С показаны диаграммы и фотография одного из вариантов осуществления (с открытым каналом) микрофлюидного устройства, описанного в настоящей заявке.

На Фигурах 2А-2В показан второй вариант осуществления микрофлюидного устройства, описанного в настоящей заявке. Фигура 2А показывает оптический вид сверху и диаграмму вертикального поперечного среза одноканального устройства. Фигура 2В показывает оптический вид сверху и диаграмму вертикального поперечного среза устройства с закрытым каналом.

На Фигурах 3A-3D показан второй вариант осуществления имплантируемого устройства, описанного в настоящей заявке. На Фигуре 3А показано имплантируемое устройство в луночном формате почти с монету в десять центов для перспективы. На Фигуре 3В показано имплантируемое устройство в луночном формате с двумя отверстиями и имплантируемое устройство в луночном формате с одним отверстием после культивирования in vivo. На Фигуре 3С показана диаграмма имплантируемого устройства в луночном формате с двумя отверстиями. На Фигуре 3D показана диаграмма имплантируемого устройства в луночном формате с одним отверстием.

На Фигурах 4А-4С показаны фотографии, изображающие подкожную имплантацию имплантируемого устройства в мышь. На Фигурах 4А-4 В изображают PDMS лунки, сшитые с мышцей в подкожном участке в мыши. На Фигуре 4С показано оптическое изображение имплантата в PDMS лунках после 8 недель подкожной имплантации.

На Фигуре 5 показаны диаграммы и изображения имплантируемого устройства в луночном формате, имеющего одно отверстие или два отверстия. Фотографии показывают имплантируемое устройство через 4 недели подкожного роста in vivo в мыши.

На Фигурах 6А-6С показано окрашивание гематоксилином и эозином, содержимого имплантируемого устройства в луночном формате с одним отверстием после 8 недель имплантации. Фигура 6А ориентирована так, что отверстие имплантируемого устройства будет ниже каждого изображения. Масштабная шкала, как показано.

На Фигурах 7A-7D показано окрашивание гематоксилином и эозином содержимого имплантируемого устройства в луночном формате с двумя отверстиями 4 недели (7А-7В) и 8 недель (7C-7D) после имплантации. Масштабная шкала, как показано.

На Фигуре 8 показана диаграмма линии гемопоэтических стволовых клеток и маркеров, которые могут быть использованы для идентификации каждого типа клеток.

На Фигурах 9А-9Е показаны результаты FACS анализа определения гемопоэтических стволовых клеток: 9А показывает профиль, наблюдаемый из костного мозга мыши (mBM), 9В показывает профиль, наблюдаемый из периферической крови мыши (mPB), что эритроциты были лизированы, 9С показывает профиль, наблюдаемый из ткани, извлеченной из имплантируемого устройства после 4 недель роста in vivo (sBM 4 w) и 9D показывает профиль, наблюдаемый для ткани, извлеченной из имплантируемого устройства после 8 недель роста in vivo (sBM 8w). Антитела использовали, которые признавались маркерами, указанные на x- и y-осях на Фигурах 9A-9D. Фигура 9Е сравнивает популяции на одном графике.

На Фигурах 10А-10Е показаны результаты FACS анализа определения гемопоэтических клеток-предшественников. 10А показывает профиль, наблюдаемый из костного мозга мыши (mBM), 10B показывает профиль, наблюдаемый из периферической крови мыши (mPB), что эритроциты были лизированы, 10С показывает профиль, наблюдаемый из ткани, извлеченной из имплантируемого устройства после 4 недель роста in vivo (sBM 4 w) и 10D показывает профиль, наблюдаемый из ткани, извлеченной из имплантируемого устройства после 8 недель роста in vivo (sBM 8 w). Антитела использовали, которые признавались маркерами, указанные на x- и y-осях на Фигурах 10А-10D. Фигура 10Е сравнивает популяции на одном графике.

На Фигурах 11А-11Е показаны результаты FACS анализа определения доли, которую составляют эритроциты и лейкоциты. На 11А показан профиль, наблюдаемый из костного мозга мыши (mBM), на 11В показывает профиль, наблюдаемый из периферической крови мыши (mPB), на 11С показан профиль, наблюдаемый из ткани, извлеченной из имплантируемого устройства после 4 недель роста in vivo (sBM 4 w) и на 11D показан профиль, наблюдаемый из ткани, извлеченной из имплантируемого устройства после 8 недель роста in vivo (sBM 8 w). Антитела использовали, которые признавались маркерами, указанные на x- и y-осях на Фигурах 11 А-11D. Фигура НЕ сравнивает популяции на одном графике.

На Фигурах 12А-12Е показаны результаты FACS анализа определения лейкоцитов. На 12А показан профиль, наблюдаемый из костного мозга мыши (mBM), на 12В показан профиль, наблюдаемый из периферической крови мыши (mPB), на 12С показан профиль, наблюдаемый из ткани, извлеченной из имплантируемого устройства после 4 недель роста in vivo (sBM 4 w) и на 12D показан профиль, наблюдаемый из ткани, извлеченной из имплантируемого устройства после 8 недель роста in vivo (sBM 8 w). Антитела использовали, которые признавались маркерами, указанные на x- и y-осях на Фигурах 12А-12D. Фигура 12Е сравнивает популяции на одном графике.

На Фигуре 13 показана диаграмма дополнительного варианта осуществления имплантируемого устройства, имеющего несколько слоев, которые могут быть разделены с помощью пористой мембраны.

На Фигурах 14А-14В показано устройство формата биопсии. На Фигуре 14А представлена диаграмма микрофлюидного устройства, а на Фигуре 14В показано оптическое изображение микрофлюидного устройства с образцом биопсии, присутствующем в камере роста клеток.

На Фигуре 15 изображено имплантируемое устройство после завершения этапа имплантации in vivo и устройство было извлечено из первого субъекта с тканью костного мозга, видимого в центре имплантируемого устройства, и соединено с микрофлюидной системой.

На Фигурах 16A-16D изображен созданный in vivo костный мозг. На верхнем изображении на Фигуре 16А изображено имплантируемое устройство, заполненное материалом, индуцирующим кость, и рост костного мозга после 4 и 8 недель имплантации. На Фигуре 16В изображены микрофотографии большого увеличения естественного костного мозга мыши из бедра и синтезированного костного мозга из имплантируемого устройства на Фигуре 61А. на Фигурах 16C-16D изображены графические представления популяций гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (Фигура 16С) и популяции дифференцированных клеток крови (Фигура 16D) представленные в бедре мыши (mBM), созданном костном мозге 4 недели (еВМ 4wk) и 8 недель (еВМ 8wk) после имплантации в мышь, по сравнению с периферической кровью мыши (mPB).

На Фигуре 17 изображена микрофлюидная культура синтезированного костного мозга и трансплантация в мышь, облученная летальной дозой. Нижний правый график изображает распределение типов клеток в культивируемом синтезированном костном мозге на день 0 и на день 4 культивирования ех vivo. На нижнем левом графики изображена доля трансплантированного костного мозга в популяции периферической крови через 6 недель после трансплантации.

На Фигуре 18 изображен дополнительный вариант осуществления имплантируемого устройства.

На Фигурах 19A-19D показаны изображения микрокомпьютерной томографии (микро-СТ) созданного костного мозга 4 (Фигура 19А) и 8 недель (Фигура 19В) после имплантации и позвоночник мыши (Фигура 19С). (Фигура 19D) Сравнение поперечного сечения созданного костного мозга через 8 недель после имплантации с поперечным сечением позвоночника мыши. Изображения микро-СТ демонстрируют структуру и степень минерализации костей.

На Фигурах 20А-20Е изображены результаты проведения эксперимента по трансплантации. На Фигуре 20А изображена степень приживления в мыши, облученную летальной дозой, трансплантированных клеток костного мозга бедра мыши и клеток созданного костного мозга после 4 дней культивирования in vitro. Приживление трансплантата оценивали на 6 и 16 недели после трансплантации. На Фигуре 20В изображено распространение дифференцированных клеток крови в пересажанной CD45+ популяции. (Фигура 20С) Жизнеспособность клеток крови после 4 дней культивирования по сравнению со свежевыделенным костным мозгом бедра мыши (mBM) и созданным костным мозгом (еВМ). Созданный костный мозг культивировали в устройстве в течение 4 дней (еВМ, D4). Клетки костного мозга, выделенные из бедра мыши, культивировали на слое стромальных клеток в чашке в течение 4 дней (mBM, D4). (Фигуры 20D-20E) Графическое изображение популяций гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (Фигура 20D) и долгоживущая популяция гемопоэтических стволовых клеток (Lin-CD150+CD48-) (Фигура 20Е).

На Фигурах 21А-21В изображены графики результатов проведения культивирования клеток пуповинной крови человека. Созданный костный мозг, содержащий hCB клетки, культивировали в микрофлюидной устройстве в течение 4 дней (еВМ, D4) или 7 дней (еВМ, D7), тогда как перфузирующая культуральная среда для поддержания ГСК. hCB клетки были также культивированы в чашке в течение 4 дней (mBM, D4) или 7 дней (тВМ, D7). (Фигура 21А) Жизнеспособность hCBs после 4 дней культивирования по сравнению со свежевыделенными hCB. (Фигура 21В) Графическое изображение популяции гемопоэтических стволовых клеток (Lin-CD34+CD38-CD90+).

Подробное описание изобретения

Определения

Для удобства, смысл некоторых терминов и фраз, используемых в описании, примерах и прилагаемых пунктах формулы изобретения приводится ниже. Если есть очевидное несоответствие между использованием термина и его определением, приводимым здесь, определение, данное в описании, будет иметь преимущественную силу.

Определения общепринятых терминов в клеточной биологии и молекулярной биологии могут быть найдены в "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 18-е издание, опубликованное Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.). The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованное Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.). Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованное VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149) by Crowther J. R. (2000); Fundamentals of RIA and Other Ligand Assays by Jeffrey Travis, 1979, Scientific Newsletters; Immunology by Wemer Luttmann, published by Elsevier, 2006. Определения общепринятых терминов в молекулярной биологии также можно найти в Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованное VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) and Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds.

Если не указано иное, эксперименты, испытания и способы, описанные в настоящей заявке, осуществлялись с использованием стандартных методик, как описано, например, в Methods in Enzymology, Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis, J.N. Abelson, M.I. Simon, G.B. Fields (Editors), Academic Press; 1st edition (1997) (ISBN-13: 978-0121821906); U. S. Pat. Nos: 4,965,343, and 5,849,954; Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); или Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S.L. Berger and A. R. Kimmeri Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), и Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. lan Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5-e издание (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol.57, Jennie P. Mather and David Bames editors, Academic Press, 1-е издание, (1998), которые все полностью включены в данный документ посредством ссылки.

Термины «уменьшение», «снижение», «ослабление», «понижение» или «ингибирование» используются в настоящей заявке, как правило, для обозначения снижения статистически значимого количества. Однако, во избежание неверного толкования, «снижение», «понижение» или «уменьшение» или «ингибирование» означает снижение, по меньшей мере, на 10% по сравнению с контрольным уровнем, например, снижение, по меньшей мере, на 20% или, по меньшей мере, на 30% или, по меньшей мере, на 40% или, по меньшей мере, на 50%, или, по меньшей мере, на 60% или, по меньшей мере, на 70% или, по меньшей мере, на 80% или, по меньшей мере, на 90% или вплоть до 100% снижения (например, уровень отсутствует или уровень не определяется по сравнению с контрольным образцом) или любое снижение между 10-100% по сравнению с контрольным уровнем. В контексте маркера заболевания или симптома подразумевается статистически значимое снижение такого уровня. Снижение может быть, например, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40% или более и, предпочтительно, до уровня, принятого в пределах нормального для человека без такого расстройства.

Термины «повышенный», «увеличение» или «усиление» или «активирование» используются в настоящей заявке для, как правило, обозначения увеличения статистически значимого значения; во избежание неверного толкования, термины «повышенный», «увеличение» или «усиление» или «активирование» обозначают увеличение, по меньшей мере, на 10% по сравнению с контрольным уровнем, например, увеличение, по меньшей мере, на 20% или, по меньшей мере, приблизительно на 30% или, по меньшей мере, приблизительно на 40% или, по меньшей мере, приблизительно на 50% или, по меньшей мере, приблизительно на 60% или, по меньшей мере, приблизительно на 70% или, по меньшей мере, приблизительно на 80% или, по меньшей мере, приблизительно на 90% или вплоть до 100% увеличение или любое увеличение между 10-100% по сравнению с контрольным уровнем или, по меньшей мере, приблизительно двукратное или, по меньшей мере, приблизительно трехкратное или, по меньшей мере, приблизительно четырехкратное или, по меньшей мере, приблизительно пятикратное или, по меньшей мере, приблизительно десятикратное или любое увеличение между двукратным и десятикратным или большим по сравнению с контрольным уровнем.

В данном контексте, «субъект» означает человека или животного. Обычно животные представляют собой позвоночное животное, такое как примат, грызун, домашнее животное или дичь. Приматы включают в себя шимпанзе, яванского макака, паукообразную обезьяну и макаку, например резус. Грызуны включают в себя мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние животные и дичь включают в себя коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, животных из семейства кошачьих, например домашнюю кошку, представителей семейства псовых, например собаку, лисицу, волка, виды птиц, например курицу, эму, страуса, и рыбу, например форель, сома и лосося. Субъект включает в себя любую субпопуляцию из вышеуказанных, например, все вышеуказанные, но за исключением одной или нескольких групп или видов, таких как люди, приматы и грызуны. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой млекопитающее, например, примата, например, человека. Термины "индивидуум", "пациент" и "субъект" употребляются как синонимы в настоящей заявке.

Предпочтительно, субъект представляет собой млекопитающее. Млекопитающим может быть человек, низший примат, мышь, крыса, собака, кошка, лошадь или корова, но не ограничиваются этими примерами. Млекопитающими, кроме человека, могут предпочтительно использоваться в качестве субъектов, которые представляют животные модели формирования и роста кости и/или костного мозга. Субъект может быть женского или мужского пола.

В данном контексте, «гемопоэтическое заболевание», «гемопоэтическое состояние» или «гемопоэтическое расстройство» употребляются как синонимы и относятся к состоянию, в котором любой тип клеток гемопоэтического происхождения вырабатывается в избыточном количестве, вырабатывается в недостаточном количестве или показывает абберантное функционирование или поведение.

В данном контексте, «гемопоэтические стволовые клетки» относятся к клеткам, способным к самообновлению и дифференциации, чтобы стать одним из зрелых типов клеток гемопоэтической клеточной линии.

В данном контексте, «гемопоэтическая клетка-предшественник» относится к клетке, способной дифференцироваться для возникновения, по меньшей мере, одного зрелого типа клеток гемопоэтической клеточной линии. Гемопоэтические клетки-предшественники включают в себя, но не ограничиваются ими, предшественников Т-клеток, предшественников В-клеток, бластные колониеобразующие клетки, эритро-мегакариоцитарную клетку-предшественника (МЕР), общую миелоидную клетку-предшественника (СМР), гранулоцитарно-макрофагальный предшественник (GMP) и клетки гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора.

В данном контексте, «гемопоэтические клетки» включают в себя любые зрелые клетки гемопоэтической линии, любые гемопоэтические клетки-предшественники и/или любые гемопоэтические стволовые клетки.

В данном контексте, «поддержание» относится к сохранению жизнеспособности ткани или популяции клеток. Поддерживаемая ткань будет иметь популяцию метаболически активных клеток. Количество этих клеток может быть приблизительно стабильным на протяжении, по меньшей мере, двух недель или могут расти.

В данном контексте, термин «имплантируемое устройство» или «чип» относятся к структуре или субстрату, который содержит в себе или на себе, по меньшей мере, камеру роста клеток и один порт. Имплантируемое устройство может быть имплантировано в субъект и быть заселено с помощью клеток, тканей и/или органоидов, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения имплантируемое устройство может относится к микрофлюидному устройству, микрофлюидному чипу или их части. В некоторых вариантах воплощения изобретения имплантируемое устройство может быть соединено с одним или несколькими дополнительными структурами для создания микрофлюидного устройства или чипа.

В данном контексте, термины «микрофлюидное устройство» или «микрофлюидный чип» употребляются как синонимы и относятся к структуре или субстрату, имеющему микрофлюидные структуры, содержащиеся в них или на них. В некоторых вариантах осуществления изобретения чип может быть соединен с микрофлюидной системой с возможностью отсоединения.

В данном контексте, термин «канал» относится к любому капилляру, каналу, трубке или желобку, который смежен в или на субстрат. Канал может быть микроканалом, каналом, который рассчитан для прохождения микрообъемов жидкости.

В данном контексте, термин «камера роста клеток» относится к пустому пространству в имплантируемом устройстве, которое может быть в определенной форме для контроля роста прорастающих клеток, тканей и/или органоидов так, чтобы клетки, ткани и/или органоиды принимали определенную трехмерную форму. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, ткани и/или органоиды помещали в камеру роста клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, ткани и/или органоиды были индуцированы к заселению в камере роста клеток. В некоторых вариантах осуществления камерой роста клеток может быть канал.

В данном контексте, термин «порт» относится к части имплантируемого устройства или микрофлюидного чипа, которая обеспечивает возможность жидкости и/или клеткам входить и/или выходить в устройство и/или чип. Порт может позволять прохождение жидкости и/или клеток в и/или из устройства и/или чипа в процессе роста in vivo. Порт может быть такого размера и/или формы, чтобы принимать и/или обеспечивать соединение с трубками, средствами доставки или переходниками микрофлюидной системы и давать возможность прохождению жидкости и/или клеток при присоединении к микрофлюидной системе. Порт может быть выполнен с возможностью проникновения только жидкости или только клеток в и/ил