Штамм вируса гриппа a/black-headed gull/kamchatka/123/2013 h11n8-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами ртга и пцр и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo

Штамм вируса гриппа a/black-headed gull/kamchatka/123/2013 h11n8-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами ртга и пцр и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo

Реферат

Изобретение относится к штаммам вируса гриппа H11N8-субтипа и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии. Указанный штамм предназначен для приготовления антигенсодержащего препарата и сыворотки для серодиагностики гриппа H11-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как компонента панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа А (H1-H18) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в РТГА, а также выявления антител к вирусу гриппа H11-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА. Штамм может быть применен в качестве контрольного референс-штамма H11 при проведении диагностических работ методом ПЦР. Штамм также может быть использован для эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа.

Вирусы гриппа А (Orthomyxoviridae, Influenzavirus A) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса (Львов, Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А – животные – человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. – 2005. - № 4. - С. 4-11) [1]. Вирусы гриппа А подразделяются на субтипы на основании антигенных свойств их поверхностных гликопротеинов – гемагглютинина и нейраминидазы. На сегодняшний день известно 17 субтипов гемагглютинина (H) и 10 субтипов нейраминидазы (N) [1, 2]. К настоящему моменту циркуляция вирусов гриппа А со всеми известными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, кроме H17N10, зарегистрирована только среди птиц В процессе эволюции нередко возникают высокопатогенные для человека и животных варианты вируса гриппа. Яркий пример – возникновение нового азиатского варианта вируса H5N1-субтипа, впервые зарегистрированного у домашних птиц в 1996 (Львов, Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А – животные – человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. – 2005. - № 4. - С. 4-11), (Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Mar 13;109(11):4269-74). [1, 2].

У человека сезонные эпидемии гриппа ежегодно наносят значительный ущерб. Пандемии гриппа происходили четыре раза в течение последнего столетия. Для них были характерны очень быстрое распространение, вовлечение всех континентов, высокий процент заболеваемости и высокая смертность в некоторых группах населения. Это подчеркивает серьезность проблемы диагностики вируса для человечества.

Чтобы подготовиться к будущим пандемиям, организации мер профилактики и диагностики на Международной конференции по вакцине против пандемического гриппа в 2003 году был предложен приоритетный план и классификация кандидатных пандемических вирусов. При этом, субтипы Н1, Н2 и Н3, которые, как известно, привели к предыдущим пандемиям, имеют самый высокий уровень; субтипы Н5, Н6, Н7, Н9 имеют второй по важности уровень приоритета (Isakova-Sivak I, de Jonge J, Smolonogina T, Rekstin A, van Amerongen G, van Dijken H, Mouthaan J, Roholl P, Kuznetsova V, Doroshenko E, Tsvetnitsky V, Rudenko L. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014 Jul 24;9(7):e102339) [3].

Поиск новых угроз привел к открытию специфических антител против нескольких подтипов гриппа, в том числе редкого подтипа, H11N9, у людей, которые работали на птицефабриках или имели частый контакт с дикими и домашними птицами. Это может указывать на возможность прямой передачи вируса Н11 человеку (Li J, Cardona CJ, Xing Z, Woolcock PR. Genetic and phenotypic characterization of a low-pathogenicity avian influenza H11N9 virus. Arch Virol. 2008;153(10):1899-908. doi: 10.1007/s00705-008-0217-4. Epub 2008 Oct 1.) [4].

В октябре 2016 года были опубликованы данные о том, что вирусы Н11 субтипа распространены очень широко и встречаются даже на Антарктиде, где H11N2 был обнаружен у пингвинов Адели (Pygoscelis adeliae) (Hurt AC, Su YC, Aban M, Peck H, Lau H, Baas C, Deng YM, Spirason N, Ellström P, Hernandez J, Olsen B, Barr IG, Vijaykrishna D, Gonzalez-Acuna D7 Evidence for the Introduction, Reassortment, and Persistence of Diverse Influenza A Viruses in Antarctica. J Virol. 2016 Oct 14;90(21):9674-9682. Print 2016 Nov 1.) [5].

Зоонозные вирусы птичьего гриппа инфекции могут привести к эпидемии или пандемии. Вирус пандемического гриппа 1918 г имеет геном вируса гриппа птиц, и его H1 гемагглютинин был идентифицирован в качестве ключевого фактора вирулентности млекопитающих. Также было показано, что вирусы, имеющие птичий H1, Н6, Н7, Н10 и H15 субтипы были патогенны для мышей и имели цитопатический эффект в нормальных бронхиальных эпителиальных клетках человека, в отличие от H2-, H3-, H5-, H9-, H11-, H13-, H14 - и H16, субтипов. Эти данные свидетельствуют о том, что вирусы птичьего гриппа H1, H6, H7, H10 и H15 содержат присущие млекопитающим факторы вирулентности. Однако, все остальные субтипы, включая Н11, могут быть потенциально опасными и патогенными для млекопитающих и человек, поскольку обладают высокой скоростью изменчивости и способностью к реассортации между собой (Qi L, Pujanauski LM, Davis AS, Schwartzman LM, Chertow DS, Baxter D, Scherler K, Hartshorn KL, Slemons RD, Walters KA, Kash JC, Taubenberger JK. Contemporary avian influenza A virus subtype H1, H6, H7, H10, and H15 hemagglutinin genes encode a mammalian virulence factor similar to the 1918 pandemic virus H1 hemagglutinin. MBio. 2014 Nov 18;5(6):e02116. doi: 10.1128/mBio.02116-14) [6]. Следовательно, существует крайняя необходимость ранней диагностики и исследования патогенного потенциала всех субтипов, включая Н11.

В настоящее время H11N8 вирусы гриппа продолжают постоянно циркулировать в среди диких и домашних птиц, подчеркивая вероятность их проникновения в человеческую популяцию. В связи с этим ведущие вирусологи рекомендуют проводить разработки по совершенствованию диагностики, профилактики и лечения данного субтипа вируса.

На сегодняшний день не имеется коммерческих штаммов вируса H11N8 для диагностики. Используемый в панели, рекомендованной ВОЗ H11 - A/duck/England/56 (H11N6) устарел (выделены более 50 лет назад) и имеют длительную пассажную историю. Они являются антигенно отличными от циркулирующих в настоящее время в природе вариантов и непригодны для использования в диагностике. Эффективная диагностика вируса требует комбинирования различных методов с использованием адекватных контролей (референс-штаммов), таких как анализ клинических симптомов (в том числе и гистологический анализ), выделение и наработка вирусного материала, серологический анализ, молекулярно-биологические методы на основе ПЦР.

Таким образом, очевидна необходимость создания современного референс-штамма вируса гриппа H11-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами РТГА и ПЦР и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo.

Предлагаемый в качестве изобретения штамм является уникальным птичьим вариантом вируса гриппа H11N8-субтипа, выделенным от озерной чайки (Larus ridibundus) на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). В связи с этим целесообразно использовать этот современный штамм с особенными характеристиками для разработки методов диагностики и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo.

Источники содержат информацию о нескольких штаммах, использовавшихся ранее в диагностике, в том числе с использованием метода РТГА и медицинских исследованиях.

Однако в указанных ниже источниках литературы присутствует информация только о некоторых свойствах вируса гриппа H11-субтипа, которой недостаточно для использования штаммов при создании на их основе диагностических препаратов, в частности методами РТГА и ПЦР. Вместе с тем, описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А могут значительно отличаться антигенно от современных вариантов вируса гриппа H11-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа Н11-субтипа, как компоненты диагностических тест-систем. Все отечественные штаммы имеют ряд недостатков. Одним из основных является отсутствие данных о возможности использования в диагностике методами РТГА и ПЦР.

Существует штамм вируса гриппа H11 - A/duck/England/56 (H11N6), используемый в панели, рекомендованной ВОЗ для диагностики вирусов гриппа, их субтипировании методом РТГА (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). -2002. -105P) [7].

Он является наиболее близким аналогом, является штаммом-прототипом. Однако недостатком является долгая пассажная история, с изменением антигенных свойств, невозможность его использования для применения в диагностике методами ПЦР. Он является непригодным для использования в диагностике гриппа птиц вследствие антигенного отличия. По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности поверхностного гликопротеина гемагглютинина HA) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. Он антигенно устарел, не является адекватным в настоящий момент.

Поэтому предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н11-субтипа, выделенным на территории России и единственным известным в мире штаммом вируса гриппа Н11N8-субтипа от околоводного животного с опубликованной последовательностью нуклеотидных остатков всех сегментов генома. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа H11-субтипа в России в РТГА не существует.

В настоящее время в основном используются тест-системы для определения субтипов вируса гриппа на основе полимеразной цепной реакции и на основе микрочипов (В. А. Рябинин, Е. В. Костина, Г. А. Максакова, А. Н. Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа а с использованием гибридизационного микрочипа //Биоорганическая Химия, 2010, том 36, № 6, с. 849–852; Михайлович, В. М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис. ... доктор. биол. наук / В. М. Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с) [8], (Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr;27(2):120-31) [9], (Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar;54(3):129-34) [10], (Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep;160(1-2):163-6.) [11].

Однако при апробации этих тест-систем, необходимо применять контрольный референс-штамм H11 субтипа, наиболее близкий к циркулирующим в настоящее время в природе. В вышеупомянутых исследованиях проверки систем в отношении штамма вируса гриппа Н11 проведено не было. Это связано, в том числе, с отсутствием на отечественном рынке коммерческого референс-штамма Н11.

За рубежом для исследований и в качестве компонента панели референс-штаммов для РТГА и ПЦР применяют целый ряд вирусов.

Штаммы DK ⁄ ENG ⁄ 56 (H11N1) и CK ⁄ NJ ⁄ 15906-6 ⁄ 96 (H11N1) применялись как контрольные при апробации ПЦР-системы детекции вирусов гриппа A и B в реальном времени (Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and B viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul;1(4):167-75) [12].

При проведении исследований методом нейтрализации с моноклональными антителами к H5N1 (ELISA), в качестве контрольного был использован также штамм A/Tern/Australia/1975 (H11N9) (Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell CJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies) [13].

Аналог предлагаемого штамма A/duck/England/56 (H11N6) был использован в качестве контрольного для разработки и исследования иммуномагнитной ПЦР ловушки вируса гриппа (Dhumpa R, Handberg KJ, Jørgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar;69(3):258-65 ) [14].

Для апробации тест-системы экспресс-диагностики высокопатогенного вируса гриппа H7 была применена панель контрольных штаммов вируса гриппа различных субтипов, которая включала штамм также аналог A/duck/England/56 (H11N6). Нуклеотидная последовательность этого же штамма была использована для филогенетического анализа штаммов вируса гриппа, выделенных на территории Японии (Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP. P. 4-21 [15].

На мировом рынке компания Sino Biological Inc. предлагает продукцию, компонентом которой является рекомбинантные штаммы H11:

Influenza A H11N9 (A/mallard/Alberta/294/1977)

Influenza A H11N2 (A/duck/Yangzhou/906/2002)

Таким образом, для производства коммерческих систем и наборов, а также для научных исследований ранее использовалось несколько штаммов вируса гриппа H11 субтипа. Однако все они имеют ряд недостатков. Основная масса штаммов была выделен более двадцати лет назад, и антигенно может быть отличным от ныне существующих вариантов (данные о сравнительных исследованиях отсутствуют). Отсутствует и подробная антигенная характеристика, поэтому применение их в дальнейшем как компонента диагностических систем является нецелесообразным.

Предлагаемый штамм отличается от ближайшего аналога (штамм вируса гриппа A/duck/England/56 (H11N6) WHO [7] тем, что в нем отсутствуют указанные недостатки и он пригоден для использования в заявляемой области.

Задачей настоящего изобретения получение оригинального штамма-продуцента вируса гриппа H11N8-субтипа, который обладает по сравнению с аналогами следующими преимуществами:

• Антигенными характеристиками, позволяющими проводить реакцию торможения гемагглютинации для диагностики современных штаммов вируса гриппа.

• Нуклеотидными последовательностями генов HA и NA, обладающими более 95% идентичности с другими вирусами H11 субтипа, выделенными за последние 10 лет, что позволит использовать штамм как контрольный при проведении диагностики.

• Выделен в течение последних 5 лет и способен размножаться на моделях in vivo и in vitro (развивающихся куриных эмбрионах, культура клеток MDCK, мышиная экспериментальная модель, куры); достигать высоких титров – не менее 5 lg TCID₅₀/ml.

Указанная задача решена выделением, детальной характеристикой и использованием оригинального паспортизованного штамма A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 H11N8-субтипа.

Технический результат достигается получением штамма вируса гриппа птиц A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 H11N8-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, для применения его в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo, депонированный в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им.Д.И.Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России под регистрационным номером 2783.

Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н11-субтипа, выделенным в России за последние 5 лет и имеющим данные о полном геноме. Этот факт подчеркивает важность его использования для тестирования лекарственных препаратов на животной модели (мыши, хорьки). Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.

По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности поверхностного гликопротеина гемагглютинина HA) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа H11-субтипа в России в РТГА не существует.

Характеристика штамма:

Штамм принят на патентное депонирование под номером 2783 в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им.Д.И.Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России.

Предлагаемый в качестве изобретения штамм является уникальным птичьим вариантом вируса гриппа H11N8-субтипа, выделенным от озерной чайки (Larus ridibundus) на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Новый вирус гриппа был выделен от околоводного вида, обитающего в тесном контакте с птицами-носителями. Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (H1-H16) и нейраминидазу (N1-N9) (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). -2002. -105P) [7], (Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. -2009. -155. –P. 193–198). [16].

Принадлежность гемагглютинина штамма к Н11-субтипу подтверждена определением и сравнительным анализом нуклеотидной последовательности фрагмента гена гемагглютинина (1750 н.о.).

Определены первичные последовательности полного генома исследуемого штамма (табл. 1).

Анализ показывает актуальность, и целесообразность использования штамма A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) для создания антигенсодержащего препарата вируса гриппа H11-субтипа, который далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа H11-субтипа.

При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) данного штамма инфекционный титр достигал 6,0 lg EID50/мл, в культуре клеток MDCK 4,75 TCID₅₀/ml. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8).

В эксперименте штамм имеет одинаковые титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Получение поликлональной сыворотки на штамм A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8).

Согласно стандартной методики трем 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.

После 10 суток после инфицирования была отобрана кровь для постановки промежуточной реакции торможения гемагглютинации.

Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (табл. 2). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА ≥1/40 [7]. Таким образом, при заражении кур получена сыворотка, которая может использоваться для определения принадлежности к Н11-субтипу вариантов вируса гриппа, антигенно близких штамму A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8). Для серодиагностики необходимо использовать поликлональную сыворотку в паре с антигеном данного штамма (см. пример 2).

Таблица 2 – Титры сывороток крови от куриц в РТГА с антигеном штамма A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8).

Животное	Титр сыворотки до инфицирования	Титр сыворотки на 21 сутки после инфицирования
1	≤1/10	1/320
2	≤1/10	1/320
3	≤1/10	1/160

Пример 2. Приготовление антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма вируса гриппа A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8).

Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37 С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы- 3 пассажа (РКЭ). Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4-+7С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.

Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа H11-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа H11-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (табл. 2).

Пример 3. Подтверждение специфичности разработанного праймера, предназначенного для диагностики Н2-субтипа гемагглютинина методом ПЦР.

Для типирования изолятов методом ПЦР амплификацию проводили набором Fast PCR Mix (Fermentas, США) с парами подтипспецифичных праймеров – для определения подтипов изолятов

Состав реакционной смеси:

1) MasterMix - 10мкл

2) кДНК – 2 мкл

3) Прямой праймер(2 o.u) – 1 мкл

4) Обратный праймер(2 o.u) – 1 мкл

5) Вода Nuclease-free – 4 мкл

Таблица 3 - Результат контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера Н11. В качестве контрольных используются штаммы референс-панели (St. Jude Research Hospital, США) и предлагаемый штамм A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8).

HA Субтип	Штамм	Результат контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера Н11*
H1	A/FM/1/47 (H1N1)	-
H2	A/Japan/305/57 (H2N2)	-
H3	A/duck/Ukraine/63 (H3N8)	-
H4	A/duck/Czech/56 (H4N6)	-
H5	A/tern/So.Af./61 (H5N3)	-
H6	A/turkey/MA/65 (H6N2)	-
H7	A/equine/Prague/56 (H7N7)	-
H8	A/turkey/Ont./6118/68 (H8N4)	-
H9	A/turkey/WI/66 (H9N2)	-
H10	A/chicken/N/Germany/49 (H10N8)	-
H11	A/duck/Memphis/546/74 (H11N9)	+
H12	A/duck/Alberta/60/76 (H12N5)	-
H13	A/gull/MD/707/77 (H13N6)	-
H14	A/mallard/Ast./263/82 (H14N5)	-
H15	A/shearwater/W.Aus./79 (H15N8);	-
H16	H16N3-A/Gull/Denmark/68110/02	-

Для наработки ПЦР продукта для определения первичной последовательности проводили амплификацию с праймерами специфичными к генам HA и NA.

Программа для амплификатора

1) Т=95°С, 10 секунд,

2) Т=52°С*, 30 секунд

3) Т=72°С, 20 секунд

4) Т=4°С хранение.

В таблице 3 приведены результаты контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера Н11. В качестве контрольных используются штаммы референс-панели (St. Jude Research Hospital, США) и предлагаемый штамм A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8).

Таким образом, штамм A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) был использован как контрольный при постановке реакции ПЦР с использованием разработанного праймера для субтипирования Н11 гемагглютинина. Положительный результат получен исключительно со штаммом A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8). Праймер не проявил специфичности к контрольным референс-штаммам всех остальных субтипов (Н1-Н15).

Пример 4. Адаптация штамма вируса гриппа A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) и моделирование летальной гриппозной инфекции у мышей линии BALB/c.

Штамм A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) адаптировали в серии последовательных пассажей через легкие мышей линии BALB/c. Для чего по три мыши заражали интраназально 50 мкл физиологического раствора, содержащего 10³ TCID₅₀ вируса A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8). Эта доза заражения выбрана, исходя из того, что в предварительных экспериментах было показано наличие выраженных симптомов заболевания на третьи-четвертые сутки после инфицирования мышей в этом диапазоне концентраций. На третьи сутки после инфицирования мышей умерщвляли и из их легких готовили 10%-ные гомогенаты на физиологическом растворе. После этого вновь проводили интраназальное заражение мышей 10%-ми гомогенатами легких в объеме 50 мкл. Параллельно инфекционные титры вируса в легких мышей определяли титрованием 10%-го гомогената на клетках MDCK (табл. 4).

Таблица 4. Инфекционные титры штамма вируса A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) при пассировании через легкие мышей линии Balb/c

номер пассажа	Титр MDCK, lg TCID50/ml
I	3,05±0,14
II	3,25±0,14
III	4,5±0,22
IV	≥5
V	≥5
VI	≥5

Как следует из данных, представленных в табл. 4, инфекционный титр вируса A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) увеличивался от пассажа к пассажу. После того как вирус прошел шесть пассажей на мышах, был наработан его пул на клетках MDCK.

Поскольку доклинические испытания противогриппозных лекарственных препаратов проводят, главным образом, на мышах, патогенность полученного штамма была тщательно исследована в экспериментах на этих животных с использованием различных доз заражения.

Пул вируса A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) использовали для интраназального заражения мышей линии BALB/c. На растворе Хенкса готовили десятичные разведения вируса в диапазоне концентраций 10^-1 – 10^-5. Под легким эфирным наркозом по 10 мышей заражали подготовленными разведениями вируса в объеме 50 мкл. В течение 21 сут вели наблюдение за мышами: ежедневно проводили учет павших животных. Дозу вируса, вызывающую 50%-ую гибель мышей, рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина (Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - М.:, Медгиз, 1962. - 179 с ) [17]. Рассчитанное значение MLD₅₀ составило 1,6 ± 0,1 lg TCID₅₀/мл.

После определения MLD₅₀ были проведены эксперименты по моделированию гриппозной пневмонии мышей с различной степенью летальности. Для этого мышей заражали 0,5 и 10 MLD₅₀. Наблюдение за мышами вели в течение 16 дней после инфицирования. Мышей взвешивали через день. Ежедневно учитывали павших животных и высчитывали среднюю продолжительность жизни мышей (MSD) по формуле: MSD= ∑f(d-1)/n, где f – количество мышей умерших на день d, а также мыши, выжившие на момент завершения эксперимента (d в этом случае – 15), n – количество мышей в группе.

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 0,5MLD₅₀ в 50 мкл вируссодержащей жидкости на 7–8 день после инфицирования наблюдали клинические симптомы заболевания (снижение активности, потеря аппетита, одышка, тремор, изменение качества шерсти), а также снижение массы тела на 11 ± 7%. На 14 день после заражения две мыши погибли (MSD – 14,6 дней). Снижение массы тела прекратилось после 13-го дня наблюдения

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 10MLD₅₀ в 50 мкл вируссодержащей жидкости первые признаки заболевания, а также снижение массы тела на 14 ± 4% наблюдали уже на 3–4 сутки после инфицирования. Гибель мышей регистрировали, начиная с седьмого дня после заражения. Потеря массы тела быстро прогрессировала и доходила до 50%. К 11 сут наблюдения все 10 мышей погибли, а средняя продолжительность жизни мышей составила 7,5 ± 0,6 дней.

Таким образом, при адаптации вируса A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8) к легким мышей, был получен летальный вариант вируса. При помощи модели гриппозной пневмонии мышей, созданной с использованием адаптированного штамма A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 (H11N8), можно осуществлять оценку эффективности противогриппозных лекарственных препаратов in vivo.

Использованные источники информации

1. Львов, Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А – животные – человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. – 2005. - № 4. - С. 4-11.

2. Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Mar 13;109(11):4269-74).

3. Isakova-Sivak I, de Jonge J, Smolonogina T, Rekstin A, van Amerongen G, van Dijken H, Mouthaan J, Roholl P, Kuznetsova V, Doroshenko E, Tsvetnitsky V, Rudenko L. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014 Jul 24;9(7):e102339.

4. Li J, Cardona CJ, Xing Z, Woolcock PR. Genetic and phenotypic characterization of a low-pathogenicity avian influenza H11N9 virus. Arch Virol. 2008;153(10):1899-908. doi: 10.1007/s00705-008-0217-4. Epub 2008 Oct 1

5. Hurt AC, Su YC, Aban M, Peck H, Lau H, Baas C, Deng YM, Spirason N, Ellström P, Hernandez J, Olsen B, Barr IG, Vijaykrishna D, Gonzalez-Acuna D7 Evidence for the Introduction, Reassortment, and Persistence of Diverse Influenza A Viruses in Antarctica. J Virol. 2016 Oct 14;90(21):9674-9682. Print 2016 Nov 1

6. Qi L, Pujanauski LM, Davis AS, Schwartzman LM, Chertow DS, Baxter D, Scherler K, Hartshorn KL, Slemons RD, Walters KA, Kash JC, Taubenberger JK. Contemporary avian influenza A virus subtype H1, H6, H7, H10, and H15 hemagglutinin genes encode a mammalian virulence factor similar to the 1918 pandemic virus H1 hemagglutinin. MBio. 2014 Nov 18;5(6):e02116. doi: 10.1128/mBio.02116-14

7. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). -2002. -105P.

8. В. А. Рябинин, Е. В. Костина, Г. А. Максакова, А. Н. Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа а с использованием гибридизационного микрочипа //Биоорганическая Химия, 2010, том 36, № 6, с. 849–852; Михайлович, В. М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис. ... доктор. биол. наук / В. М. Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с.

9. Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr;27(2):120-31.

10. Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar;54(3):129-34.

11. Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep;160(1-2):163-6.).

12. Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and B viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul;1(4):167-75.

13. Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell CJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies to different clades of Influenza A H5N1 viruses. J Virol Methods. 2009 May;157(2):161-7.

14. Dhumpa R, Handberg KJ, Jørgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar;69(3):258-65.

15. Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP. P. 4-21.

16. Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. -2009. -155. –P. 193–198. ).

17. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - М.:, Медгиз, 1962. - 179 с.

Штамм вируса гриппа птиц A/black-headed gull/Kamchatka/123/2013 H11N8-субтипа для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа H11-субтипа в РТГА, для применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo, депонированный в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России под регистрационным номером 2783.