Способы увеличения урожая и стрессоустойчивости у растения

Способы увеличения урожая и стрессоустойчивости у растения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[001] Настоящее изобретение относится, в общем, к области молекулярной биологии и рассматривает различные полинуклеотиды, полипептиды и способы применения, которые могут использоваться для повышения урожая трансгенных растений. Трансгенные растения, содержащие какой-либо из полинуклеотидов или полипептидов, описанных в данном документе, могут проявлять какой-либо из признаков, состоящих из увеличенного урожая, увеличенной устойчивости к абиотическому стрессу, увеличенного клеточного роста, увеличенного коэффициента использования воды и увеличенного коэффициента использования питательных веществ.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[002] Увеличение населения мира и истощающийся запас пахотных земель, доступных для сельского хозяйства, активизирует необходимость исследования в области увеличения эффективности сельского хозяйства. Традиционные способы повышения урожая посевных и садовых культур применяют техники селекционного разведения для выявления растений, имеющих необходимые характеристики. Тем не менее, такие техники селекционного разведения имеют определенные недостатки, а именно то, что эти техники зачастую являются трудоемкими и дают в результате растения, которые часто содержат гетерогенные генетические компоненты, которые не всегда могут приводить к передаче необходимого признака от родительских растений. Успехи в молекулярной биологии позволили людям модифицировать идиоплазму животных и растений. Генная инженерия растений предусматривает выделение и манипуляцию с генетическим материалом (типично в форме ДНК или РНК) и последующее введение этого генетического материала в геном растения. Такая технология обладает способностью предоставлять сельскохозяйственные культуры или растения, имеющие различные улучшенные экономические, агрономические или садоводческие признаки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] Изложенное ниже краткое описание изобретения перечисляет некоторые варианты осуществления рассматриваемого изобретения и во многих случаях перечисляет изменения и перестановки этих вариантов осуществления. Данное краткое описание изобретения является исключительно иллюстративным для многочисленных и разнообразных вариантов осуществления. Упоминание одного или нескольких репрезентативных признаков данного варианта осуществления также является иллюстративным. Такой вариант осуществления может типично иметь место с упомянутым(и) признаком(ами) или без него(них); аналогично, эти признаки могут применяться к другим вариантам осуществления настоящего изобретения, независимо от того, перечислены ли они в кратком описании изобретения или нет. Чтобы избежать чрезмерного повторения, настоящее краткое описание изобретения не перечисляет или предполагает все возможные комбинации таких признаков.

[004] Настоящее изобретение предлагает нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды трегалозного пути, которые будучи трансгенно экспрессированными в растении, увеличивают урожай. Полипептиды Т6РР, описанные в данном документе, содержат модификации, изменяющие активность белков трегалозо-6-фосфатфосфатазы (Т6РР), причем активность снижается по сравнению с немодифицированной Т6РР. Модифицированные Т6РР могут содержать консенсусную последовательность, проиллюстрированную в SEQ ID NO: 9, и могут иметь по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту. Модифицированная Т6РР может иметь модификацию, произведенную в консервативной аминокислоте, включая консервативные аминокислоты, описанные в консенсусной последовательности SEQ ID NO: 9. Модифицированные Т6РР могут вызывать in vitro активацию Т6РР дикого типа. Модификация в Т6РР может находиться в пределах по меньшей мере одного из доменов CAP, фосфатазы, А-фосфатазы или В-фосфатазы. Т6РР, имеющие сниженное связывание с субстратом трегалозо-6-фосфатом (Т6Р), демонстрируют увеличенную урожайность и увеличенную стрессоустойчивость, будучи трансгенно экспрессированными в растениях, а также наличие повышенной устойчивости к стрессу, включая засуху. Растения, экспрессирующие модифицированную Т6РР, включают однодольные или двудольные растения, включая растения, выбранные из группы, состоящей из следующего: маис, сахарный тростник, соя, рис, сорго или пшеница. Модификации полипептидов Т6РР могут включать одну или комбинацию аминокислотных замен, аминокислотных делеций или аминокислотных вставок. Модифицированная Т6РР может быть представителем надсемейства галогенокислой дегалогеназы (HAD) фосфатаз. Ферментативная активность Т6РР может быть снижена по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100%.

[005] Любой из описанных полипептидов Т6РР может применяться для получения полинуклеотидов. Полинуклеотиды, кодирующие модифицированные полипептиды Т6РР, могут быть введены в клетку хозяина. Клетка хозяина может включать клетку растения. Полинуклеотиды могут быть включены в кассеты экспрессии, которые обеспечивают транскрипцию полинуклеотида в растении. Кассеты экспрессии могут включать промотор, который экспрессирует полинуклеотид в репродуктивной ткани растения. Кроме того, репродуктивная ткань может быть выбрана из группы, состоящей из следующего: ткань колоска, узел початка, ткань прицветника, ткань меристемы колоска, ткань цветоножки соцветия и незрелая ткань цветка. Промотор, экспрессирующий полинуклеотиды Т6РР, может включать промотор OsMADS или промотор OsMADS6. Экстракт, содержащий полинуклеотиды или полипептиды, может быть получен из чего-либо из клеток хозяина, растений, частей растения или тканей растения.

[006] Способы, раскрытые в данном документе, дополнительно включают введение растениям полинуклеотидов, например, как раскрыто в данном документе. Трансгенные растения, содержащие полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, могут проявлять увеличенный клеточный рост, увеличенную мощность растений и/или всходов, увеличенную урожайность, увеличенный вес семян, увеличенный коэффициент использования воды и/или увеличенную биомассу. Предусматривается, что растения, полученные с помощью способов, раскрытых в данном документе, имеют увеличенную устойчивость к абиотическому стрессу. Трансгенные растения, описанные в данном документе, могут производить более высокий урожай, как в отношении урожайности биомассы, так и урожайности зерна растения. Один аспект настоящего изобретения предлагает различные модификации, которые могут быть проведены на любой данной генной последовательности Т6РР, которая может использоваться в трансгенных растениях для обеспечения увеличенного урожая. Альтернативно, другие многочисленные способы могут применяться для увеличения уровней Т6Р для обеспечения увеличенного урожая и стрессоустойчивости у растения.

[007] Способы увеличения урожая, увеличения устойчивости растения к абиотическому стрессу или снижения бесплодия у растения, увеличения количества початков на растение и/или зерен на растение в условиях дефицита воды могут включать введение кассеты экспрессии, содержащей модифицированную Т6РР, в растительную клетку и затем получение трансгенного растения. Растение может представлять собой однодольное растение, например, может представлять собой растение маиса, риса, пшеницы, сорго, сахарного тростника или газонной травы. Это может быть двудольное растение, такое как соя. Для способов увеличения устойчивости растения к абиотическому стрессу стресс может быть выбран из группы, состоящей из стресса, вызванного недостатком воды, теплового стресса или стресса, вызванного низкими температурами. Стресс, вызванный недостатком воды, может быть обусловлен засухой.

[008] Кроме того, включены способы модификации уровня трегалозо-6-фосфата в растении путем выявления полипептида в трегалозном пути; модификации полипептида так, чтобы он имел измененную ферментативную активность; введения в растение кассеты экспрессии, содержащей полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид; и получения растения с модифицированными уровнями трегалозо-6-фосфата. Полипептид может иметь активность, выбранную из группы, состоящей из трегалозо-6-фосфат-синтазы; трегалозо-6-фосфатфосфатазы и трегалазы. Модифицированные уровни трегалозо-6-фосфата могут приводить к увеличению экспрессии генов в пентозофосфатном шунтовом пути в течение стресса, вызванного засухой, в ткани узла початка растения. Дополнительно или альтернативно, модифицированные уровни трегалозо-6-фосфата могут вызывать увеличение уровня карбоангидразы в ткани узла початка растения. Модифицированный полипептид может быть экспрессирован в репродуктивных тканях растения, включая, ткань колоска, узел початка, ткань прицветника, ткань меристемы колоска, ткань цветоножки соцветия и незрелую ткань цветка. Модифицированный полипептид модифицированного фермента трегалозного пути может иметь сниженную ферментативную активность и/или вызывать in vitro активацию трегалозо-6-фосфатфосфатазы дикого типа.

[009] Эти и другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения станут более понятными из последующего описания. В описании приведена ссылка на прилагаемые последовательности, являющися его частью и в которых показаны с целью иллюстрации, но не ограничения, варианты осуществления настоящего изобретения. Описание предпочтительных вариантов осуществления не предусмотрено для ограничения настоящего изобретения, чтобы охватить все модификации, эквиваленты и альтернативы. Следовательно, необходимо привести ссылку на варианты осуществления, перечисленные в данном документе для интерпретации объема настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В СПИСКЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

nt = нуклеотидная последовательность

pt = белковая последовательность

SEQ ID NO: 1 трегалоза-6-фосфатфосфатаза (nt), OsT6PP-WT

SEQ ID NO: 2 трегалоза-6-фосфатфосфатаза (pt), OsT6PP-WT

SEQ ID NO: 3 трегалозо-6-фосфатфосфатаза-одинарная модификация (nt), OsT6PP-H244D

SEQ ID NO: 4 трегалоза-6-фосфатфосфатаза-одинарная модификация (pt), OsT6PP-H244D

SEQ ID NO: 5 трегалозо-6-фосфатфосфатаза-двойная модификация a (nt), OsT6PP-I129F

SEQ ID NO: 6 трегалоза-6-фосфатфосфатаза-двойная модификация a (pt), OsT6PP-I129F

SEQ ID NO: 7 трегалозо-6-фосфатфосфатаза-тройная модификация b (nt)

SEQ ID NO: 8 трегалоза-6-фосфатфосфатаза-тройная модификация b (pt)

SEQ ID NO: 9 консенсусная последовательность трегалозо-6-фосфатфосфатазы

SEQ ID NO: 10 фосфатазный домен трегалозо-6-фосфатфосфатазы

SEQ ID NO: 11 бокс А-фосфатазы трегалозо-6-фосфатфосфатазы

SEQ ID NO: 12 бокс В-фосфатазы трегалозо-6-фосфатфосфатазы

SEQ ID NO: 13 промотор OsMADS6

SEQ ID NO: 14 трегалоза-6-фосфатфосфатаза Arabidopsis thaliana 19925

SEQ ID NO: 15 трегалоза-6-фосфатфосфатаза Arabidopsis thaliana 19926

SEQ ID NO: 16 трегалоза-6-фосфатфосфатаза Oryza sativa 19924

SEQ ID NO: 17 подобная трегалозо-6-фосфатфосфатазе Thermoplasma acidophilum (Q9HIW7)

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[010] На фиг. 1А-1С показано исходное выравнивание последовательностей Т6РР из Arabidopsis thaliana (19925; SEQ ID NO: 14), Arabidopsis thaliana (19926; SEQ ID NO: 15), Oryza sativa (19924; SEQ ID NO: 16), Oryza sativa (15777; OsT6PP-WT дикого типа; SEQ ID NO: 2) и Thermoplasma acidophilum (Q9HIW7; SEQ ID NO: 17). Последовательности выравнивали с помощью Vector NTI с применением способа ClustalW.

[011] На фиг. 2 показано филогенетическое дерево, полученное от выравнивания множественных белков Т6РР.

[012] На фиг. 3 показано описание трегалозного пути. Трегалозный путь состоит из двух ферментов биосинтеза, трегалозо-6-фосфатсинтазы (TPS) и трегалозо-6-фосфатфосфатазы (Т6РР), и одного гидролизирующего фермента, трегалазы, вовлеченного в распад.

[013] На фиг. 4 показан трегалозный путь с дополнительными последующими продуктами. UDPG получают напрямую посредством сахарозосинтазы; G6P получают из глюкозы посредством инвертазы и гексокиназы или посредством фруктозы и фруктозо-6-фосфата (F6P) через сахарозосинтазу, фруктокиназу и фосфоглюкозоизомеразу. UDPG и G6P также представляют собой два центральных активированных предшественника, из которых в конечном счете могут быть получены многие клеточные функциональные соединения. UDPG представляет собой предшественник для основных полисахаридов клеточной стенки и для гликолипидов. G6P представляет собой предшественник для синтеза крахмала, NADPH путем окислительной части пентозофосфатного пути и ATP путем гликолиза, цикла Кребса и окислительного фосфорилирования. Кроме того, G6P может быть превращен во фруктозо-6-фосфат и вместе с UDPG может применяться для синтеза сахарозо-6-фосфата и затем сахарозы. Будучи произведенным из UDPG и G6P, Т6Р находится на пересечениях основных углеводных потоках в растениях.

[014] На фиг. 5 описано влияние связывания Т6Р с SnRK1. SnRK1 представляет собой гетеротримерный белок и представляет собой растительный гомолог AMP-активированной протеинкиназы животных и дрожжевой неферментирующей сахарозу протеинкиназы (SnF1).

[015] На фиг. 6 показано вовлечение SnRK1 в многочисленные метаболические пути в растениях.

[016] На фиг. 7 показано ленточное графическое изображение гомологичной модели Т6РР риса. Фермент содержит два домена: домен α/β-гидролазы и меньший "lid-домен". Активный сайт лежит ан верхней части домена α/β-гидролазы (dot); углубление для связывания с субстратом находится на границе между двумя доменами. Два домена соединены гибким линкером, позволяющим lid-домену открываться и закрываться в ходе катализа. Поскольку матрица для гомологичного моделирования, бактериальный T6PP-связанный белок (код PDB 1U02), является апоферментом с пустым активным сайтом, вероятно, что относительная ориентация lid-домена и гидролазного домена слегка отличается в настоящем фермент-субстратном комплексе.

[017] На фиг. 8 показано расположение 6-фосфатной группы Т6Р. Один из атомов кислорода 6-фосфатной группы расположен в экваториальном положении в координационной сфере Mg²⁺. Asp121, принимающий фосфатную группу в ходе катализа для образования ковалентного промежуточного соединения, принимает аксиальное положение. Lys289 напрямую связан водородной связью с фосфатной группой и His181 находится в непосредственной близости. Оба остатка оптимально расположены для стабилизации образующегося отрицательного заряда на фосфатном фрагменте в ходе катализа.

[018] На фиг. 9 показаны способные к вращению связи в субстрате Т6Р. В то время как положение и ориентация пиранозного кольца, ближайшего к 6-фосфатной группе, точно определены с помощью зафиксированной фосфатной группы, существует значительная гибкость между первым и вторым кольцами вследствие присутствия двух способных к вращению гликозидных связей (стрелки). Диапазон возможных положений для второго кольца был получен путем вращения двух связей. Конформации, в которых второе кольцо нежелательным образом накладывается на белок, выбраковывали.

[019] На фиг. 10 показана консенсусная последовательность для Т6РР (SEQ ID NO: 9). Остатки, выделенные жирным шрифтом и подчеркнутые, определяют высоко консервативные участки. Отмеченные "X" положения в консенсусной последовательности указывают на участки изменчивости, где любая другая отдельная буква относится к общепринятому однобуквенному обозначению аминокислот, применяемому в настоящей области техники. Подчеркнутые аминокислотные остатки указывают на участки, которые могут быть модифицированы для конструирования полипептидов Т6РР, обеспечивающих увеличенную урожайность и/или увеличенную стрессоустойчивость у трансгенного растения. Остатки, обозначенные DYDGTLSPIV, кодируют бокс В-фосфатазы.

[020] На фиг. 11A-11C показано окончательное выравнивание последовательностей Т6РР для Arabidopsis thaliana (19925; SEQ ID NO: 14), Arabidopsis thaliana (19926; SEQ ID NO: 15), Oryza sativa (19924; SEQ ID NO: 16), и Oryza sativa (15777; OsT6PP-WT дикого типа; SEQ ID NO: 2) и родственного T6PP белка из Thermoplasma acidophilum (Q9HIW7; SEQ ID NO: 17).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[021] Практическое осуществление настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, общепринятые техники ботаники, микробиологии, тканевой культуры, молекулярной биологии, химии, биохимии, генетики количественных признаков растений, статистики и рекомбинантной ДНК-технологии, находящиеся в пределах навыков специалистов в настоящей области техники. Такие техники объясняются в полном объеме в литературе. Смотрите, например, Langenheim and Thimann, (1982) Botany: Plant Biology and Its Relation to Human Affairs, John Wiley; Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol. 1, Vasil, ed. (1984); Stanier, et al., (1986) The Microbial World, 5th ed., Prentice-Hall; Dhringra and Sinclair, (1985) Basic Plant Pathology Methods, CRC Press; Maniatis, et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, vols. I and II, Glover, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, eds. (1984); и серию Methods in Enzymology, Colowick and Kaplan, eds, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

[022] Единицы, приставки и символы могут быть указаны в их приемлемой для системы SI форме. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты написаны слева направо в ориентации 5ʹ-3ʹ; аминокислотные последовательности написаны слева направо в ориентации от амино- к карбокси-концу, соответственно. Числовые диапазоны включают в себя числа, определенные в диапазоне. Аминокислоты в данном документе могут быть обозначены либо по их общеизвестным трехбуквенным символам, либо по однобуквенным символам, рекомендованным Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогичным образом, нуклеотиды могут быть обозначены по их общепринятым однобуквенным кодам. Выражения, определенные ниже, более полно определены посредством ссылки на описание изобретения в целом.

[023] Если не определено иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в настоящей области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.

[024] Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами, клеточными линиями, видами или родами растений, конструктами и реагентами, описанными по существу. Следует также понимать, что терминология, применяемая в данном документе, представлена исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления, и не предусмотрена для ограничения объема настоящего изобретения.

[025] Применяемые в данном документе формы единственного числа включают ссылку на формы множественного числа, если иное ясно не продиктовано контекстом. Таким образом, например, ссылка на "вектор" представляет собой ссылку на один или несколько векторов и включает их эквиваленты, известные специалистам в настоящей области техники.

[026] Выражение "около" используется в данном документе для обозначения приблизительно, грубо, примерно или в районе. Когда выражение "около" используется в связи с числовым диапазоном, оно модифицирует этот диапазон путем расширения границ выше и ниже указанных числовых значений. В общем, выражение "около" используется в данном документе для модификации числового значения выше и ниже указанного значения с помощью отклонения на 20 процентов.

[027] Применяемое в данном документе слово "или" означает любого одного представителя конкретного перечня, а также включает любую комбинацию представителей из данного перечня.

[028] Выражения "содержит", "содержащий", "включает", "включающий", "имеющий" и родственные им по значению слова означают "включая, но не ограничиваясь следующим". Выражение "состоящий из" означает "включая и ограничиваясь следующим".

[029] Выражение "состоящий, по сути, из" означает, что композиция, способ или структура могут включать дополнительные ингредиенты, этапы и/или части, но только если дополнительные ингредиенты, этапы и/или части не изменяют существенно основные и новые характеристики заявленной композиции, способа или структуры.

[030] Во всех случаях, когда указывается числовой диапазон в данном документе, это означает, что он включает любое перечисленное число (дробное или целое) в пределах указанного диапазона. Фразы "в диапазоне/диапазоны между" первым указанным числом и вторым указанным числом и "в диапазоне/диапазонах от" первого указанного числа "до" второго указанного числа применяются в данном документе взаимозаменяемо и означают включение первого и второго указанных чисел и всех дробных и целых чисел между ними. Применяемое в данном документе выражение "способ" относится к образам действия, средствам, техникам и процедурам для осуществления данной задачи, включая, но без ограничения, такие образы действия, средства, техники и процедуры, или известные, или легко разрабатываемые на основе известных образов действия, средств, техник и процедур специалистами в химической, фармакологической, биологической, биохимической и медицинской областях техники. Следует понимать, что определенные признаки настоящего изобретения, описанные для ясности в контексте отдельных вариантов осуществления, могут также быть представлены в комбинации в одном варианте осуществления. Напротив, различные признаки настоящего изобретения, описанные для краткости в контексте одного варианта осуществления, могут также быть представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации или в форме, подходящей в любом другом описанном варианте осуществления настоящего изобретения. Определенные признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны рассматриваться как существенные признаки этих вариантов осуществления, если только вариант осуществления не является неработоспособным без этих элементов.

[031] Под выражением "микроб" понимают любой микроорганизм (включая как эукариотические, так и прокариотические микроорганизмы), такие как грибы, дрожжи, бактерии, актиномицеты, водоросли и простейшие, а также другие одноклеточные структуры.

[032] Под выражением "амплифицированный" понимают конструкцию множественных копий последовательности нуклеиновой кислоты или множественных копий, комплементарных последовательности нуклеиновой кислоты, применяя по меньшей мере одну из последовательностей нуклеиновых кислот в качестве матрицы. Системы амплификации включают систему полимеразной цепной реакции (ПЦР), систему лигазной цепной реакции (ЛЦР), основанную на последовательности нуклеиновых кислот амплификацию (NASBA, Cangene, Миссиссога, Онтарио), системы О-бета-репликазы, основанную на транскрипции систему амплификации (TAS) и амплификацию с перемещением цепи (SDA). Смотрите, например, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, Persing, et al., eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). Продукт амплификации имеет название ампликон.

[033] Выражение "консервативно модифицированные варианты" применяется как в отношении аминокислотных последовательностей, так и в отношении последовательностей нуклеиновых кислот. В отношении конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или консервативно модифицированные варианты аминокислотных последовательностей. Вследствие вырожденности генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой данный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в любом положении, где аланин определяется кодоном, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой "молчащие вариации" и представляют один вид консервативно модифицированной вариации. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в данном документе, кодирующая полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном для метионина; одно исключение представляет собой Micrococcus rubens, для которого GTG представляет собой метиониновый кодон (Ishizuka, et al., (1993) J. Gen. Microbiol. 139: 425-32) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно настоящему изобретению, подразумевается в каждой описанной полипептидной последовательности и включена в данный документ посредством ссылки.

[034] Выражение "контрольное растение" или "контроль", применяемое в данном документе, может представлять собой нетрансгенное растение родительской линии, применяемой для создания трансгенного растения в данном документе. Контрольное растение может в некоторых случаях быть трансгенной растительной линией, включающей пустой вектор или маркерный ген, но не содержащей рекомбинантный полинуклеотид согласно настоящему изобретению, который экспрессируется в трансгенном растении, подлежащем оцениванию. Контрольное растение в других случаях представляет собой трансгенное растение, экспрессирующее ген с конститутивным промотором. Как правило, контрольное растение представляет собой растение той же линии или сорта, что и трансгенное растение, подлежащее исследованию, не имеющее специфической обеспечивающей признак рекомбинантной ДНК, характеризующей трансгенное растение. Такое растение-предшественник, не содержащее такой специфической обеспечивающей признак рекомбинантной ДНК, может представлять собой естественное растение, растение дикого типа, элитное, нетрансгенное растение или трансгенное растение без специфической обеспечивающей признак рекомбинантной ДНК, характеризующей трансгенное растение. Растение-предшественник, не содержащее специфическую, обеспечивающую признак рекомбинантную ДНК, может представлять собой сибс трансгенного растения, имеющий специфическую, обеспечивающую признак рекомбинантную ДНК. Такое растение-сибс, являющееся предшественником, может включать другую рекомбинантную ДНК.

[035] Как и в отношении аминокислотных последовательностей, специалисту в настоящей области техники понятно, что отдельные замены, делеции или вставки в последовательность нуклеиновой кислоты, пептид, полипептид или белок, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, представляет собой "консервативно модифицированный вариант", когда изменение приводит к замещению аминокислоты химически сходной аминокислотой. Таким образом, любое число аминокислотных остатков, выбранное из группы целых чисел, состоящей из 1-15, может быть изменено таким образом. Таким образом, может быть произведено, например, 1, 2, 3, 4, 5, 7 или 10 изменений. Консервативно модифицированные варианты типично обеспечивают биологическую активность, аналогичную таковой у немодифицированной полипептидной последовательности, из которой они произошли. Например, специфичность к субстрату, активность фермента или связывание лиганда с рецептором, как правило, составляет по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%, предпочтительно 60-90% нативного белка для его нативного субстрата. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих функционально сходные аминокислоты, являются хорошо известными в настоящей области техники.

[036] Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, представляющие собой консервативные замены друг для друга:

1) Аланин (А), Серин (S), Треонин (Т);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (Е);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);

4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (М), Валин (V) и

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W).

7) См. также Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Co. (1984).

[037] Применяемые в данном документе выражения "модифицированный" или "модификация" взаимозаменяемо относятся к преднамеренным или случайным заменам, делениям или вставкам в последовательность нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, изменяющую, добавляющую или удаляющую по меньшей мере один аминокислотный остаток в пределах данного полипептида. Выражение "модифицированная Т6РР", применяемое в данном документе, относится к любой нуклеиновой кислоте, кодирующей Т6РР или пептиды, полипептиды или белок, имеющий активность Т6РР, любой из которых модифицируют так, чтобы полученная Т6РР обеспечивала модифицированную активность Т6РР и/или модифицированное связывание с Т6Р, приводя к улучшенному урожаю и/или устойчивости к абиотическому стрессу у растения по сравнению с немодифицированной Т6РР.

[038] Применяемое в данном документе выражение "гомологичное положение" относится к положению одной или нескольких аминокислот в полипептиде или одной или нескольких пар оснований в полинуклеотидной последовательности, которые находятся в аналогичном или эквивалентном положении во втором полипептиде или полинуклеотиде, который является ортологом, паралогом или гомологом исходной последовательности. Положение аминокислот может находиться в одинаковом функциональном участке двух белков, но может не являться точным численным положением аминокислоты между двумя полипептидными последовательностями. Гомологичное положение аминокислот на двух белках может быть определено с помощью нескольких способов, хорошо известных в настоящей области техники, включая, например, выравнивание последовательностей (например, BLAST), трехмерное моделирование белков (смотрите, например, Sander С. and Scheider R., (1991) PROTEINS: Structure, Function and Genetics 9: 56-68) и подобное.

[039] Под выражением "кодирующий" или "кодируемый" в отношении определенной нуклеиновой кислоты, понимают содержащий информацию для трансляции в определенный белок. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок, может содержать нетранслируемые последовательности (например, интроны) в пределах транслируемых участков нуклеиновой кислоты или может не содержать такие промежуточные нетранслируемые последовательности (например, как в кДНК). Информацию, с помощью которой кодируется белок, определяют путем использования кодонов. Типично, аминокислотная последовательность кодируется нуклеиновой кислотой, применяя "универсальный" генетический код. Тем не менее, варианты универсального кода, такие как присутствуют в некоторых растительных, животных и грибковых митохондриях, бактерии Mycoplasma capricolumn (Yamao, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2306-9) или инфузории Macronucleus, могут применяться, когда нуклеиновая кислота экспрессируется с применением этих организмов.

[040] Когда нуклеиновую кислоту получают или изменяют синтетически, можно использовать преимущество от использования известных предпочтительных кодонов предусмотренного хозяина, в котором будет экспрессироваться нуклеиновая кислота. Например, хотя последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут экспрессироваться как в однодольных, так и двудольных видах растений, последовательности могут быть модифицированы так, чтобы учитывать предпочтения в отношении специфических кодонов и предпочтения в отношении содержание GC для однодольных растений или двудольных растений, поскольку было показано, что эти предпочтения, как было показано, отличаются (Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-98 и в данный документ включена посредством ссылки). Таким образом, предпочтительный кодон маиса для конкретной аминокислоты может быть получен от известных генных последовательностей из маиса. Частота использования кодона маиса для 28 генов из растений маиса перечислена в Таблице 4 Murray, et al., выше.

[041] Применяемое в данном документе выражение "гетерологичный" в отношении нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеиновую кислоту, которая происходит из чужеродного вида, или, если она происходит из того же вида, то существенно модифицирована по сравнению с ее нативной формой в композиции и/или геномном локусе путем преднамеренного вмешательства человека. Например, промотор, функционально связанный с гетерологичным структурным геном происходит из вида, отличного от того, из которого был получен структурный ген или, если он происходит из того же вида, то один или оба являются существенно модифицированными по сравнению с их исходной формой. Гетерологичный белок может происходить их чужеродного вида или, если он происходит из того же вида, то он существенно модифицирован по сравнению с его исходной формой путем преднамеренного вмешательства человека.

[042] Под "клеткой хозяина" понимают клетку, которая содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, которая содержит вектор и поддерживает репликацию и/или экспрессию вектора экспрессии. Клетки хозяина могут представлять собой прокариотические клетки, такие как Е.coli, или эукариотические клетки, такие как клетки дрожжей, насекомых, растений, амфибий или млекопитающих. Предпочтительно, клетки хозяина представляют собой клетки однодольных или двудольных растений, включая, но без ограничения, маис, сорго, подсолнечник, соя, пшеницу, люцерну, рис, хлопок, канолу, ячмень, просо и помидор. Особенно предпочтительная однодольная клетка хозяина представляет собой клетку хозяина маиса.

[043] Выражение "комплекс гибридизации" включает ссылку на структуру двойной спирали нуклеиновых кислот, образованной двумя одноцепочечными последовательностями нуклеиновых кислот, селективно гибридизированных друг с другом.

[044] Выражение "введенный" в контексте введения нуклеиновой кислоты в клетку, с помощью любого средства, такого как "трансфекция", "трансформация" или "трансдукция" и включает ссылку на встраивание нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где нуклеиновая кислота может быть встроена в геном клетки (например, хромосомную, плазмидную, пластидную или митохондриальную ДНК), превращена в автономный репликон, как часть минихромосомы или временно экспрессирована (например, трансфицированная мРНК).

[045] Применяемое в данном документе выражение "пакет генов" относится к введению двух или более генов в геном организма. В определенных аспектах настоящего изобретения может быть желательным подвергнуть стэкингу любой ген абиотического стресса (например, белки холодового шока, гены, связанные с реакцией ABA) с Т6РР, описанной в данном документе. Аналогично, также может быть желательным подвергнуть стэкингу гены трегалозного пути, описанные в данном документе, с генами, обеспечивающими устойчивость к воздействию насекомых, устойчивость к болезням, увеличенную урожайность или любой другой благоприятный признак (например, увеличенная высота растения и т.д.), известный в настоящей области техники. Альтернативно, трансгенные растения, содержащие модифицированный ген трегалозного пути, могут быть подвергнуты стэкингу с аллелями нативного признака, которые обеспечивают дополнительные признаки, такие как, улучшенное использование воды, увеличенную устойчивость к болезням и подобное. В одном варианте осуществления растения, экспрессирующие модифицированные гены трегалозного пути, подвергаются стэкингу с аллелями, описанными в WO 2011/079277. Признаки могут быть подвергнуты стэкингу путем введения кассет экспрессии с множественными генами или выведения/скрещивания растений с одним или несколькими признаками с другими растениями, содержащими один или несколько дополнительных признаков.

[046] Выражения "выделенный" относится к материалу, такому как нуклеиновая кислота или белок, который существенно или по сути не содержит компоненты, обычно сопровождающих его или взаимодействующих с ним, как это встречается в его естественном окружении. Выделенный материал необязательно содержит материал, не встречающийся вместе с материалом в его естественном окружении. Нуклеиновые кислоты, являющиеся "выделенными", как определено в данном документе, также имеют название "гетерологичные" нуклеиновые кислоты. Если иное не заявлено, то выражение "NUE нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, содержащую полинуклеотид ("NUE полинуклеотид"), кодирующий NUE полипептид полной или частичной длины.

[047] Применяемая в данном документе "нуклеиновая кислота" включает ссылку на дезоксирибонуклеотидный или рибонуклеотидный полимер в форме одинарной или двойной цепи и, если нет иных ограничений, включает известные аналоги, имеющие основную природу естественных нуклеотидов в том отношении, что они гибридизируются с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами способом, аналогичным таковому у встречающихся в природе нуклеотидов (например, пептидные нуклеиновые кислоты).

[048] Под выражением "библиотека нуклеиновых кислот" понимают коллекцию выделенных молекул ДНК или РНК, которые содержат в одном случае основное представление всей транскрибируемой фракции