Синтетические транзитные пептиды хлоропластов

Синтетические транзитные пептиды хлоропластов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ЗАЯВКА НА ПРИОРИТЕТ

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной патентной заявки США, серийный номер 61/593555, поданной 1 февраля 2012 года, а также предварительной патентной заявки США, серийный номер 61/625222, поданной 17 апреля 2012 года.

ЗАЯВЛЕНИЕ В СООТВЕТСТВИИ С 37 CFR § 1,821 (с) или (е) - перечень последовательностей представлен в виде текстового файла ASCII

В соответствии с 37 CFR § 1,821 (с) или (е), файл, содержащий список последовательностей в текстовой версии ASCII, представлен одновременно с настоящей заявкой, и его содержание включено в настоящее описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для генетически кодирования и экспрессии полипептидов, которые нацелены на пластиды из пластид-содержащих клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к аминокислотным последовательностям, которые нацеливают полипептиды на хлоропласты (например, у высших растений) и/или к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим эти полипептиды. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к химерным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая регулирует перенос химерных полипептидов в пластиды, и/или к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих эти полипептиды.

УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Растительные клетки содержат различные субклеточные органеллы, в совокупности называемые "пластидами", которые отделены друг от друга посредством характерных мембранных систем и выполняют специализированные функции в клетке. Конкретные пластиды отвечают за фотосинтез, а также за синтез и хранение определенных химических соединений. Все пластиды происходят от пропластидов, которые присутствуют в меристемных зонах растения. Пропластиды могут развиваться, например, в хлоропласты, этиопласты, хромопласты, геронтопласты, лейкопласты, амилопласты, элайопласты и протеинопласты. Пластиды имеют самостоятельную генетическую систему и механизм синтеза белка, и существуют внутри клетки в полуавтономном режиме, но в основе их развития лежит тесное взаимодействие с ядерно-цитоплазматической системой и процессами биосинтеза.

В фотосинтезирующих клетках листьев высших растений самыми выраженными пластидами являются хлоропласты. Наиболее важной функцией хлоропластов является осуществление светоуправляемых реакций фотосинтеза. При этом хлоропласты также выполняют многие другие процессы биосинтеза, важные для растительной клетки. Например, все жирные кислоты в клетке вырабатываются с помощью ферментов, расположенных в строме хлоропласта, с использованием АТФ, NAOPH и углеводов, которые в ней легко доступны. Кроме того, уменьшение силы свето-активируемых электронов в хлоропласте приводит к восстановлению нитрита (NО₂^-) до аммиака (NH₃), и этот аммиак обеспечивает растение азотом, необходимым для синтеза аминокислот и нуклеотидов.

Хлоропласт также вовлечен в явления, имеющие особое значение в агрохимической промышленности. Например, известно, что многие гербициды действуют путем блокирования функций, которые осуществляются в хлоропласте. В недавних исследованиях была установлена конкретная цель некоторых гербицидов. Например, гербициды - производные триазина ингибируют фотосинтез путем замещения молекулы пластохинона из ее сайта связывания в полипептиде массой 32 кДа из фотосистемы II. Этот полипептид массой 32 кДа кодируется в геном хлоропласта и синтезируется с помощью механизмов органелл. Были получены мутантные растения, обладающие устойчивостью к триазиновым гербицидам. Эти растения содержат мутантный полипептид массой 32 кДа, в котором пластохинон больше не может замещаться триазиновыми гербицидами. Сульфонилмочевины ингибируют ацетолактатсинтазу в хлоропластах. Ацетолактатсинтаза участвует в синтезе изолейцина и валина. Глифосат ингибирует функцию 5-енол-пирувил-3-фосфошикимат-синтазы (EPSPS), которая представляет собой фермент, участвующий в синтезе ароматических аминокислот. Все эти ферменты кодируются ядерным геномом, при этом они переносятся в хлоропласт, где фактически происходит синтез аминокислот.

Большинство белков хлоропласта кодируется в ядре растительной клетки, синтезируется в виде крупных белков-предшественников в цитозоле и после трансляции поступает в хлоропласт. Введение в строму через наружную и внутреннюю мембраны оболочек является основным способом поступления белков, предназначенных для стромы, тилакоидной мембраны и просвета тилакоида. Размещение поступающих белков-предшественников в тилакоидной мембране и тилакоидном просвете осуществляется четырьмя разными механизмами, включающими в себя два механизма, которые гомологичны системам транспорта бактериальных белков. Таким образом, механизмы локализации белка в хлоропласте, в частности, происходят из прокариотического эндосимбионта. Cline and Henry (1996) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12: 1-26.

Белки-предшественники, предназначенные для хлоропластной экспрессии, содержат удлиняющие сегменты на N-конце, называемые транзитными пептидами хлоропластов (СТР). Транзитный пептид является инструментом для специфичного распознавания на поверхности хлоропластов и опосредования посттрансляционной транслокации белков-предшественников через оболочку хлоропласта и, следовательно, в различные подотделы в самом хлоропласте (например, в строму, тилакоид и тилакоидную мембрану). Эти последовательности N-концевого транзитного пептида содержат всю информацию, необходимую для поступления белка хлоропласта в пластиды, эти последовательности транзитного пептида являются необходимыми и достаточными для введения пластид.

Гены растений с известным наличием природно-кодируемых последовательностей транзитных пептидов на N-конце включают в себя хлоропластную малую субъединицу из рибулозо-1,5-бисфосфат кароксилазы (RuBisCo) (de Castro Silva-Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-80, Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3335-42), EPSPS (см., например, Archer et al. (1990) J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810 и патенты США 6867293, 7045684 и Re 36449), триптофансинтазу (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6081-7), пластоцианин (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. (1997) 272: 20357-63), хоризматсинтазу (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:27447-57), белок, связывающий образующийся на свету хлорофилл a/b (LHBP), (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263 14996-14999) и хлоропластный белок Arabidopsis thaliana (Lee et al. (2008) Plant Cell 20:1603-22). В американской патентной публикации US2010/0071090 представлены некоторые нацеленные на хлоропласты пептиды из Chlamydomonas sp.

Вместе с тем остаются неясными структурные условия в отношении информации, кодируемой нацеленными на хлоропласты пептидами, в связи с высоким уровнем вариабельности последовательностей и отсутствием общих или консенсусных мотивов последовательностей, хотя вполне возможно существование отдельных подгрупп нацеленных на хлоропласты пептидов с независимыми структурными мотивами. Lee et al. (2008), см. выше. Дополнительно, не все из этих последовательностей играют роль в гетерологичной экспрессии нацеленных на хлоропласты белков у высших растений.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении описаны композиции и способы для нацеливания полипептидов на пластиды в растении. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетический транзитный пептид хлоропластов (например, пептид TraP23), который функционально связан с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В конкретных вариантах осуществления такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть полезны для экспрессии и нацеливания полипептида, кодируемого представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, в однодольных или двудольных растениях. Дополнительно описаны векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетический транзитный пептид хлоропластов, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, представляющей интерес.

В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая синтетический СТР, может представлять собой нуклеотидную последовательность, происходящую из эталонной нуклеотидной последовательности, полученную при выравнивании ферментов 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSPS) или ее функционального варианта. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая синтетический СТР, может представлять собой нуклеотидную последовательность, содержащую часть CTP-кодирующей нуклеотидной последовательности из различных организмов, или ее функциональный вариант. В конкретных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая синтетический СТР, может содержать смежные нуклеотидные последовательности, полученные из каждой из эталонной EPSPS CTP, или из функциональных вариантов любой из вышеперечисленных последовательностей. В этих и других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая синтетический СТР, может представлять собой нуклеотидную последовательность, содержащую более одной CTP-кодирующей нуклеотидной последовательности.

В некоторых примерах нуклеотидная последовательность, кодирующая синтетический СТР, может представлять собой нуклеотидную последовательность, содержащую часть нуклеотидной последовательности СТР из фермента EPSPS, или ее функциональные варианты. В конкретных примерах нуклеотидная последовательность, кодирующая синтетический СТР, может содержать смежные нуклеотидные последовательности, полученные из фермента EPSPS, или их функциональные варианты.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один полученный из EPSPS агент для нацеливания полипептида на хлоропласты. Дополнительно описаны молекулы нуклеиновых кислот, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере один полученный из EPSPS агент для нацеливания полипептида на хлоропласты, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В конкретных вариантах осуществления такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть полезны для экспрессии и нацеливания полипептида, кодируемого представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, в однодольных или двудольных растениях. Для целей настоящего изобретения, полученный из EPSPS агент для нацеливания полипептида на хлоропласт относится к конкретным синтетическим нуклеотидным последовательностям. В конкретных вариантах осуществления полученный из EPSPS агент для нацеливания полипептида на хлоропласт выбирают из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей, указанных в настоящем изобретении как TraP23.

Также в изобретении описаны растительные материалы (например, и без ограничения, растения, ткани растений и клетки растений), содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетический СТР, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления растительный материал может иметь такую молекулу нуклеиновой кислоты, стабильно интегрированную в свой геном. В некоторых вариантах осуществления растительный материал может транзиторно экспрессировать продукт молекулы нуклеиновой кислоты, содержащий по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетический СТР, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления растительный материал представляет собой растительную клетку, которая неспособна к регенерации для получения растения.

В изобретении также описаны способы для экспрессии нуклеотидной последовательности в пластид-содержащей клетке (например, в растении) в пластиде (например, в хлоропласте) из пластид-содержащей клетки. В конкретных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетический СТР, которая функционально связана с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, может быть использована для трансформации растительной клетки, таким образом, что синтез полипептида-предшественника слияния, содержащего синтетический CTP, слитый с продуктом экспрессии из представляющей интерес нуклеотидной последовательности, происходит в цитоплазме растительной клетки, и затем слитый полипептид транспортируется in vivo в хлоропласт растительной клетки. В некоторых вариантах осуществления таких способов растительную клетку невозможно регенерировать для получения растения.

Дополнительно в изобретении описаны способы производства трансгенного растения, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетический СТР, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Также в изобретении описаны товарные растительные продукты (например, семена), полученные из таких трансгенных растений.

Вышеуказанные и другие признаки станут более очевидными из последующего подробного описания нескольких вариантов осуществления, которые выполнены со ссылкой на прилагаемые чертежи.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 показывает молекулы мРНК, которые представляют конкретные примеры нуклеотидной последовательности, кодирующей синтетический CTP (например, TraP23), функционально связанной с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления молекулы мРНК (такие, как показанные в фигуре) могут транскрибироваться из молекулы ДНК, которая содержит открытую рамку считывания, включающую в себя последовательность, кодирующую синтетический CTP, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, может быть последовательностью, кодирующей рассматриваемый пептид, например, и без ограничения, маркерный генный продукт или пептид для нацеливания на пластиды.

Фигура 2 показывает выравнивание нескольких последовательностей транзитных пептидов хлоропластов EPSPS. Заштрихованные аминокислотные остатки показывают аминокислотные последовательности, которые были выбраны для TraP23.

Фигура 3 показывает карту плазмиды pDAB 107640.

Фигура 4 представляет собой изображение микроскопии инфильтрации TraP23-GFP в листовой ткани табака.

Фигура 5 показывает карту плазмиды pDAB106598.

Фигура 6 представляет собой изображение микроскопии TraP23-GFP, трансформированного в протопласты кукурузы, показывающее транслокацию в хлоропласты из протопласта кукурузы.

Фигура 7 показывает карту плазмиды pDAB 109808.

Фигура 8 показывает карту плазмиды pDAB107687.

СПОСОБ (СПОСОБЫ) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор некоторых вариантов

Транзитный пептид хлоропласта (CTP) (или пластидный транзитный пептид) действует ко-трансляционно или посттрансляционно, нацеливая содержащий CTP полипептид на пластиды (например, хлоропласт). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения на хлоропласт могут быть нацелены как эндогенные белки хлоропластов, так и гетерологичные белки, путем экспрессии такого белка в виде более крупного полипептида-предшественника, содержащего CTP. В конкретных вариантах осуществления CTP может быть получен из нуклеотидной последовательности, полученной при выравнивании ферментов 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSPS), например, и без ограничения, путем включения по меньшей мере одной смежной последовательности из ортологичного гена, полученной из другого организма, или ее функционального варианта.

В примере варианта осуществления были получены последовательности нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует CTP, при выравнивании белковых последовательностей EPSPS (фиг. 2). CTP-кодирующие последовательности были выделены путем анализа последовательности генов EPSPS с помощью прогностического сервера ChloroP (ChloroP prediction server, Emanuelsson et al. (1999) Protein Science 8:978-84 (доступный ресурс: cbs.dtu.dk/services/ChloroP)). Предсказанные белковые продукты выделенных CTP-кодирующих последовательностей представляют собой транзитные пептиды длиной примерно 60-70 аминокислот. В этом примере для получения нового синтетического СТР использовали выравнивание последовательностей CTP EPSPS в качестве эталонной последовательности для создания образца синтетического CTP путем случайного выбора аминокислот. Этот способ конструирования демонстрирует свойства получения синтетического CTP. Образец синтетического CTP в настоящем раскрытии называется TraP23. Образец синтетического TraP23 тестировали на пластид-нацеливающие функции и было показано, что он проявляет нацеливание на пластиды по меньшей мере с тем же преимуществом, которое наблюдается непосредственно у нативных CTP-последовательностей.

Еще в одном примере варианта осуществления были независимо синтезированы последовательности нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует синтетический пептид TraP по изобретению и функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), с целью получения молекулы синтетических нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует химерный слитый полипептид TraP:GFP. Каждую из таких молекул нуклеиновых кислот, кодирующих химерный полипептид TraP:GFP, вставляли в бинарный вектор таким образом, что каждая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая TraP: GFP, была функционально связана с промотором AtUbi10.

Еще в одном примере варианта осуществления каждый из бинарных векторов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую TraP:GFP, функционально связанную с промотором AtUbi10, независимо друг от друга и транзиторно трансформировали в табак (Nicotiana benthamiana) посредством Agrobacterium-опосредованной трансформации. С помощью конфокальной микроскопии и Вестерн-блоттинга было подтверждено, что каждый TraP успешно нацеливал GFP на хлоропласты табака.

Еще в одном примере варианта осуществления была независимо синтезирована последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая синтетический пептид TraP по изобретению и функционально связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей агрономически важную последовательность генов. Последовательность TraP была слита с признаком переносимости гербицидов (например, dgt-28) для получения молекулы синтетической нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный слитый полипептид TraP:dgt-28. Такую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный полипептид TraP:dgt-28, вставляли в бинарный вектор, таким образом, что каждая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая TraP:dgt-28, была функционально связана с промотором и другими регуляторными элементами гена. Бинарную, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую TraP:dgt-28, использовали для трансформации различных видов растений. Трансгенные растения анализировали на толерантность к гербицидам, обусловленную экспрессией и транслокацией фермента dgt-28 в хлоропласте.

Еще в одном примере варианта осуществления была независимо синтезирована последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая синтетический пептид TraP согласно изобретению, и функционально связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей агрономически важные последовательности генов. Последовательность TraP была слита с признаком устойчивости к насекомым (например, cry2Ad) для получения молекулы синтетической нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный слитый полипептид TraP:Cry2Aa. Такую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный полипептид TraP:Cry2Aa, вставляли в бинарный вектор, таким образом, что каждая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая TraP:cry2aa, была функционально связана с промотором и другими регуляторными элементами гена. Бинарную, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую TraP:cry2aa, использовали для трансформации различных видов растений. С трансгенными растениями проводили биологические исследования на устойчивость к насекомым, обусловленную экспрессией и транслокацией фермента Cry2Aa в хлоропласте.

В свете вышеупомянутых подробных практических примеров, можно использовать последовательности синтетического CTP по изобретению и кодирующие их нуклеиновые кислоты для нацеливания любого полипептида на пластиды в широком диапазоне пластид-содержащих клеток. Например, способами, доступными специалистам в данной области техники с помощью настоящего изобретения, в пластид-содержащую клетку-хозяина можно вставлять (или экспрессировать) химерный полипептид, содержащий последовательность синтетического CTP, слитую с N-концом любой второй пептидной последовательности, для нацеливания на пластиды второй пептидной последовательности. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления, по сравнению с нативным CTP, пептид TraP по изобретению может обеспечить повышенную эффективность введения и процессирования пептида, для которого желательна экспрессия пластид.

II. Сокращения

СТР - транзитный пептид хлоропласта

EPSPS - 3-енолпирувилшикимат-5-фосфат синтетаза

YFP - желтый флуоресцентный белок

Ti - индуцирующие опухоль (плазмиды, происходящие из А. tumefaciens)

Т-ДНК - трансферная ДНК

III. Терминология

Для облегчения понимания различных вариантов осуществления настоящего раскрытия приведены следующие пояснения специальных терминов:

Транзитный пептид хлоропласта: используемый в изобретении термин "транзитный пептид хлоропласта" (СТР) (или "транзитный пептид пластид") может относиться к аминокислотной последовательности, которая, в случае ее присутствия на N-конце полипептида, направляет поступление полипептида в пластиду из пластид-содержащей клетки (например, клетки растения, например, в цельном растении или в культуре растительных клеток). Обычно CTP необходим и достаточен для направления поступления белка в пластиду клетки-хозяина (например, в первичную, вторичную или третичную пластиду, такую как хлоропласт). Предполагаемый транзитный пептид хлоропласта может быть идентифицирован с помощью одного из нескольких доступных алгоритмов (например, PSORT и ChloroP (доступный в cbs.dtu.dk/services/ChloroP)). Алгоритм ChloroP может давать особенно хорошее предположение СТР. Emanuelsson et al. (1999) Protein Science 8: 978-84. Тем не менее, с помощью любого существующего алгоритма не достигается 100% эффективности предположения функционального СТР. Поэтому, важно убедиться, что идентифицированные предполагаемые CTP действительно обладают намеченной функцией, например, с помощью методик in vitro или in vivo.

Транзитные пептиды хлоропласта могут быть расположены на N-конце полипептида, который поступает в пластиды. CTP может способствовать ко-трансляционному или посттрансляционному транспорту содержащего CTP полипептида в пластиды. Обычно транзитные пептиды хлоропласта содержат приблизительно от 40 приблизительно до 100 аминокислот, и у таких CTP выявляют наличие определенных общих характеристик. Например: CTP почти не содержат отрицательно заряженных аминокислот (например, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина или глутамина); на N-концевых участках СТР отсутствуют заряженные аминокислоты глицин и пролин; предполагается, что центральная область CTP имеет очень высокое содержание основных или гидроксилированных аминокислот (таких как серин и треонин); и предполагается, что С-концевая область CTP богата аргинином и имеет возможность содержать амфипатическую бета-пластинчатую структуру. Протеазы пластид могут расщеплять CTP из остальной части содержащего CTP полипептида после поступления полипептида в пластиды.

Контакт: используемый в изобретении термин "контакт с" клеткой, тканью или организмом или "захват посредством" клетки, ткани или организма (например, клеток растения, ткани растения и растения), в отношении молекулы нуклеиновой кислоты включает в себя интернализацию молекулы нуклеиновой кислоты в организме, например, и без ограничения: контактирование организма с композицией, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, и вытяжку из организмов с раствором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты.

Эндогенный: используемый в изобретении термин "эндогенный" относится к веществам (например, к молекулам нуклеиновых кислот и полипептидам), которые происходят из конкретного организма, ткани или клетки. Например, "эндогенный" полипептид, экспрессируемый в клетке растения, может относиться к полипептиду, который обычно экспрессируется в клетках того же типа из не-генноинженерных растений того же вида. В некоторых примерах можно использовать эндогенный ген (например, ген EPSPS) для получения эталонной последовательности CTP.

Экспрессия: используемый в изобретении термин "экспрессия" кодирующей последовательности (например, гена или трансгена) относится к способу, с помощью которого кодированная информация о транскрипционной единице нуклеиновой кислоты (включающей в себя, например, геномную ДНК или кДНК) преобразуется в функциональную, нефункциональную или структурную части клетки, часто включая в себя синтез белка. Экспрессия генов может зависеть от внешних сигналов, например, от воздействия на клетки, ткани или организм какого-либо агента, который увеличивает или уменьшает экспрессию генов. Экспрессия гена также может регулироваться в любой части пути от ДНК к РНК в белок. Регуляция экспрессии генов происходит, например, с помощью элементов контроля, действующих в ходе транскрипции, трансляции, транспорта РНК и процессирования, деградации промежуточных молекул, таких как мРНК, или посредством активации, инактивации, компартментализации или деградации специфичных белковых молекул после их образования, или посредством комбинации этих явлений. Экспрессию гена можно измерять на уровне РНК или на уровне белка любым способом, известным в данной области, например, и без ограничения: с помощью нозерн-блоттинга, ПЦР в реальном времени (RT-PCR), вестерн-блоттинга, или путем анализа активности белка (белков) in vitro, in situ и in vivo.

Генетический материал: используемый в изобретении термин "генетический материал" включает в себя все гены и молекулы нуклеиновых кислот, такие как ДНК и РНК.

Гетерологичный: используемый в изобретении термин "гетерологичный" относится к веществам (например, молекулам нуклеиновых кислот и полипептидам), которые не происходят из конкретного организма, ткани или клетки. Например, "гетерологичный" полипептид, экспрессируемый в растительной клетке, может означать полипептид, который обычно не экспрессируется в клетках того же типа из не-генноинженерных растений того же вида (например, полипептид, который экспрессируется в разных клетках одного и того же организма или клетках другого организма).

Выделенный: используемый в изобретении термин "выделенный" относится к молекулам (например, к молекулам нуклеиновых кислот и полипептидам), которые, по существу, отделены или очищены от других молекул того же типа (например, от других молекул нуклеиновых кислот и других полипептидов), с которым эти молекулы обычно ассоциированы в клетке организма, в котором эта молекула встречается в природе. Например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть, по существу, отделена или очищена от хромосомной ДНК или внехромосомной ДНК в клетке организма, в котором молекула нуклеиновой кислоты встречается в природе. Таким образом, этот термин включает в себя рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот и полипептиды, которые очищены биохимически таким образом, что удалены другие молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды и клеточные компоненты. Этот термин также включает в себя рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, химически синтезированные молекулы нуклеиновых кислот и полипептиды, полученные рекомбинантным способом.

Термин "по существу очищенный", используемый в изобретении, относится к молекуле, которая отделена от других молекул, обычно ассоциированных с ней в ее нативном состоянии. По существу очищенная молекула может являться преобладающим видом, присутствующим в композиции. По существу очищенная молекула может не содержать, например, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере на 75%, или по меньшей мере на 90% не содержать других молекул, кроме растворителя, присутствующего в природной смеси. Термин "по существу очищенный" не относится к молекулам, находящимся в их нативном состоянии.

Молекула нуклеиновой кислоты: используемый в изобретении термин "молекула нуклеиновой кислоты" относится к полимерной форме нуклеотидов, которые могут включать в себя как смысловые, так и антисмысловые цепочки РНК, кДНК, геномной ДНК и их синтетические и смешанные формы и полимеры. Нуклеотид может относиться к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или к модифицированной форме нуклеотида любого типа. Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый в изобретении, является синонимом терминов "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид". Молекула нуклеиновой кислоты обычно имеет длину по меньшей мере 10 оснований, если не указано иное. Этот термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы ДНК. Молекулы нуклеиновых кислот включают в себя димерные (так называемые тандемные) формы и продукты транскрипции молекул нуклеиновых кислот. Молекула нуклеиновой кислоты может включать в себя природные и модифицированные нуклеотиды, или один из них, или оба, которые связаны друг с другом посредством природных и/или неприродных нуклеотидных связей.

Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы химически или биохимически, или могут содержать неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания, что будет легко понять специалистам в данной области. Такие модификации включают в себя, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких природных нуклеотидов на аналог, межнуклеотидные модификации (например, незаряженные связи: например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.; заряженные связи: например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.; боковые группы: например, пептиды; интеркаляторы: например, акридин, псорален и т.д.; энтеросорбенты; алкилирующие и модифицированные связи: например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также включает в себя любую топологическую конформацию, в том числе одноцепочечные, двухцепочечные, частично дуплексные, триплексные, шпилечные, круговые конформации и конформации типа висячий замок.

Используемый в изобретении по отношению к ДНК термин "кодирующая последовательность", "структурная нуклеотидная последовательность" или "структурная молекула нуклеиновой кислоты" относится к нуклеотидной последовательности, которая, в конечном счете, транслируется в полипептид посредством транскрипции и мРНК, находящейся под контролем подходящих регуляторных последовательностей. По отношению к РНК термин "кодирующая последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая транслируется в пептид, полипептид или белок. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Кодирующие последовательности включают в себя без ограничения геномную ДНК, кДНК, экспрессирующиеся маркерные последовательности (EST) и рекомбинантные нуклеотидные последовательности.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает в себя нуклеотидные последовательности, которые могут быть выделены, очищены или частично очищены, например, способами разделения, таких как, например, ионообменная хроматография, эксклюзионным способом на основе молекулярных размеров или на основе аффинности, с помощью методик фракционирования на основе растворимости в различных растворителях и способов генной инженерии, таких как амплификация, клонирование и субклонирование.

Идентичность последовательности: термин "идентичность последовательности" или "идентичность", используемый в изобретении в отношении двух последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов, может относиться к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми, при их выравнивании на максимальное соответствие на протяжении определенного окна сравнения.

Используемый в изобретении термин "процент идентичности последовательностей" может относиться к значению, определенному путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей (например, последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей) в окне сравнения, при этом для оптимального выравнивания двух последовательностей часть последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций). Процент рассчитывают путем определения числа положений, в которых идентичный нуклеотид или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения, и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Описаны различные программы и алгоритмы выравнивания, например, Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Подробное рассмотрение способов выравнивания последовательностей и расчетов гомологии можно найти, например, в публикации Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10.

Продукт Национального центра биотехнологической информации (NCBI) - программу Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™, Altschul et al. (1990)) можно получить из нескольких источников, в том числе в Национальном центре биотехнологической информации (Bethesda, MD), и из Интернета, для использования в качестве программы анализа нескольких последовательностей. Описание алгоритма определения идентичности последовательности с помощью этой программы доступно в Интернете в разделе "помощь" для программы BLAST™. Для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот можно использовать функцию "Blast 2 последовательности" программы BLAST™ (BLASTN), задействуя установки матрицы BLOSUM62 по умолчанию с параметрами по умолчанию. При оценке этим способом последовательности нуклеиновых кислот с более высоким сходством с эталонными последовательностями будут показывать возрастающий процент идентичности.

Специфично гибридизуемый/специфично комплементарный: используемые в изобретении термины "специфично гибридизуемый" и "специфично комплементарный" указывают на достаточную степень комплементарности, при которой возникает стабильное и специфичное связывание между молекулой нуклеиновой кислоты и целевой молекулой нуклеиновой кислоты. Гибридизация между двумя молекулами нуклеиновых кислот охватывает образование анти-параллельного выравнивания между нуклеиновокислотными последовательностями двух молекул нуклеиновых кислот. Эти две молекулы затем способны создавать водородные связи с соответствующими основаниями на противоположной цепи с образованием дуплексной молекулы, которая при достаточной стабильности поддается обнаружению с помощью способов, хорошо известных в данной области. Чтобы быть специфично гибридизуемой, молекула нуклеиновой кислоты не обязательно должна быть на 100% комплементарной своей целевой последовательности. Тем не менее количественные показатели комплементарности последовательностей, которые необходимы для специфичности гибридизации, зависят от применяемых условий гибридизации.

Условия гибридизации, дающие конкретные степени строгости, будут варьироваться в зависимости от природы выбранного способа гибридизации, и композиции и длины гибридизуемых последовательностей нуклеиновых кислот. В общем, строгость гибридизации будет определяться температурой гибридизации и ионной силой (в осо