Модифицированный биотин-связывающий белок, слитые белки на его основе и их применение

Модифицированный биотин-связывающий белок, слитые белки на его основе и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной патентной заявке США 61/484934, поданной 11 мая 2011; 61/608168, поданной 8 марта 2012; и 61/609,974, поданной 13 марта 2012 в соответствии с §119(е) раздела 35 кодекса США, содержание каждой из которых приведено здесь во всей полноте для ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к биотин-связывающим белкам и слитым белкам/композициям, включающим данные биотин-связывающие белки. Также здесь описаны способы экспрессирования биотин-связывающих белков и/или слитых белков на их основе с высоким выходом и растворимых в бактериях.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Биотин-связывающий белок и его производные могут широко использоваться в различных областях. Тем не менее, продуцирование или очистка рекомбинантных биотин-связывающих белков может быть очень сложной. При экспрессии в Е. coli наибольшая часть биотин-связывающих белков скапливается в тельцах включений, при этом требуется денатурирование, рефолдинг и утомительный даунстрим-процессинг при получении активных белков. Экспрессия в Е. coli является предпочтительной в связи с низкой стоимостью производства и потенциальной возможностью дальнейшей обработки; таким образом, биотин-связывающие белки, которые могут быть эффективно продуцированы в Е. coli, являются очень востребованными. Также экспрессия в Е. coli предоставляет возможность создавать рекомбинантные слитые белки, содержащие биотин-связывающий белок для различных вариантов применения. Соответственно, в данной области существует потребность в биотин-связывающих белках и слитых белках, содержащих биотин-связывающие белки, которые могут быть экспрессированы в Е. coli в растворимой форме и с высокими уровнями выхода.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одной задачей настоящего изобретения является создание рекомбинантного биотин-связывающего белка, который может быть экспрессирован в Е. coli в растворимой форме с высокими уровнями выхода. Соответственно, настоящее изобретение относится к биотин-связывающим белкам и содержащим их композициям. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный биотин-связывающий белок включает сигнальную последовательность Е. coli в N-конце аминокислотной последовательности, включающей аминокислоты 45-179 (FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLT GRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD, SEQ ID NO:1) Ризавидина дикого типа (rhavi). В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность Е. coli представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID No:2). Эта сигнальная последовательность может быть слита с последовательностью, включающей аминокислоты 45-179 rhavi дикого типа, с помощью гибкого пептидного линкера.

Здесь также предусмотрен способ экспрессирования биотин-связывающего белка в растворимой форме в Е. coli с высоким выходом. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает экспрессию биотин-связывающего белка в Е. coli, при этом нативная сигнальная последовательность биотин-связывающего белка заменена на сигнальную последовательность Е. coli. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID No:2).

В другом аспекте изобретение относится к биотин-связывающему слитому белку, включающему биотин-связывающий домен и белок или пептид.

В другом аспекте здесь предусмотрен липидированный биотин-связывающий белок. В соответствии с использованным здесь значением термин "липидированный биотин-связывающий белок" означает биотин-связывающий белок, который ковалентно связан с липидом. Липидированные биотин-связывающие белки представляют собой лиганды или агонисты Toll-подобного рецептора 2. Соответственно здесь также предусмотрены способы индуцирования иммунного ответа у субъекта. Способ включает введение субъекту композиции, включающей липидированный биотин-связывающий белок.

Здесь также предусмотрен способ экспрессирования липидированного биотин-связывающего белка в Е. coli. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает экспрессию липидированного биотин-связывающего белка в Е. coli, при этом нативная сигнальная последовательность биотин-связывающего белка заменена на сигнальную последовательность Е. coli, содержащую мотив липидизации. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность представляет собой MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID No:3).

В другом аспекте здесь предусмотрено негемолитическое производное альфа-гемолизина (Hla) Staphylococcal aureus. Описанное здесь производное Hla может быть в форме слитого белка, при этом данный слитый белок включает домен производного Hla и биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах данного аспекта биотин-связывающий домен представляет собой описанный здесь биотин-связывающий белок. Подобно липидированным биотин-связывающим белкам, варианты Hla или их слитые белки с описанными здесь биотин-связывающими белками также представляют собой лиганды или агонисты Toll-подобных рецепторов или других рецепторов опознавания паттерна (PRR). Соответственно, здесь также предусмотрены способы индуцирования иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения данный способ включает введение субъекту композиции, включающей негемолитические Hla варианты или их слитые белки с описанным здесь биотин-связывающим белком.

В другом аспекте здесь предусмотрена иммуногенная или вакцинная композиция, включающая биотин-связывающий белок, липидированный биотин-связывающий белок, биотин-связывающий слитый белок, включающий биотин-связывающий домен и антигенный белок или пептид. В некоторых вариантах данного аспекта антигенный белок представляет собой негемолитическое производное описанного здесь Н1а.

Здесь также предусмотрен способ вакцинирования субъекта, например млекопитающего, например человека, иммуногенными композициями согласно тому, как описано здесь, при этом данный способ включает введение композиции описанной здесь вакцины субъекту.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой схему модифицированного биотин-связывающего белка в соответствии с описанным здесь вариантом осуществления изобретения.

Фиг.2 представляет собой SDS-PAGE описанного здесь очищенного рекомбинантного биотин-связывающего белка.

Фиг.3 представляет собой схему слитого белка, включающего биотин-связывающий белок и антиген X.

Фиг.4 является примерный SDS-PAGE очищенных Ризавидин-слитых белков.

Фиг.5 представляет собой схему липидированного биотин-связывающего белка в соответствии с описанным здесь вариантом осуществления изобретения.

Фиг.6 представляет собой SDS-PAGE описанного здесь липидированного биотин-связывающего белка.

Фиг.7 представляет собой гистограмму зависящей от дозировки TLR2 активности липидированного биотин-связывающего белка.

Фиг.8 представляет собой схему рекомбинантного альфа-гемолизина (Hia) S. aureus дикого типа или мутанта и его описанные здесь слитые белки Ризавидина. В негемолитическом Hla были осуществлены точечные мутации следующим образом: (i) остаток 205 W на A; (ii) остаток 213 W на А; или (iii) остатки 209-211 DRD на ААА.

Фиг.9 представляет собой SDS-PAGE очищенного Hla дикого типа или его негемолитических вариантов.

Фиг.10 представляет собой SDS-PAGE очищенных биотин-связывающих слитых белков Hla дикого типа или его негемолитических вариантов.

Фиг.11 представляет собой линейный график гемолитической активности Hla дикого типа или его негемолитических вариантов.

Фиг.12 представляет собой линейный график гемолитической активности Hla дикого типа, негемолитических вариантов Hla и биотин-связывающих белков Hla дикого типа и их негемолитических вариантов.

Фиг.13 представляет собой гистограмму, показывающую что стимулирование макрофагов биотин-связывающим слитым белком (rhavi-Hla209) индуцирует множественный воспалительный цитокинез.

Фиг.14 представляет собой гистограмму, показывающую что комплекс системы множественной презентации антигена (MAPS), содержащий липидированный Ризавидин или rhavi-Hla209, индуцирует более сильные ответы Т-клеток на антигены.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Должно являться понятным, что данное изобретение не ограничено конкретной описанной здесь композицией, методологией, протоколами, реагентами и так далее, и что они могут быть различными. Используемая здесь терминология предназначена исключительно для цели описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения охватываемой настоящим изобретением области, определенной исключительно пунктами формулы изобретения.

Без связи с какой-либо теорией, считается, что низкий уровень экспрессии биотин-связывающего белка в уровне техники может быть связан с плохим фолдингом, вызываемым дисульфидными связями в каждом мономере биотин связывающего белка, которая не образуется или образуется на крайне малых уровнях в цитоплазме Е. coli. Изобретатели обнаружили, что правильный фолдинг может быть достигнут путем транспортирования в периплазматическое пространство Е. coli. Таким образом, степень правильного фолдинга рекомбинантных биотин-связывающих белков может быть увеличена путем замены полной нативной сигнальной последовательности биотин-связывающего белка на сигнальную последовательность секреции Е. coli. Без связи с какой-либо теорией, считается, что это способствует транслокации рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток Е. coli. Транслокация рекомбинантного белка в периплазматическое пространство Е. coli может затем обеспечить функционально важную дисульфидную связь в биотин-связывающем белке (например, в Ризавидине) и белок может правильно фолдироваться в растворимой форме и с высокими уровнями выхода.

В одном аспекте здесь предусмотрен биотин-связывающий белок, который может быть экспрессирован в растворимой форме и с высоким выходом в Е. coli. В соответствии с использованным здесь значением "биотин-связывающий белок" означает белок, который нековалентно связывается с биотином или его аналогом или производным. Высокие уровни выхода означают, что данный белок может быть экспрессирован в растворимой форме в Е. coli в количестве около 10 мг/л, 11 мг/л, 12 мг/л, 13 мг/л, 14 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, 25 мг/л, 30 мг/л, 35 мг/л, 30 мг/л, 35 мг/л, 40 мг/л, 45 мг/л, 50 мг/л или более.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок может представлять собой рекомбинантный белок. Кодирующая последовательность для биотин-связывающего белка может быть оптимизирована с помощью кодонов экспрессии Е. coli чтобы избежать какого-либо затруднения при экспрессии в Е. coli, связанного с редкими кодонами, присутствующими в исходном гене.

В целом, биотин-связывающий белок включает биотин-связывающий домен. В соответствии с использованным здесь значением, "биотин-связывающий домен" означает последовательность полипептида, которая связывается с биотином. Хотя весь биотин-связывающий белок может быть использован в качестве биотин-связывающего домена, может быть использована и только биотин-связывающая часть данного белка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий домен получен из Ризавидина.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий домен состоит или по существу состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 45-179 Ризавидина дикого типа. Аминокислотная последовательность Ризавидина дикого типа представляет собой: MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALAFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:4).

Другими словами, биотин-связывающий домен не включает (то есть в нем отсутствуют) аминокислоты 1-44 (MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALA, SEQ ID NO:5) Ризавидина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий домен включает аминокислотную последовательность FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:1).

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий домен включает аминокислотную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и, более предпочтительно, по меньшей мере, на 99,3% относительно SEQ ID NO:1.

В то время как Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405) описывают удаление только первых 24 остатков полноразмерного Ризавидина, изобретатели обнаружили, что первые 44 остатков полноразмерного Ризавидина не являются необходимыми для базовой структуры и функционирования Ризавидина. Также, неожиданно было обнаружено, что аминокислоты 25-44 (MIRTNAVAALVFAVATSALA, SEQ ID NO:6) полноразмерного Ризавидина снижают растворимость и секрецию экспрессируемого в Е. coli Ризавидина, поскольку замена первых 44 остатков в полноразмерном Ризавидине на сигнальный пептид Е. coli вело к увеличению растворимости и секреции описанных здесь биотиновых белков в Е. coli.

В описанном здесь биотин-связывающем белке биотин-связывающий домен может быть удлинен на N- или С-конце одной или несколькими аминокислотами с условием, что N-конец биотин-связывающего домена не включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности 1-44 Ризавидина дикого типа. Изобретатели обнаружили, что усечение первых 44 аминокислот на N-конце Ризавидина дикого типа может серьезно увеличить экспрессию биотин-связывающего белка в растворимой форме в Е. coli. Таким образом, описанный здесь биотин-связывающий белок может включать последовательность X¹-X²-X³, где X² представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотам 45-179 Ризавидина дикого типа, а X¹ и X³ или независимо отсутствуют или независимо представляют собой пептид от 1 до коло 100 аминокислот с условием, что N-конец X¹ не включает аминокислотную последовательность, соответствующую N-концу аминокислот 1-44 Ризавидина дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающие белки могут включать сигнальный пептид, конъюгированный с N-концом биотин-связывающего белка, то есть X¹ может включать сигнальный пептид. Данный сигнальный пептид также называют лидерным пептидом на N-конце, который может или не может быть отщеплен после транслокации через мембрану. Секреторные/сигнальные пептиды описаны более подробно ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO:2), MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA (SEQ ID NO:7), MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID NO:3) или их производное или функциональную часть.

Сигнальный пептид может быть связан с N-концом биотин-связывающего домена либо напрямую (например, связью) или не напрямую (например, линкером). В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальный пептид может быть связан с N-концом биотин-связывающего домена пептидным линкером. Последовательность пептидного линкера может иметь любую длину. Например, последовательность пептидного линкера может быть длиной в одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер имеет длину четыре аминокислоты.

Последовательность пептидного линкера может включать любую аминокислотную последовательность. Например, пептидный линкер может включать аминокислотную последовательность, которая может быть расщеплена сигнальной пептидазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер включает аминокислотную последовательность AQDP (SEQ ID NO:8) или VSDP (SEQ ID NO:9). Биотин-связывающий домен в биотин-связывающем белке может быть конъюгирован на своем С-конце с пептидом из 1-100 аминокислот. Данные пептиды на С-конце могут применяться в качестве меток очистки, линкеров других доменов и им подобных.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок включает на своем N- или С-конце одну или несколько (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более) меток очистки. Примеры меток очистки включают (без ограничения) гистидиновую метку, с-ту метку. Halo метку. Flag метку и им подобные. В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок включает на его С-конце гистидиновую метку, например (His)₆ (SEQ ID NO.10).

Метка очистки может быть конъюгирована с биотин-связывающим белком пептидным линкером для увеличения вероятности того, что метка будет находиться снаружи. Длина линкера может составлять, по меньшей мере, одну (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать) аминокислот. Линкерный пептид может включать любую аминокислотную последовательность без ограничений. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкерный пептид включает аминокислотную последовательность VDKLAAALE (SEQ ID NO:11) или GGGGSSSVDKLAAALE (SEQ ID NO:12).

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок включает на своем С-конце аминокислотную последовательность VDKLAAALEHHHHH (SEQ ID NO:13) или GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:14).

В некоторых вариантах осуществления изобретения биотин-связывающий белок включает аминокислотную последовательность: MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:15).

По сравнению с известными биотин-связывающими белками, которые образуют тетрамеры, описанный здесь биотин-связывающий белок образует димер. Без связи с какой-либо теорией, считается, что образование димера может дополнительно улучшать экспрессию описанного здесь биотин-связывающего белка в виде растворимого белка в Е. coli.

Несмотря на то, что биотин-связывающие белки известны из уровня техники, описанный здесь биотин-связывающий белок включает значительные различия по сравнению с авидином и авидин-подобными белками, известными из уровня техники в настоящее время. Во-первых, известные в настоящее время авидины крайне тяжело экспрессировать в виде растворимых белков в Е. coli. Тем не менее, как показано в данном изобретении, описанный здесь биотин-связывающий белок может быть экспрессирован в виде растворимого белка в Е. coli с высоким выходом.

Описанные здесь биотин-связывающие белки могут быть получены в растворимой форме с высокими уровнями выхода, например, более 30 мг на литр культуры, путем экспрессии в Е. coli. Таким образом, описанные здесь биотин-связывающие белки являются более растворимыми, чем белки, описанные в уровне техники, и также обладают другими отличиями. Без связи с какой-либо теорией, считается, что различная растворимость может быть связана с лежащими в основе физическими и/или химическими и/или структурными различиями между описанными здесь биотин-связывающими белками и другими биотин-связывающими белками, известными из уровня техники.

Второе, описанный здесь биотин-связывающий белок включает биотин-связывающий домен, который состоит из аминокислот 45-179 Ризавидина дикого типа. В то время как Ризавидин дикого типа и его частично усеченная часть известны из уровня техники, в уровне техники не существует теории или предложения, связанного с тем, что биотин-связывающий белок, включающий аминокислотную последовательность из аминокислот 45-179 Ризавидина дикого типа и сигнальную последовательность Е. coli ведет к образованию растворимого белка, который может быть получен из Е. coli с высоким выходом. Согласно Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405), аминокислоты 25-44 Ризавидина дикого типа включают предполагаемую сигнальную последовательность. Тем не менее, как описано здесь, изобретатели обнаружили и продемонстрировали, что замена предполагаемой сигнальной последовательности на сигнальную последовательность Е. coli ведет к увеличению экспрессии биотин-связывающего белка в растворимой форме в Е. coli.

Третье, описанный биотин-связывающий белок включает пептид аминокислотной последовательности GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:14). Данный пептид на С-конце обеспечивает гистидиновую метку для очистки и место для инсерции других доменов, например антигенных доменов, в биотиновый белок. Также, в то время как Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405) описывают экспрессию Ризавидина в Е. coli, у Helppolainen et al. не существует теории или предложения о конъюгировании дополнительного пептида на С-конец биотин-связывающего домена Ризавидина.

Четвертое, Ризавидин обладает более низкой гомологией последовательности относительно яичного авидина (22,4% идентичность последовательности и 35,0% аналогичность) по сравнению с другими авидин-подобными белками. Таким образом, описанный здесь биотин-связывающий белок представляет собой иной авидин и другие авидин-подобные белки.

Пятое, описанный здесь биотин-связывающий белок обладает более низкой изоэлектрической точкой (р1) по сравнению с авидином и другими авидин-подобными молекулами. Изоэлектрическая точка Ризавидина дикого типа составляет 4,0 (Helppolainen et al., Biochem J., 2007, 405: 397-405). Изоэлектрическая точка других известных биотин-связывающих белков в целом составляет более 6,1 (см. Helppolainen et al., Biochem J., 2007, 405: 397-405). С другой стороны, р1 описанного здесь биотин-связывающего белка составляет 5,4. Находящаяся в области кислых значений р1 описанного здесь биотин-связывающего белка ведет к снижению неспецифичного связывания. Связанной с применением известного в настоящее время авидина и авидин-подобных пептидов проблемой является их неспецифичное связывание. Известный в настоящее время авидин и авидин-подобные пептиды могут неспецифично связываться не только с клетками, но также с ДНК, белками и биологическими материалами, такими как мембраны. Например, при детектировании материала с применением связывания авидин-биотин, авидин неспецифично связывается с иными материалами, не являющимися подвергающимися детектированию материалами для увеличения фона. Одна из причин высокого уровня неспецифичного связывания авидина включает высокое значение его изоэлектрической точки. Авидин представляет собой высокоосновный белок с крайне высоким значением изоэлектрической точки, составляющим 10 или более, и являющийся в целом положительно заряженным. Соответственно, считается, что авидин легко связывается с биологическими материалами, во многих случаях являющимися отрицательно заряженными. Таким образом, низкое значение pI описанного здесь биотин-связывающего белка представляет собой преимущество по сравнению с известными в настоящее время авидином и авидин-подобными пептидами.

Шестое, размер описанного здесь биотин-связывающего белка относительно мал по сравнению с известными в настоящее время авидином и авидин-подобными белками. Этот биотин-связывающий белок менее 28 кДа (размер димера). Тем не менее, большая часть из известного в настоящее время авидина и авидин-подобных белков имеют размеры, соответствующие более 60 кДа (размер тетрамера). Считается, что Ризавидин дикого типа имеет размер около 29 кДа (размер димера). Малые размеры биотин-связывающего белка могут использоваться для увеличения степени конъюгирования между целевыми молекулами. Например, биотин-связывающий белок может применяться для конъюгирования первой целевой молекулы со второй целевой молекулой. Одна из данных молекул может быть связана с одним или несколькими молекулами биотина или биотин-подобными молекулами, а вторая молекула может быть связана, конъюгирована или слита с биотин-связывающим белком. С учетом небольших размеров описанного здесь биотин-белка, молекулы биотина или биотин-подобные молекулы могут быть расположены более близко друг к другу, что позволяет осуществлять более релятивное связывание в случае, если вторая молекула имеет большие размеры по сравнению с известным в настоящее время авидином или авидин-подобными молекулами.

Седьмое, описанный здесь биотин-связывающий белок представляет собой димер. Образование димера может дополнительно улучшать экспрессию описанного здесь биотин-связывающего белка в виде растворимого белка в Е. coli. Кроме того, в связи с тем, что биотин-связывающий белок образует димер, а не тетрамер, подобно всем другим известным авидин-подобным белкам 1) снижается сложность структуры слитых антигенов; 2) сложность экспрессии слитых белков рекомбинантного биотин-связывающего белка аналогично снижается; 3) стерический барьер, связанный с манипуляциями со слитыми биотин-связывающими белкам, минимизируется, что представляет собой преимущество в свете других манипуляций, например с (без ограничения) биотином, миметиками биотина или производными биотина; и 4) растворимость слитых биотин-связывающих белков значительно повышается. Таким образом, показаны основополагающие различия между описанными здесь биотин-связывающими белками и белками, известными из уровня техники.

Восьмое, описанный здесь биотин-связывающий белок снижает риск индуцирования содержащей его иммуногенной композицией аллергической реакции у субъекта в отношении яиц. Более того, антитело к описанному здесь биотин-связывающему домену не обладает заметной перекрестной реактивностью относительно яичного авидина (и наоборот).

Также, описанный здесь биотин-связывающий белок может обладать улучшенными качествами, такими как снижение степени неспецифичного связывания или дополнительное увеличение степени связывания биотина, в то же время сохраняя характеристики Ризавидина дикого типа. Применение описанного здесь биотин-связывающего белка для детектирования, например, в рамках иммунологического анализа или анализа гибридизации нуклеиновой кислоты, для измерения аналита с помощью связывания авидин-биотин может снижать фон, повышать чувствительность и поддерживать связывание с биотином при жестких условиях.

Данное исследование ясно показывает преимущества и различия описанных здесь биотин-связывающих белков по сравнению с авидином и другими авидин-подобными белками. Таким образом, описанные здесь биотин-связывающие белки обладают потенциалом в качестве мощного и универсального средства в рамках широкого спектра вариантов применения с использованием авидин-биотиновой технологии.

Биотин-связывающий белок может применяться в любой методологии, композиции или системе, требующей применения авидин-биотиновой системы, без каких-либо ограничений. Как хорошо известно специалисту в данной области, авидин-биотиновая система может применяться в широко используемых лабораторных процедурах, таких как биоконъюгирование; детектирование молекул-мишеней; выделение, очистка или обогащение из образца молекул-мишеней; детектирование белка; детектирование нуклеиновой кислоты; выделение, очистка или обогащение белка; выделение, очистка или обогащение нуклеиновой кислоты; ELISA; проточная цитометрия и им подобных.

Соответственно, примерные варианты применения описанных здесь рекомбинантных биотин-связывающих белков включают (без ограничения) биоконъюгирование; детектирование молекул-мишеней; выделение, очистку или обогащение из образца молекул-мишеней; детектирование белка; детектирование нуклеиновой кислоты; выделение, очистку или обогащение белка; выделение, очистку или обогащение нуклеиновой кислоты; ELISA; проточную цитометрию и им подобные.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанный здесь биотин-связывающий белок может применяться в качестве части аффинной пары в системе множественной презентации антигена (MAPS) как описано в предварительной патентной заявке США 61/484934, поданной 11 мая 2011; 61/608168, поданной 8 марта 2012; и 61/609,974, поданной 13 марта 2012 и РСТ заявке PCT/US12/37412, поданной 11 мая 2012, содержание каждой из которых приведено здесь во всей полноте для ссылки. MAPS также описана более подробно ниже. Без связи с какой-либо теорией, считается, что применение описанного здесь биотин-связывающего белка снижает риск индуцирования MAPS системой аллергической реакции, связанной с яйцами, у субъекта. Более того, антитело к рекомбинантному модифицированному Ризавидину не обладает заметной перекрестной реактивностью относительно яичного авидина (и наоборот).

Липидированный биотин-связывающий белок

В другом аспекте здесь предусмотрен липидированный биотин-связывающий белок. В соответствии с использованным здесь значением термин "липидированный биотин-связывающий белок" означает биотин-связывающий белок, который ковалентно конъюгирован с липидом. Липидными частями могут являться диацильный или триацильный липид.

Липидированный биотин-связывающий белок может быть получен с помощью липидационной последовательности. В соответствии с использованным здесь значением, термин "липидационная последовательность" означает аминокислотную последовательность, которая способствует липидированию несущего липидационную последовательность полипептида в бактериях, например в Е. coli. Липидационная последовательность может присутствовать на N-конце или С-конце белка. Липидационная последовательность может быть связана с рекомбинантным биотин-связывающим белком для образования слитого белка, находящегося в липидированной форме при экспрессии в Е. coli, осуществляемой в рамках стандартной рекомбинантной технологии. В некоторых вариантах осуществления изобретения липидационная последовательность расположена на N-конце биотин-связывающего белка.

Может применяться любая известная специалисту липидационная последовательность. В некоторых вариантах осуществления изобретения липидационная последовательность представляет собой MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID NO:3) или ее производное или функциональную часть. Другие примерные липидационные последовательности включают (без ограничения) MNSKKLCCICVLFSLLAGCAS (SEQ ID NO:16), MRYSKLTMLIPCALLLSAC (SEQ ID NO:17), MFVTSKKMTAAVLAITLAMSLSAC (SEQ ID NO:18), MIKRVLVVSMVGLSLVGC (SEQ ID NO:19) и их производные или функциональные части.

В некоторых вариантах осуществления изобретения липидационная последовательность может быть слита с биотин-связывающим белком через пептидный линкер, при этом пептидный линкер присоединяет липидационную последовательность к биотин-связывающему белку.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидный линкер включает аминокислотную последовательность VSDP (SEQ ID NO:9).

В одном варианте осуществления изобретения биотин-связывающий липидный белок включает аминокислотную последовательность MKKVAAFVALSLLMAGCVSDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO:20).

Липидированные биотин-связывающие белки представляют собой лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR). Как таковые, описанные здесь липидированные биотин-связывающие белки могут применяться в качестве TLR лигандов. Например, липидированный биотин-связывающий белок может применяться в композициях для индуцирования TLR2 стимулирования. Это может быть полезно для индуцирования иммуногенности к другим антигенам/патогенам. Таким образом, биотин-связывающие липопротеины могут применяться в иммуногенных композициях в качестве костимулирующего фактора или адъюванта антигена.

В соответствии с использованным здесь значением термин "Toll-подобный рецептор" предназначен для обозначения в целом любого Toll-подобного рецептора организма любого вида. TLR может представлять собой рецептор любого вида млекопитающих. TLR были обнаружены у различных видов млекопитающих, включая (без ограничения), например, людей, гвинейских свиней и мышей. Специфичные TLR могут быть определены благодаря дополнительной ссылке на вид по происхождению (например, человек, грызуны и так далее), конкретный рецептор (например, TLR2, TLR3, TLR9 и так далее) или по им обоим. В некоторых вариантах осуществления изобретения липидированный биотин-связывающий белок представляет собой лиганд TLR2.

Toll-подобные рецепторы (TLR) представляют собой семейство трансмембранных белков линий зародышевых клеток, обеспечивающих распознавание патогенов и активацию врожденной иммунной системы. Toll-подобные рецепторы (TLR) представляют собой рецепторы опознавания паттерна (PRR) и экспрессируются клетками врожденной иммунной системы, включая макрофаги, дендритные клетки и NK-клетки. Примеры известных лигандов TLR включают грамположительные бактерии (TLR-2), бактериальный эндотоксин (TLR-4), белок флагеллин (TLR-5), бактериальную ДНК (TLR-9), двухспиральную РНК и поли I:C (TLR-3) и дрожжи (TLR-2). Другие лиганды, которые связывают эндоцитозный рецептор опознавания паттерна, фагоцитарный рецептор или связывающий маннозу рецептор также могут рассматриваться в рамках данного изобретения. TLR захватывают патогенные лиганды и далее активируют путь сигнальной трансдукции TLR/IL-1R для индуцирования различных эффекторных генов. Toll-подобные рецепторы (TLR) представляют собой важную группу PRR, которые могут распознавать молекулярные паттерны, связанные с патогенами или микробами. Они широко экспрессируются в крови, селезенке, легких, мышцах и кишечнике многими типами клеток, в частности дендритными клетками (DC), но также макрофагами, эпителиальными клетками и лимфоцитами.

Несмотря на то, что некоторые расположенные на клеточной поверхности TLR являются специфичными к микробным липидам и белкам, другие связанные с эндосомными компартментами внутри клеток являются специфичными к нуклеиновым кислотам. Лигирование TLR специфичными им лигандами приводит к конформационным изменениям в рецепторах, ведущим к входящей трансдукции, в основном затрагивающей MyD88- и TRIF-зависимые пути. За исключением TLR3, все другие TLR могут передавать сигналы через путь MyD88 для индуцирования воспалительного цитокинеза, включающего активацию внутриклеточных протеинкиназовых каскадов, включая IB киназу (IKK)-NF-B и внеклеточную сигнальную регулируемую протеинкиназу (ERK), c-Jun N-терминальную киназу (JNK) и митоген-активируемые протеинкиназы р38 (МАРК). Путь TRIF независимо от MyD88 используется TLR3 и TLR4 и опосредует индуцирование интерферонов I типа.

Описанные здесь рекомбинантные биотин-связывающие липопротеины обладают повышенной иммуногенностью. Без связи с какой-либо теорией, считается, что липидные части на N-концах липопротеинов или липопептидов вносят вклад в адъювантную активность. Соответственно, дополнительные варианты осуществления изобретения предусматривают иммуногенные композиции или композиции вакцин для индуцирования иммунологического ответа, включающие выделенный биотин-связывающий липопротеин или подходящий вектор для его экспрессии in vivo или оба из них, а также подходящий носитель и способы индуцирования иммунологического или протективного ответа, включающие введение субъекту выделенного рекомбинантного биотин-связывающего липопротеина, экспрессирующего рекомбинантный биотин-связывающий липопротеин вектора или композицию, содержащую рекомбинантный липопротеин или вектор в количестве, достаточном для индуцирования ответа.

Иммунологическая или иммуногенная композиция, включающая биотин-связывающий липопротеин, индуцирует иммунологический ответ - местный или системный. Данный ответ может необязательно являться протективным. Следует отметить, что в соответствии с использованным здесь значением термины "иммунологическая композиция" и "иммуногенная композиция" включают "композицию вакцины" (поскольку оба вышеуказанных термина могут означать протективные композиции). Без ограничений, описанный здесь липидированный биотин-связывающий белок может применяться в качестве антигена, адъюванта или костимулятора в иммунологической, иммуногенной или вакцинной композиции. Также, поскольку липидированный биотин-связывающий белок включает биотин-связывающий домен, липидированный белок может быть включен в полимерную основу MAPS. Соответственно, здесь также предусмотрены способы индуцирования иммунологического ответа в хозяине-млекопитающем. Данный способ включает введение субъекту иммуногенной, иммунологической или вакцинной композиции, включающей описанный здесь липидированный биотин-связанный белок и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения липидированный биотин-связывающий белок представляет собой слитый белок, включающий липидированный биотин-связывающий белок и белок или пептид.

Негемолитический Hla

Гемолизины представляют собой экзотоксины, продуцируемые бактериями, которые вызывают лизис красных кровяных клеток. Несмотря на высокую иммуногенность