Аптамер против ngf и его применение

Аптамер против ngf и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к аптамеру NGF и его применению.

Предшествующий уровень техники

Фактор роста нервов (NGF) является первым нейротрофином, идентифицированным в 1951 году, и он является важным секреторным белком, участвующим в развитии и выживании периферических и центральных нейронов. Он состоит из 118 аминокислот, имеет молекулярную массу 13 кДа и S-S-связи в 3 положениях молекулы.

В качестве рецепторов NGF известны рецептор тирозинкиназного типа TrkA с высокой аффинностью и p75 с низкой аффинностью, принадлежащий к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли. Эти рецепторы действуют как гомодимер или гетеродимер и интенсивно участвуют в развитии и поддержании нервной системы. TrkA является однопроходным трансмембранным рецептором и имеет тирозинкиназную структуру во внутриклеточном домене. При связывании с NGF происходит фосфорилирование тирозина, сигнал передается дальше и происходит стимуляция дифференцировки и поддержание выживания клетки.

В семействе рецепторов TrkA известны TrkB и TrkC. TrkB связывается с BDNF и NT-4/5, а TrkC связывается с NT-3. По сравнению с TrkA p75 демонстрирует более низкую специфичность к лиганду и, помимо NGF, также связывается с BDNF, NT-3 и NT-4/5. Хотя p75 является однопроходным трансмембранным рецептором, он не имеет тирозинкиназного домена в цитоплазматической части. Подобно TrkA, он экспрессируется не только в нейронах, но также и не в нервных клетках. Известно, что этот рецептор участвует в стимуляции дифференцировки и поддержании выживания клетки, а также связан с индукцией апоптоза и миграции клеток. Результаты кристаллографического анализа указывают на то, что гомодимер NGF связывается с TrkA в соотношении 2:2 и с p75 в соотношении 2:1. Иногда гомодимер NGF связывается с гетеродимером TrkA и p75.

Хорошо известно, что NGF играет ключевую роль в нервной системе. Было выяснено, что NGF действует, поддерживая выживаемость холинергических нейронов, и считают, что он каким-то образом связан с болезнью Альцгеймера. Кроме того, т.к. интрацеребральное введение NGF снижает нарушения памяти у старых крыс, также ожидают, что он будет терапевтическим средством против сенильной деменции.

NGF также связан с воспалением, повышенную экспрессию NGF наблюдают у пациентов с воспалительными заболеваниями и в воспалительных моделях на животных. Их примерами являются системная красная волчанка, рассеянный склероз, псориаз, артрит, интерстициальный цистит, астма и т.п. Сообщают, что в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом обнаруживали более высокую концентрацию NGF. Кроме того, сообщают о повышенной экспрессии NGF у крыс в модели ревматоидного артрита, его повышении в тучных клетках и повышенной экспрессии NGF в модели артрита мыши.

NGF интенсивно участвует в болевой реакции. При подкожном введении NGF человеку сильная боль, такая как мышечная боль, продолжается в течение нескольких дней, и в месте инъекции происходит гипералгезия. У мышей, нокаутных по NGF, и мышей, нокаутных по TrkA, отсутствуют немиелинизированные нервы, и они не чувствуют боли. При интраперитонеальном введении NGF зрелой крысе в дозе 1 мг/кг в ответ на температурный и механический стимулы развивается гипералгезия. Трансгенная по NGF мышь демонстрирует гипералгезию, сопровождающуюся воспалительными состояниями. Кроме того, известно, что у пациентов с врожденным отсутствием чувствительности к боли с ангидрозом (CIPA) ген TrkA является аномальным, и при аномальности гена NGF чувствительность к боли снижается.

Учитывая вышесказанное, следует понимать, что ингибитор NGF можно использовать в качестве терапевтического средства от боли, такой как ноцицептивная боль, воспалительная боль, нейропатическая боль, карциноматозная боль, боль при фибромиалгии и т.п.

В последние годы привлекает внимание применение аптамеров РНК в качестве лекарственных средств, диагностических средств и тестовых лекарственных средств; некоторые аптамеры РНК уже находятся на стадии клинических испытаний, или их применяют на практике. В декабре 2004 года первое в мире лекарственное средство на основе аптамера РНК, макуген, одобрено для применения в качестве терапевтического лекарственного средства против возрастной дегенерации желтого пятна в США. Аптамер РНК относится к РНК, специфически связывающейся с веществом-мишенью, таким как белок, и его можно получать с использованием способа SELEX (систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением) (патентные ссылки 1-3). В SELEX РНК, специфически связывающуюся с веществом-мишенью, выбирают из совокупности РНК из приблизительно 10¹⁴ различных нуклеотидных последовательностей. Используемая структура РНК имеет случайную последовательность из приблизительно 40 остатков, фланкированную последовательностями праймеров. Этой совокупности РНК позволяют связываться с веществом-мишенью и собирают только РНК, связывающуюся с веществом-мишенью, с использованием фильтра и т.п. Собранную РНК амплифицируют с помощью RT-ПЦР и используют в качестве матрицы для следующего раунда. Повторяя это действие приблизительно 10 раз, можно получать аптамер РНК, специфически связывающийся с веществом-мишенью.

Лекарственные средства на основе аптамеров, подобно лекарственным средствам на основе антител, могут быть направлены на внеклеточные факторы. Учитывая многочисленные научные статьи и другие справочные материалы в публичном доступе, лекарственные средства на основе аптамеров считают потенциально превосходящими лекарственные средства на основе антител в некоторых аспектах. Например, аптамеры часто демонстрируют большую силу связывания и большую специфичность, чем антитела. Иммунный клиренс аптамеров маловероятен, и при использовании аптамеров не развиваются побочные реакции, характерные для антител, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC). Что касается доставки, т.к. аптамеры составляют приблизительно 1/10 размера антител, доставка лекарственного средства в желаемое место является более легкой. Т.к. аптамеры получают химическим синтезом, легче осуществлять различные модификации, и возможно снижение затрат при массовом производстве. При этом время полужизни аптамеров в кровотоке, как правило, меньше, чем у антител; однако иногда это свойство является преимуществом с точки зрения токсичности. Эти факты приводят к выводу, что даже при направленности против одной и той же молекулы лекарственные средства на основе аптамеров потенциально превосходят лекарственные средства на основе антител.

Авторы настоящего изобретения получали аптамер, связывающийся с NGF и ингибирующий связывание NGF с рецептором NGF, и обнаруживали, что аптамер ингибирует активность NGF в отношении роста нейритов (патентный документ 4). В патентном документе 5 описывают аптамер против NGF, получаемый с помощью автоматизированной SELEX, а в патентном документе 6 описывают измененный продукт и модифицированный продукт аптамера, получаемого в патентном документе 4.

Перечень документов

Патентные документы

Патентный документ 1: WO 91/19813.

Патентный документ 2: WO 94/08050.

Патентный документ 3: WO 95/07364.

Патентный документ 4: WO 2010/035725.

Патентный документ 5: WO 02/077262.

Патентный документ 6: WO 03/070984.

Сущность изобретения

Задачи, подлежащие решению посредством изобретения

Цели настоящего изобретения относятся к аптамеру против NGF, способу его применения и т.п. В частности, цель настоящего изобретения относится к аптамеру против NGF, пригодному для использования в качестве фармацевтического препарата, а именно, аптамеру, имеющему короткую цепь, активность, ингибирующую высокую активность NGF (активность в отношении роста нейритов, активность в отношении пролиферации клеток TF-1), и высокую специфичность к NGF.

Средства решения задач

Авторы настоящего изобретения проводили интенсивные исследования, пытаясь решить указанные выше задачи, и добивались успеха в получении аптамера против NGF более высокого качества, демонстрирующего значение IC₅₀ 1 нМ или ниже в отношении ингибирования роста нейритов, и исключительно высокую ингибиторную активность в отношении роста нейритов по сравнению с общеизвестными аптамерами против NGF, что привело к осуществлению настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующему.

[1] Аптамеру, связывающемуся с NGF и способному образовывать предполагаемую вторичную структуру, представленную формулой (I):

где N является одним нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G, C, U и T,

N11-N13, N21-N23, N32-N38 и N42-N48 являются одинаковыми или разными, и каждый из них является связью или 1 или 2 нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из A, G, C, U и T,

N14, N24, N31, N41, N39 и N49 являются одинаковыми или разными, и каждый из них является одним нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G, C, U и T,

каждые из N14 и N24, N31 и N41, и N39 и N49 образуют уотсон-криковскую пару оснований,

N11-N12-N13-N14 и N21-N22-N23-N24 являются нуклеотидными последовательностями, в комбинации способными образовывать структуру стебля, и

N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39 и N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49 являются нуклеотидными последовательностями, в комбинации способными образовывать структуру стебля.

[2] Аптамер по предшествующему п.[1], где N11-N13, N21-N23, N32-N38 и N42-N48 являются одинаковыми или разными, и каждый из них является одним нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G, C, U и T.

[3] Аптамер по предшествующему п.[1] или [2], где N14 является U, N24 является A, N31 является G, N41 является C, N39 является G, и N49 является C.

[4] Аптамер по любому из предшествующих пп.[1]-[3], где между N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38 и N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48 образуется не менее чем 4 уотсон-криковских пар оснований.

[5] Аптамер по предшествующему п.[1], являющийся (a) или (b):

(a) нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9-13, SEQ ID NO: 22-117 и SEQ ID NO: 152-168 (где урацил может являться тимином);

(b) нуклеиновой кислотой, связывающейся с NGF и состоящей из нуклеотидной последовательности по предшествующему п. (a), где от 1 до нескольких нуклеотидов подвергают замене, делеции, инсерции или добавлению.

[6] Аптамер по любому из предшествующих пп. [1]-[5], имеющий длину не более 50 оснований.

[7] Аптамер по любому из предшествующих пп. [1]-[6], где по меньшей мере один нуклеотид модифицируют.

[8] Аптамер по предшествующему п. [7], модифицированный с использованием инвертированного dT или полиэтиленгликоля.

[9] Аптамер по предшествующему п. [8], где инвертированный dT или полиэтиленгликоль присоединяют к 5'-концу или 3'-концу аптамера.

[10] Аптамер по любому из предшествующих пп. [7]-[9], где гидроксильные группы в 2’-положении рибозы соответствующих пиримидиновых нуклеотидов являются одинаковыми или разными, и их не замещают или замещают атомом или группой, выбранной из группы, состоящей из атома водорода, атома фтора и метоксигруппы.

[11] Аптамер по любому из предшествующих пп. [7]-[9], где гидроксильные группы в 2’-положении рибозы соответствующих пуриновых нуклеотидов являются одинаковыми или разными, и их не замещают или замещают атомом или группой, выбранной из группы, состоящей из атома водорода, атома фтора и метоксигруппы.

[12] Аптамер по любому из предшествующих пп. [1]-[11], ингибирующий активность NGF в отношении роста нейритов и/или пролиферации клеток.

[13] Фармацевтическая композиция, содержащая аптамер по любому из предшествующих пп. [1]-[12].

[14] Средство против боли, содержащее аптамер по любому из предшествующих пп. [1]-[12].

[15] Противовоспалительное средство, содержащее аптамер по любому из предшествующих пп. [1]-[12].

[16] Способ лечения или профилактики заболевания, сопровождающегося болью или воспалением, включающий введение аптамера по любому из предшествующих пп. [1]-[12] нуждающемуся в этом индивидууму.

[17] Аптамер по любому из предшествующих пп. [1]-[12] для профилактики или лечения заболевания, сопровождающегося болью или воспалением.

Эффект изобретения

Т.к. аптамер или нуклеиновая кислота по настоящему изобретению демонстрируют лучшую ингибирующую NGF активность, в частности, высокую ингибиторную активность в отношении роста нейритов, благодаря указанному выше строению он может являться применимым в качестве лекарственного средства против заболеваний, таких как алгия, воспалительное заболевание и т.п.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 является схематическим представлением прогнозируемой вторичной структуры аптамера против NGF, приведенного в ID NO: 3, где структура "стебель-петля" сверху слева соответствует консенсусной вторичной структуре 1.

Фиг. 2 является схематическим представлением консенсусной вторичной структуры 1, представленной нуклеотидной последовательностью аптамера против NGF, приведенной в SEQ ID NO: 12.

Фиг.3 является сенсограммой, на которой показано, что аптамер против NGF, приведенный в SEQ ID NO: 82(2) (модифицированная форма), связывается с NGF, NT-3 и NT-4, где RU по вертикальной оси представляет собой относительную единицу, Resp. Diff. представляет собой различия ответов, и по горизонтальной оси отложено время (секунды) (Время (сек)). Эти обозначения по вертикальной оси и по горизонтальной оси являются одинаковыми для следующих фиг. 4-5.

Фиг. 4 является сенсограммой, на которой показано, что аптамер против NGF, приведенный в SEQ ID NO: 82(2) (модифицированная форма), ингибирует связывание NGF и рецептора NGF TrkA.

Фиг. 5 является сенсограммой, на которой показано, что аптамер NGF, приведенный в SEQ ID NO: 82(2) (модифицированная форма), ингибирует связывание NGF и рецептора NGF p75.

Описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение относится к аптамеру, связывающемуся с NGF и способному образовывать предполагаемую вторичную структуру, представленную формулой (I):

где N является одним нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G, C, U и T,

N11-N13, N21-N23, N32-N38 и N42-N48 являются одинаковыми или разными, и каждый из них является связью или 1 или 2 нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из A, G, C, U и T,

N14, N24, N31, N41, N39 и N49 являются одинаковыми или разными, и каждый из них является одним нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G, C, U и T,

каждые из N14 и N24, N31 и N41, и N39 и N49 образуют уотсон-криковскую пару оснований,

N11-N12-N13-N14 и N21-N22-N23-N24 являются нуклеотидными последовательностями, в комбинации способными образовывать структуру стебля, и

N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39 и N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49 являются нуклеотидными последовательностями, в комбинации способными образовывать структуру стебля (далее в настоящем описании описываемому как "аптамер по настоящему изобретению"). Указанную выше нуклеотидную последовательность, необязательно, модифицируют, как указано ниже.

Аптамер относится к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей связывающей активностью в отношении конкретной молекулы-мишени. Аптамер может ингибировать активность конкретной молекулы-мишени посредством связывания с конкретной молекулой-мишенью. Аптамер по настоящему изобретению является аптамером, обладающим связывающей активностью по отношению к NGF. По предпочтительному варианту осуществления аптамер по настоящему изобретению может ингибировать активность NGF посредством связывания с NGF и ингибирования связывания NGF и рецептора NGF.

Аптамер по настоящему изобретению может являться нуклеиновой кислотой, такой как РНК, ДНК, модифицированная нуклеиновая кислота или их смесь. Таким образом, аптамер по настоящему изобретению в дальнейшем можно обозначать как "нуклеиновая кислота по настоящему изобретению".

Одноцепочечная нуклеиновая кислота может иметь различные вторичные структуры. Термин "предполагаемая вторичная структура" означает вторичную структуру, которую конкретная одноцепочечная нуклеиновая кислота термодинамически может принимать с учетом ее первичной структуры. В частности, предполагаемая вторичная структура аптамера по настоящему изобретению является вторичной структурой, прогнозируемой с использованием программы MFOLD, описываемой в примере 5. Таким образом, даже нуклеиновую кислоту, в настоящий момент не имеющую вторичную структуру, представленную указанной выше формулой (I), включают в аптамер по настоящему изобретению, при условии, что она имеет первичную структуру, способную образовывать указанную вторичную структуру.

Таким образом, предпочтительно, аптамер по настоящему изобретению является молекулой нуклеиновой кислоты, способной иметь вторичную структуру, представленную указанной выше формулой (I), термодинамически стабильную с учетом ее первичной структуры. В этом смысле аптамер по настоящему изобретению является аптамером, способным образовывать предполагаемую вторичную структуру, представленную формулой (I).

Предполагаемая вторичная структура, представленная формулой (I), является тем, что называют "структурой "стебель-петля", в частности, являющейся структурой, имеющей структуру петли (обозначаемую в настоящем описании как "внутренняя петля 1") между структурой стебля, которую может образовывать комбинация N11-N12-N13-N14 и N21-N22-N23-N24, и структурой стебля, которую может образовывать комбинация N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39 и N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49, и, кроме того, структуру петли между N39 и N49 (обозначаемую в настоящем описании как "петля 2").

"Структура стебля" является структурой, где частичные нуклеотидные последовательности, имеющие комплементарность в молекуле нуклеиновой кислоты, образуют уотсон-криковские пары оснований (G-C или A-U/T). В настоящем описании для N11-N12-N13-N14 и N21-N22-N23-N24, и N31-N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38-N39 и N41-N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48-N49 не требуется полной комплементарности, и допускают несовпадения и/или вобблинг G-U/T. Т.е. при условии, что нуклеотиды на обоих концах частичной нуклеотидной последовательности, образующие структуру стебля, образуют уотсон-криковские пары оснований, для всех других нуклеотидов не требуется образования уотсон-криковских пар оснований.

В формуле (I) "N", находящийся в участке петли 2, является одним нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G, C, U и T. В предпочтительном варианте осуществления "N" может являться G.

В формуле (I) N11-N13, N21-N23, N32-N38 и N42-N48 являются одинаковыми или разными, и каждый из них является связью или 1 или 2 нуклеотидами, выбранными из группы, состоящей из A, G, C, U и T. Если Ni (i является целым числом, выбранным из 11-13, 21-23, 32-38, 42-48) представляет "два нуклеотида", указанные два нуклеотида могут являться одинаковыми или различными. Если Ni представляет "два нуклеотида" или "связь", он, предпочтительно, содержится в каждой частичной последовательности N11-N13, N21-N23, N32-N38 и N42-N48 в количестве не более 2, более предпочтительно - не более 1. Таким образом, каждая из N11-N14 и N21-N24, образующая одну структуру стебля, предпочтительно, имеет длину 2-6 нуклеотидов, более предпочтительно - 3-5, и каждая из N31-N39 и N41-N49, образующая другую структуру стебля, предпочтительно, имеет длину, предпочтительно, 7-11 нуклеотидов, более предпочтительно - 8-10.

Указанная выше "связь" означает одинарную связь, и если любой Ni в формуле (I) является "связью", это означает, что нуклеотиды, смежные с нуклеотидом, соединены друг с другом посредством фосфодиэфирной связи.

В частности, предпочтительно, N11-N13, N21-N23, N32-N38 и N42-N48 являются одинаковыми или разными, и каждый из них является одним нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G, C, U и T. Таким образом, структура стебля, включая оба конца части, образующей вторичную структуру, имеет длину стебля предпочтительно не более 4 нуклеотидов, и внутренняя структура стебля, находящаяся между двумя петлями, имеет длину стебля предпочтительно 9 нуклеотидов.

В формуле (I) N14, N24, N31, N41, N39 и N49 являются одинаковыми или разными, и каждый из них является одним нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G, C, U и T, и каждый из N14 и N24, N31 и N41, и N39 и N49 образует уотсон-криковскую пару оснований (G-C или A-U/T). Таким образом, структура стебля, содержащая оба конца части, образующей вторичную структуру, образует пару оснований, по меньшей мере, на конце участка внутренней петли 1, и внутренняя структура стебля, находящаяся между двумя петлями, образует пары оснований на обоих его концах. Более предпочтительно, N14 является U, N24 является A, N31 является G, N41 является C, N39 является G, и N49 является C.

С другой стороны, как определено выше, для N11-N12-N13 и N21-N22-N23, и N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38 и N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48 в "структуре стебля" не требуется полной комплементарности (образование уотсон-криковских пар оснований всеми из них является необязательным). Однако необходима комплементарность на уровне, делающем возможным образование структуры стебля (петля (пузырь) в стебле не образуется). Т.к. петля может образовываться, когда в каждой структуре стебля содержатся 3 непрерывных несовпадения или вобблинга G-U/T, для специфичности каждая структура стебля, желательно, не содержит 3 непрерывных несовпадения или вобблинга G-U/T. Также желательно, чтобы не менее чем 50%, предпочтительно - не менее чем 60%, более предпочтительно - не менее чем 70% каждого из N11-N12-N13 и N21-N22-N23, и N32-N33-N34-N35-N36-N37-N38 и N42-N43-N44-N45-N46-N47-N48 являлись нуклеотидами, образующими уотсон-криковские пары оснований.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, состоящей из нуклеотидной последовательности по следующим пп. (a) или (b):

(a) нуклеотидная последовательность, выбранная из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9-13, SEQ ID NO: 22-117 и SEQ ID NO: 152-168 (где урацил может являться тимином);

(b) нуклеотидная последовательность по предшествующему п. (a) и связывающаяся с NGF, где от 1 до нескольких нуклеотидов подвергают замене, делеции, инсерции или добавлению.

Такие нуклеиновые кислоты могут образовывать предполагаемую вторичную структуру, представленную указанной выше формулой (I).

Т.к. любой урацил в любой последовательности можно заменять тимином, подлежащий замене урацил, предпочтительно, может являться урацилом в части, иной, чем участок внутренней петли 1 и участок петли 2 в указанной выше предполагаемой вторичной структуре, таким образом, что можно поддерживать активность аптамера по настоящему изобретению.

В настоящем описании последовательность, определяемая посредством "SEQ ID NO", означает нуклеотидную последовательность каждого аптамера или нуклеиновой кислоты, и, например, "нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1" означает природную нуклеиновую кислоту или модифицированную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или нуклеиновую кислоту, составленную из них обоих. Последовательность оснований SEQ ID NO каждого аптамера приводят в списке последовательностей.

В указанном выше (b) количество нуклеотидов, подвергнутых замене, делеции, инсерции или добавлению, составляет например, приблизительно 1-10, предпочтительно - 1-6, более предпочтительно 1-5, более предпочтительно - 1-3, наиболее предпочтительно - 1 или 2.

В указанном выше (b), хотя положение нуклеотида, подлежащего замене, делеции, инсерции или добавлению, в частности, не ограничено, предпочтительно, нуклеотид может находиться в части, иной, чем участок внутренней петли 1 и участок петли 2 в указанной выше предполагаемой вторичной структуре, таким образом, что можно поддерживать активность аптамера по настоящему изобретению.

Хотя длина аптамера или нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, в частности, не ограничена, она, как правило, составляет от 34 до приблизительно 200 нуклеотидов, предпочтительно - от 34 до приблизительно 100 нуклеотидов, более предпочтительно - 36-60 нуклеотидов, более предпочтительно - 38-44 нуклеотидов. Длина аптамера или нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, предпочтительно, составляет не более 50, более предпочтительно - не более 44. Химический синтез и массовое производство аптамера упрощаются при снижении общего количества нуклеотидов, попадающего в диапазон, делающий возможным образование предполагаемой вторичной структуры, представленной указанной выше формулой (I), а также существует основное преимущество в отношении затрат. Также считают, что такой аптамер делает возможной легкую химическую модификацию, высокую стабильность в организме и низкую токсичность.

Аптамер по настоящему изобретению также может являться конъюгатом, выбранным из группы, состоящей из конъюгата множества нуклеиновых кислот, состоящих из нуклеотидной последовательности по указанному выше п. (a), конъюгата множества нуклеиновых кислот, состоящих из нуклеотидной последовательности по указанному выше п. (b), и конъюгата множества нуклеиновых кислот, состоящих из нуклеотидной последовательности по указанному выше п. (a), и нуклеиновых кислот, состоящих из нуклеотидной последовательности по указанному выше п. (b).

Эти конъюгаты также могут связываться с NGF и/или ингибировать активность NGF (активность связывания рецептора NGF и т.д.).

В настоящем описании конъюгации можно достигать посредством тандемного связывания. В конъюгации можно использовать линкер. В качестве линкера можно упомянуть нуклеотидные цепи (например, от 1 до приблизительно 20 нуклеотидов) и ненуклеотидные цепи (например, линкер -(CH₂)_n-, линкер -(CH₂CH₂O)_n-, гексаэтиленгликолевый линкер, линкер TEG, пептид-содержащий линкер, линкер, содержащий связь -S-S-, линкер, содержащий связь -CONH-, линкер, содержащий связь -OPO₃-). Множество, как указано для описываемого выше конъюгата множества, в частности, не ограничено при условии, что оно составляет два или более, и множество может составлять, например, 2, 3 или 4.

Каждый нуклеотид, содержащийся в аптамере по настоящему изобретению, является одинаковым или разным и может являться нуклеотидом, содержащим гидроксильную группу в 2’-положении рибозы (например, рибозы пиримидинового нуклеотида, рибозы пуринового нуклеотида) (т.е. незамещенным нуклеотидом), или нуклеотидом, где гидроксильную группу замещают любым атомом или группой в 2ʹ-положении рибозы. В качестве примеров любого такого атома или группы можно упомянуть нуклеотид, замещенный атомом водорода, атомом фтора или -O-алкильной группой (например, группой -O-Me), -O-ацильной группой (например, группой -O-CHO) или аминогруппой (например, группой -NH₂). В следующих случаях гидроксильную группу замещают атомом водорода, атомом фтора или группой -O-Me, соответственно, в 2’-положении рибозы.

Аптамер по настоящему изобретению также может являться нуклеотидом, где, по меньшей мере, один тип (например, 1, 2, 3 или 4 типа) нуклеотидов содержит гидроксильную группу или описываемый выше любой атом или группу, например, по меньшей мере, два типа (например, 2, 3 или 4 типа) групп, выбранных из группы, состоящей из атома водорода, атома фтора, гидроксильной группы и группы -O-Me, в 2ʹ-положении рибозы.

Кроме того, в аптамере по настоящему изобретению все пиримидиновые нуклеотиды являются одинаковыми или разными, и каждый из них может являться нуклеотидом, замещенным атомом фтора, или нуклеотидом, замещенным любым указанным выше атомом или группой, предпочтительно, атомом или группой, выбранной из группы, состоящей из атома водорода, гидроксильной группы и метоксигруппы в 2ʹ-положении рибозы.

Кроме того, в аптамерах по настоящему изобретению все пуриновые нуклеотиды являются одинаковыми или разными, и каждый из них может являться нуклеотидом, замещенным гидроксильной группой, или нуклеотидом, замещенным любым указанным выше атомом или группой, предпочтительно, атомом или группой, выбранной из группы, состоящей из атома водорода, метоксигруппы и атома фтора в 2’-положении рибозы.

Кроме того, в аптамерах по настоящему изобретению все нуклеотиды могут содержать гидроксильную группу или любой указанный выше атом или группу, например, идентичную группу, выбранную из группы, состоящей из атома водорода, атома фтора, гидроксильной группы и группы -O-Me в 2ʹ-положении рибозы.

В настоящем описании при описании модификации групп сахаров в нуклеотиды нуклеотиды, из которых состоит аптамер, считают РНК (т.е. группы сахаров считают рибозой). Однако это не означает, что ДНК исключают из нуклеотидов, из которых состоит аптамер, и при необходимости модификацию РНК необходимо рассматривать как модификацию ДНК. Если нуклеотид, из которого состоит аптамер, является ДНК, например, замену гидроксильной группы в 2ʹ-положении рибозы на X необходимо рассматривать как замену одного атома водорода в 2’-положении дезоксирибозы на X.

Если в аптамере по настоящему изобретению урацил замещают тимином, можно повышать активность связывания NGF, активность ингибирования связывания NGF и рецептора NGF, ингибирования активности NGF в отношении роста нейритов, ингибирования активности NGF в отношении пролиферации клеток, стабильность, доставляемость лекарственного средства и стабильность аптамера в крови и т.п.

Аптамер по настоящему изобретению связывается с NGF, являющимся известным нейротрофином и важным секреторным белком, участвующим в развитии и выживании периферических и центральных нейронов. В частности, в настоящем изобретении NGF означает β-тип NGF. Аминокислотные последовательности β-NGF человека являются теми, которые представлены под регистрационными номерами NP002497, P01138, AAI26151, AAI26149 и CAB75625, которые также могут содержать мутацию, его функциональным доменом или пептидным фрагментом. Он может являться не только мономером, но также и димером или мультимером. Кроме того, он включает NGF, получаемым не являющихся человеком млекопитающих, например, приматов (например, обезьян), грызунов (например, мыши, крысы, морской свинки) и животных-компаньонов, домашних животных и рабочих животных (например, собаки, кошки, лошади, коровы, козы, овцы, свиньи).

Аптамер по настоящему изобретению ингибирует активность NGF посредством связывания с NGF и ингибирования связывания NGF и рецептора NGF. Аптамер по настоящему изобретению может связываться с любой частью NGF при условии, что можно ингибировать связывание NGF и рецептора NGF.

В настоящем описании "ингибиторная активность в отношении NGF" означает способность к ингибированию любой активности NGF. Например, это означает активность в отношении ингибирования связывания NGF с рецептором NGF, ингибирования передачи сигнала ниже рецептора NGF (через путь киназ Ras-MAP, путь киназы PI3), ингибирования повышения экспрессии TRPV1, SP, BDNF и т.п., активность ингибирования экспрессии HA, BK, PG, NGF и других цитокинов, высвобождаемых из тучных клеток и т.п., что является результатом связывания NGF с рецептором NGF, кроме того, можно отметить ингибирование дифференцировки, выживания, роста нейритов нейрона, индуцируемого NGF, повышения проницаемости кровеносных сосудов, повышения иммунного ответа T-клеток и B-клеток, дифференцировки лимфоцитов, роста и т.п. различных клеток, таких как тучные клетки, эритролейкозные клетки, злокачественные клетки и т.п., снижение боли, гипералгезии и т.п., индуцируемых NGF.

Предпочтительная "ингибиторная активность в отношении NGF", которой обладает аптамер по настоящему изобретению, является активность ингибирования связывания NGF с рецептором NGF, активность ингибирования роста нейритов, индуцируемого NGF, активность ингибирования пролиферации клеток, индуцируемой NGF и т.п.

Аптамер по настоящему изобретению связывается с NGF в физиологическом буфере (например, растворе A: см. пример 1). Аптамер по настоящему изобретению связывается, например, с NGF с интенсивностью, определяемой с помощью следующего теста.

Для измерения используют BIAcore2000, производимый BIAcore. Аптамер иммобилизуют на сенсорном чипе. Количество, подлежащее иммобилизации, устанавливают на 1000 RU. Для получения раствора NGF (0,5 мкМ) используют физиологический буфер, содержащий 0,3M NaCl (раствор A: см. пример 1). Этот раствор NGF (20 мкл) инъецируют и определяют связывание NGF с аптамером. Используя РНК, содержащую случайный нуклеотид, состоящий из 40 нуклеотидов, в качестве отрицательного контроля, когда NGF связывается с аптамером, значимо сильнее по сравнению с контрольной РНК, оценивают способность аптамера к связыванию с NGF.

В настоящем описании термин "рецептор NGF" означает белок поверхности клетки, с которой связывается NGF. TrkA и p75 известны как рецепторы NGF. Рецептор NGF, указанный в настоящем изобретении, может являться белком, содержащим природную аминокислотную последовательность или ее вариант. В настоящем описании термин "ее вариант" означает белок или пептид, где несколько аминокислот в аминокислотной последовательности "рецептора NGF" замещены, или его частичную аминокислотную последовательность, имеющую активность связывания с NGF и ингибирующую связывание NGF и рецептора NGF.

Аптамер по настоящему изобретению связывается с NGF и ингибирует связывание NGF и рецептора NGF. Ингибирует ли аптамер связывание NGF с рецептором NGF или нет, например, можно оценивать с помощью следующего теста.

Для измерения используют BIAcore2000, производимый BIAcore. На сенсорном чипе CM5 иммобилизуют слитный белок рецептора NGF и Fc (например, TrkA-Fc (175-TK, R&D systems) или p75-Fc (R&D systems)). Количество, подлежащее иммобилизации, составляет от 500 до 700 RU. NGF (0,1 мкМ) и аптамера (0,2 мкМ) смешивают в физиологическом буфере (раствор A: см. пример 1), и в течение 30 мин получают смесь, являющуюся образцом. Эту смесь инъецируют в BIAcore2000 и определяют связывание NGF с рецептором NGF.

В одном из вариантов осуществления аптамер по настоящему изобретению может ингибировать и связывание NGF и TrkA, и связывания NGF и p75.

Аптамер по настоящему изобретению является аптамером, ингибирующим активность NGF в отношении роста нейритов и/или активность NGF в отношении пролиферации клеток. Может ли аптамер по настоящему изобретению ингибировать активность NGF в отношении роста нейритов или нет, можно оценивать, например, с помощью теста, описываемого в примере 3. Кроме того, может ли аптамер по настоящему изобретению ингибировать активность NGF в отношении пролиферации клеток или нет, можно оценивать, например, с помощью теста, описываемого в примере 8.

Аптамер по настоящему изобретению характеризуют по концентрации, необходимой для ингибирования активности NGF в отношении роста нейритов на 50% (IC₅₀ или 50%-ная ингибиторная концентрация), составляющей не более 1 нМ. Т.к. общеизвестный аптамер против NGF имеет значение IC₅₀ приблизительно несколько нМ в случае активности NGF в отношении роста нейритов, аптамер по настоящему изобретению демонстрирует лучшее свойство в отношении активности ингибирования роста нейритов.

В предпочтительном варианте осуществления аптамер по настоящему изобретению также демонстрирует значение IC₅₀ не более 1 нМ в случае активности NGF в отношении пролиферации клеток.

С другой стороны, имеет ли аптамер по настоящему изобретению активность ингибирования активности нейротрофина, иного, чем NGF, в частности, нейротрофического фактора мозга (BDNF), нейротрофина-3 (NT-3) и нейротрофина 4/5 (NT-4/5), в отношении пролиферации клеток, варьируется в зависимости от аптамера. В настоящем описании термины BDNF, NT-3 и NT-4/5, соответственно, означают BDNF, NT-3 и NT-4/5 всех видов млекопитающих, включая человека.

Уровень ингибиторной активности других нейротрофинов (BDNF, NT-3, NT-4/5) в отношении пролиферации клеток можно оценивать с помощью теста, описываемого в примере 16. Ингибиторная активность аптамера по настоящему изобретению в отношении пролиферации клеток, как описано в примере 16 и таблице 2, представлена значением IC₅₀ не более 0,1 нМ в случае NGF и не менее 1000 нМ в случае BDNF, что означает, что аптамер по настоящему изобретению не ингибирует активность BDNF в отношении пролиферации клеток. Однако она составляет от 0,97 нМ до не менее 10 нМ в случае NT-3; и от не более 3 нМ до не менее 30 нМ в случае NT-4. Таким образом, ингибирование активности NT-3 и NT-4 в отношении пролиферации клеток варьируется в зависимости от аптамера.

Аптамер по настоящему изобретению может являться аптамером, где остаток сахара (например, рибозы) в каждом нуклеотиде модифицируют для повышения активности связывания с NGF, активности ингибирования связывания NGF и рецептора NGF, ингибирования активности NGF в отношении роста нейритов, ингибирования активности NGF в отношении пролиферации клеток, стабильности, доставляемости лекарственного средства и стабильности апт