Способ трансдермальной доставки биологически активных веществ

Способ трансдермальной доставки биологически активных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине и нацелено на доставку биологически активных веществ (БАВ) через придатки кожи (волосяные фолликулы и воронки, протоки сальной и потовой желез) при помощи субмикронных и/или микроразмерных пористых частиц карбоната кальция. Данные частицы принадлежат к ватеритной форме карбоната кальция и выступают в роли матриц-носителей, предназначенных для инкапсуляции БАВ и применяемых в виде порошка для приготовления суспензий для аппликации на поверхность кожи.

Известен способ трансфолликулярной доставки субмикронных частиц, поглощающих энергию (в частности световую), путем их нанесения на поверхность кожи с последующим воздействием (механическим, ультразвуковым и т.д.) для усиления их внедрения в волосяные фолликулы (заявка № WO2013158278, МПК A61K47/30; A61K47/38; A61K9/14; A61K9/16). Данный метод предполагает использование субмикронных (в том числе наноразмерных) частиц из материала, поглощающего и трансформирующего энергию различной природы (энергию света, звука и т.д.) в тепловую или энергию химических реакций, способного таким образом оказывать терапевтический эффект. В качестве таких материалов, например, предлагаются фотоактивные химические соединения, фотодинамические красители и пролекарства, плазмоннорезонансные структуры «ядро-оболочка» на основе частиц диоксида кремния, покрытого золотой оболочкой, которые также могут быть дополнены покрытием из полиэтиленгликоля или сурфактанта. Терапевтический эффект достигается при активации таких частиц после внедрения в волосяные фолликулы или сальную железу. Изобретение нацелено на лечение заболеваний соответствующей локализации (акне, гиперплазии сальной железы, расширенные поры и избыток кожного сала и т.д.), а также на удаление волос.

Недостатком указанного способа является отсутствие раскрытия специфики трансфолликулярного внедрения в зависимости от типа внедряемых частиц: режимы внедряющих воздействий (механического втирания, акустических вибраций, ультразвука, давления) приведены в общем случае и не учитывают трудности проникновения, связанные с геометрическими и физическими особенностями частиц, а также ограничения, обусловленные чувствительностью применяемых частиц к внедряющему воздействию (например, разрушение или трансформацию под действием указанных доз энергетического воздействия). Оптимизация технических параметров внедрения и подбор химической композиции частиц являются отдельными задачами, требующими рассмотрения.

Кроме того, указанный способ фокусируется на применение частиц, выполняющих активную роль в последующем лечении (активизируемых внешним воздействием после доставки с целью обеспечения терапевтического воздействия) и не рассматривает возможность использования матриц-носителей (контейнеров для лекарственного вещества), применение которых способно расширить спектр доставляемых в фолликулы лекарственных соединений, а также добиться синергетических эффектов путем инкапсуляции нескольких различных веществ. Такие матрицы-носители могут быть выполнены из биоразлагаемого или рН-чувствительного материала и выполнять роль депо-систем, обеспечивающих управляемое высвобождение инкапсулированных препаратов в объеме волосяных фолликулов, сальной и потовой желез после внедрения.

Также известен способ электрофоретической доставки БАВ в волосяные фолликулы после их инкапсуляции в липосомы (заявка № WO2008053983, МПК A61K47/18; A61K47/24; A61K47/28; A61K9/127; A61N1/30). Согласно данному способу, в качестве контейнера-носителя терапевтического препарата используются липосомы размером 400-1000 нм с различным составом липидной мембраны, внедрение данной композиции в волосяные фолликулы обеспечивают посредством электрофореза при значениях прикладываемого тока от 0.1 до 0.6 мA/cм².

Недостатком данного способа является длительность процедуры внедрения при электрофоретическом воздействии. Как показано в примерах, эффективное заполнение фолликулов контейнерами достигается в течение 1 часа. Однако даже при такой длительности воздействия не обеспечивается in vivo доставка частиц на всю глубину фолликула (более глубокое заполнение демонстрируется при внедрении контейнеров in vitro). Кроме того, данный способ не рассматривает пути высвобождения инкапсулированного препарата в объеме волосяных фолликулов, сальной и потовой желез после внедрения.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ трансфолликулярной доставки к дендритным клеткам кожи особой лекарственной формы-иммуномодулятора при ее инкапсуляции с помощью микро- и/или наночастиц (заявка № WO2012146364, МПК A61K39/39; A61K49/14). Изобретение основано на применении контейнеров с иммобилизованным препаратом путем их нанесения на поверхность кожи с последующей транспортировкой в волосяные фолликулы, в физиологических условиях которых происходит постепенное высвобождение препарата из носителя и его доставка к клеткам-мишеням. Предлагаемая для иммобилизации лекарственная форма содержит антигенные детерминанты цитотоксических T-лимфоцитов (Т-киллеров) и Т-хэлперов и синтетические аналоги бактериальных липопептидов, и, таким образом, индуцирует специфический Т-клеточный иммунный ответ при взаимодействии с дендритными клетками, обеспечивая терапевтический эффект.

К недостаткам указанного способа можно отнести отсутствие конкретного инженерного решения для контейнера-носителя, метода его активного внедрения в волосяные фолликулы, а также способа управления высвобождением инкапсулированной лекарственной формы. Данный метод принят за прототип.

Задачей заявляемого изобретения является разработка неинвазивного способа доставки биологически активных веществ in vivo через придатки кожи: волосяные фолликулы и воронки, протоки сальной и потовой желез.

Технический результат изобретения заключается в увеличении эффективности заполнения волосяных фолликулов (увеличение числа внедренных частиц и глубины заполнения) частицами, содержащими БАВ, при ускорении процедуры внедрения и обеспечении возможности управления длительностью высвобождения БАВ из них.

Указанный технический результат достигается тем, что способ трансдермальной доставки биологически активных веществ включает аппликацию контейнеров с иммобилизованным биологически активным веществом на поверхность кожи с последующей транспортировкой через придатки кожи, согласно решению в качестве контейнеров используют пористые частицы карбоната кальция размером менее 1.5 мкм, а транспортировку осуществляют путем воздействия ультразвуком интенсивностью 0,1-1 Вт/см2 длительностью 1-4 мин. В наилучшем варианте выполнения заявляемого способа для аппликации используют спиртовую суспензию частиц размером 0.7±0.1 мкм концентрацией 0.25 мг/мл, а воздействие ультразвуком осуществляют с частотой 1 МГц интенсивностью 0.4-0.5 Вт/см2 в течение 2 минут. Согласно заявляемому способу для ускорения высвобождения биологически активного вещества из частиц карбоната кальция возможно осуществление дополнительного пост-воздействия на область аппликации при помощи ультразвука частотой 1 МГц и интенсивностью 1 Вт/см2 по крайней мере однократно в течение до 10 минут.

Изобретение поясняется таблицами и чертежами, описание которых приведено ниже.

Таблица 1 содержит данные о режимах внедрения контейнеров в волосяные фолликулы спинной зоны лабораторной крысы in vivo, обобщая данные приведенные в примерах 1-12.

Таблица 1. Режимы внедрения контейнеров в волосяные фолликулы спинной зоны лабораторной крысы in vivo (примеры 1-12)

- размер частиц (диаметр), представленный как «средний диаметр ± стандартное отклонение среднего»;

- длительность внедряющего ультразвукового воздействия;

- интенсивность ультразвука;

- ультразвуковая энергия, приходящаяся на 1 см² (энергия потока ультразвука, проходящего через площадь в 1 см²), рассчитанная по формуле , где S=1 см².

Обозначения в графе «Результат»:

«+ +» - оптимальные режимы внедрения, обеспечивающие обильное заполнение на глубину фолликула частицами без разрушения последних в процессе внедрения;

«+» - режимы внедрения, обеспечивающие заполнение на глубину фолликула частицами, однако менее обильное, чем при оптимуме.

«+/-» - режимы, при которых достигается внедрение частиц в фолликулы, но которые, однако, не являются оптимальными;

«-» - режимы, при которых не достигается внедрение частиц в волосяные фолликулы, или режимы, при которых можно фолликулы заполняются частицами, но их применение недопустимо.

В Таблице 2 сведены результаты мониторинга состояния внедренных частиц внутри волосяных фолликулов в течение времени и влияния ультразвукового пост-воздействия на него.

Таблица 2. Состояние внедренных частиц внутри волосяных фолликулов в течение времени и влияние ультразвукового пост-воздействия на него

	1 день	3 день	5 день	8 день	10 день	12 день
без пост-воздействия(пример 13)	+ +ватерит,отдельные частицы	+растворение/перекристаллизация,крупные агрегаты	+/-растворение агрегатов	-
ультразвук1 Вт/см24 минуты(пример 14)	+ватерит, утопление в стенку	+растворение/перекристаллизация, крупные агрегаты	+/-растворение агрегатов	-
ультразвук1 Вт/см29 минут(пример 14)	+ватерит, глубокое утопление в стенку, растворение	+растворение/перекристаллизация	+/-растворение агрегатов	-

Обозначения в графе «Результат»:

«+» - обильное заполнение фолликула частицами, большое содержание;

«+/-» - менее 50% внедренных частиц остается в луковице;

«-» - полная резорбция частиц в волосяной луковице

Фиг. 1. СЭМ-изображения частиц ватерита размером 0.7±0.1 мкм, снятые при различном увеличении

Фиг. 2. СЭМ-изображения частиц ватерита размером 1.0±0.1 мкм, снятые при различном увеличении

Фиг. 3. СЭМ-изображение частиц ватерита размером 4-5 мкм

Фиг. 4. ОКТ-изображение волосяных фолликулов лабораторной крысы из спинной зоны in vivo до внедрения частиц

Фиг. 5. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после втирания субмикронных частиц ватерита in vivo (массаж области нанесения при отсутствии УЗ-воздействия)

Фиг. 6. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.1 Вт/см² в течение 2 минут (доза ультразвуковой энергии 12 Дж)

Фиг. 7. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.4 Вт/см² в течение 2 минут (доза воздействия 48 Дж)

Фиг. 8. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.5 Вт/см² в течение 2 минут (доза воздействия 60 Дж)

Фиг. 9. СЭМ-изображения луковицы волоса, выдернутого из контрольной зоны без внедрения частиц ватерита: а - неразрушенные луковицы; б, в - разрушенные пинцетом луковицы

Фиг. 10. СЭМ-изображения луковицы волоса, выдернутого после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита (размером 0.7±0.1 мкм): а - неразрушенные луковицы; б, в - разрушенные пинцетом луковицы: обильное заполнение частицами ватерита, частицы сохраняют форму.

Фиг. 11. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo при помощи ультразвука интенсивности 1 Вт/см² в течение 2 минут (доза воздействия 120 Дж)

Фиг. 12. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.5 Вт/см² в течение 1 минуты (доза воздействия 30 Дж)

Фиг. 13. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.5 Вт/см² в течение 3 минут (доза воздействия 90 Дж)

Фиг. 14. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.5 Вт/см² в течение 4 минут (доза воздействия 120 Дж)

Фиг. 15. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo при помощи ультразвука интенсивности 1 Вт/см² в течение 1 минуты (доза воздействия 60 Дж)

Фиг. 16. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения микроразмерных частиц ватерита (1.0±0.1 мкм) in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.5 Вт/см² в течение 1 минуты

Фиг. 17. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения микроразмерных частиц ватерита (1.0±0.1 мкм) in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.5 Вт/см² в течение 2 минут

Фиг. 18. СЭМ-изображения разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых после УЗ-внедрения микроразмерных частиц ватерита (1.0±0.1 мкм): обильное заполнение частицами

Фиг. 19. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после внедрения микрочастиц ватерита (4.5±0.5 мкм) in vivo при помощи ультразвука интенсивности 0.5 Вт/см² в течение 2 минут

Фиг. 20. СЭМ-изображения разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых после УЗ-внедрения микрочастиц ватерита (4.5±0.5 мкм): обильное заполнение частицами

Фиг. 21. СЭМ-изображения разрушенной пинцетом луковицы волоса, выдернутого на 3-й день после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита: а - общий план: формирование агрегатов, начало процесса перекристаллизации, б - внутренняя стенка луковицы: утопление частиц в стенку луковицы.

Фиг. 22. СЭМ-изображения разрушенной пинцетом луковицы волоса, выдернутого на 5-й день после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита: а - внутренняя стенка луковицы: процесс перекристаллизации внедренных частиц, б - стенка луковицы: глубокое утопление частиц в стенку.

Фиг. 23. СЭМ-изображения разрушенной пинцетом луковицы волоса, выдернутого на 8-й день после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита: заращивание агрегатов частиц в стенку волосяной луковицы в результате активных процессов деления ее тканей

Фиг. 24. СЭМ-изображения разрушенной пинцетом луковицы волоса, выдернутого на 10-й день после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита: а, б - внутренняя стенка луковицы: заращивание частиц в стенку волосяной луковицы и растворение частиц

Фиг. 25. СЭМ-изображение разрушенной пинцетом луковицы волоса, выдернутого на 12-й день после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита: резорбция внедренных субмикронных частиц в волосяной луковице.

Фиг. 26. Данные EDX-исследования химического состава внутреннего содержимого волосяных луковиц, выдернутых сразу после УЗ-внедрения частиц в фолликулы

Фиг. 27. Данные EDX-исследования химического состава внутреннего содержимого волосяных луковиц, выдернутых на 3-й день после УЗ-внедрения субмикронных частиц в фолликулы

Фиг. 28. Данные EDX-исследования химического состава внутреннего содержимого волосяных луковиц, выдернутых на 8-й день после УЗ-внедрения субмикронных частиц в фолликулы

Фиг. 29. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo, дополненного УЗ пост-воздействием в течение 4 минут

Фиг. 30. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo, дополненного УЗ пост-воздействием в течение 5 минут

Фиг. 31. ОКТ-изображение волосяных фолликулов после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита in vivo, дополненного УЗ пост-воздействием в течение 9 минут

Фиг. 32. СЭМ-изображение разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 4 минут

Фиг. 33. СЭМ-изображение разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 5 минут

Фиг. 34. СЭМ-изображение разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 9 минут

Фиг. 35. СЭМ-изображения разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых через 3 дня после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 4 минут: а - заращиванием частиц в стенку волосяной луковицы в результате активных процессов деления его тканей, б - процесс растворения и перекристаллизации внедренных частиц

Фиг. 36. СЭМ-изображение разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых через 8 дней после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 4 минут

Фиг. 37. СЭМ-изображение разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых через 10 дней после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 4 минут

Фиг. 38. СЭМ-изображения разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых через 3 дня после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 9 минут: а - заращиванием частиц в стенку волосяной луковицы в результате активных процессов деления его тканей, б - процесс растворения и перекристаллизации внедренных частиц

Фиг. 39. СЭМ-изображения разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых через 5 дней после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 9 минут

Фиг. 40. СЭМ-изображения разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых через 8 дней после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита и УЗ пост-воздействия в течение 9 минут

Фиг. 41. ОКТ-изображение in vivo волосяных фолликулов внешней стороны предплечья добровольца до внедрения частиц

Фиг. 42. СЭМ-изображение субмикронных частиц ватерита, нагруженных препаратом «Аммифурин»

Фиг. 43. Флуоресцентное изображение субмикронных частиц ватерита, нагруженных препаратом «Аммифурин»

Фиг. 44. ОКТ-изображение волосяных фолликулов из зоны внешней стороны предплечья добровольца in vivo после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита, нагруженных препаратом «Аммифурин»

Фиг. 45. СЭМ-изображения разрушенных пинцетом луковиц волос, выдернутых после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита, нагруженных препаратом «Аммифурин»: обильное заполнение частицами

Фиг. 46. Флуоресцентные изображения разрушенной пинцетом луковицы волоса, выдернутого после УЗ-внедрения субмикронных частиц ватерита, нагруженных препаратом «Аммифурин», снятые при разных положениях фокальной плоскости методом сканирующей лазерной конфокальной микроскопии (срезы Z₁ и Z₂): а, г - светлопольные изображения; б, д - флуоресцентные изображения; в, е - наложение светлопольного и флуоресцентного каналов. Стрелки указывают на россыпь контейнеров.

Фиг. 47. Флуоресцентное изображение порушенной пинцетом луковицы контрольного волоса без внедрения частиц

Позициями на фигурах обозначены:

1 - незаполненные волосяные фолликулы;

2 - частицы в волосяных воронках;

3 - заполнение волосяных фолликулов частицами карбоната кальция;

4 - глубокое и обильное заполнение волосяных фолликулов частицами;

5 - внутренняя стенка волосяной луковицы;

6 - прореживание частиц в волосяных фолликулах;

7 - вбивание частиц в стенку волосяного фолликула (белая полоска по контуру фолликула);

8 - карбонизация стенки мешочка.

Раскрытие изобретения

Предложенный способ доставки БАВ включает в себя применение матриц-носителей из биодеградируемого материала - карбоната кальция в виде пористых частиц (в кристаллографической модификации ватерита) размером менее 1.5 мкм, высокопористая архитектура которых обеспечивает возможность иммобилизации до 20% w/w активного вещества - в виде аппликации на поверхность кожи с последующим воздействием при помощи терапевтического низкоинтенсивного (не более 1 Вт/см²) ультразвука как фактора, усиливающего эффективность внедрения в волосяные фолликулы и воронки, протоки сальной и потовой желез и/или ускоряющего разложение внедренного контейнера (в зависимости от режима УЗ-воздействия). Наиболее эффективное внедрение в волосяные фолликулы достигается при нанесении спиртовой суспензии субмикронных частиц ватерита размером 0.7±0.1 мкм концентрацией 0.25 мг/мл с последующим воздействием ультразвуком частотой 1 МГц интенсивностью 0.4-0.5 Вт/см² в течение 2 минут. Постепенная деградация контейнеров в течение 12 дней, вплоть до их полной резорбции, внутри волосяных мешочков обеспечивает пролонгированное высвобождение иммобилизованного в них лекарственного препарата, осуществляя таким образом адресную доставку БАВ в глубь фолликула и прилегающие области. Дополнение процедуры внедрения контейнеров ультразвуковым пост-воздействием частотой 1 МГц интенсивностью 1 Вт/см² позволяет ускорить процесс деградации носителя и высвобождения иммобилизованного БАВ, при этом управление высвобождением осуществляется путем варьирования длительности пост-воздействия.

Субмикронные и микрочастицы карбоната кальция (CaCO₃) являются перспективными контейнерами для иммобилизации биологически активных веществ (БАВ). В природе карбонат кальция может находиться в виде одной из трех полиморфных модификаций: ватерита, арагонита или кальцита [De Leeuw N.H. et al. J. Phys. Chem. B. 102, 16 (1998) 2914-2922]. Частицы ватерита обладают пористой структурой с диаметром пор от 20 до 60 нм и рядом таких достоинств, как биосовместимость, мягкие условия разрушения (растворение при рН≤5.5), простота приготовления и низкая себестоимость [Volodkin D.V. et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49 (2010) 9258-61]. Изменение параметров (температуры, скорости перемешивания реакционной смеси, концентрации исходных реагентов и др.) при синтезе таких частиц позволяет варьировать форму и размер получаемых микрообъектов [Svenskaya Y.I. et al. Adv. Powder Technol. 2,27 (2016) 618-624; Parakhonskiy B. et al. J. Nanobiotech. 13,1 (2015) 1-13]. Пористость частиц ватерита определяет эффективность включения лекарственных форм в их объем, а также обуславливает развитость поверхности, увеличивая ее адсорбционную емкость [Donatan S. et al. ACS App. Mat. Int. 8, 22 (2016) 14284-14292]. Путем изменения значения рН среды можно добиться растворения частиц карбоната кальция, что обеспечит высвобождение иммобилизованного в них препарата [Svenskaya Yu.I. et al. Biophys. Chem. 182 (2013) 11-15].

Субмикронные и микроразмерные частицы карбоната кальция были получены методом кристаллизации из раствора при непосредственном сливании солей хлорида кальция (CaCl₂) и карбоната натрия (Na₂CO₃).

Для синтеза микрочастиц ватерита размером 4.5±0.5 мкм применялась методика МС1 [Volodkin D.V. et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49 (2010) 9258-61], согласно которой 0.33 М водные растворы дигидрата хлорида кальция и карбоната натрия равных объемов одновременно приливались в пустой сосуд, смесь интенсивно перемешивалась на магнитной мешалке со скоростью 500 оборотов в минуту в течение 30 секунд. Далее суспензия образовавшихся частиц выдерживалась в покое при комнатной температуре в течение 1 минуты до полной кристаллизации карбоната кальция. Осадок CaCO₃ дважды промывался деионизованной водой и один раз 95% раствором этилового спирта, после чего высушивался при температуре 60°С в течение 30 минут.

Микроразмерные частицы ватерита (1.0±0.1 мкм) были получены по методике МС2 [Svenskaya Y.I. et al. Adv. Powder Technol. 2,27 (2016) 618-624], отличие которой от методики МС1 заключалось в том, что перемешивание реакционной смеси осуществлялось с помощью ультразвука частотой 20 кГц при мощности излучения 70 Вт (УЗ-гомогенизатор «Sonopuls», Bandelin, Германия).

Синтез субмикронных контейнеров (0.7±0.1 мкм) осуществлялся по методике МС3 [Parakhonskiy B.V. et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (2012) 1195-1197], согласно которой 1-М растворы дигидрата хлорида кальция и карбоната натрия одинаковых объемов смешивались с этиленгликолем, а затем между собой, содержание ЭГ в смеси составляло 83% от ее общего объема. Перемешивание реакционной смеси осуществлялось с помощью магнитной мешалки со скоростью 500 оборотов в минуту в течение 3 часов при комнатной температуре. Осадок (частицы карбоната кальция) трижды промывался 95% этиловым спиртом и высушивался при температуре 60°С в течение 30 минут.

Иммобилизации БАВ в частицы карбоната кальция осуществлялась методом его адсорбции из раствора. Для этого навеска сухих частиц ватерита диспергировалась в растворе иммобилизуемого БАВ и выдерживались в нем в течение 1 часа при непрерывном встряхивании с помощью шейкера, затем осадок CaCO₃ промывался этиловым спиртом и высушивался.

Другим методом иммобилизации БАВ в объем пористой ватеритной матрицы является его совместное осаждение с частицами CaCO₃ в процессе их формирования. Для этого 1-M водные растворы дигидрата хлорида кальция и карбоната натрия равных объемов одновременно приливаются к раствору БАВ в соотношении 1:4 (1 часть CaCl₂, 1 часть Na₂CO₃ и 4 части раствора БАВ). Далее смесь обрабатывается согласно одной из приведенных методик синтеза частиц (МС1-МС3).

При приготовлении суспензии для внедрения в волосяные фолликулы, навеска полученных контейнеров диспергировалась в медицинском антисептическом растворе до концентрации диапазона 0.1-1.0 мг/мл непосредственно перед аппликацией. Трансфолликулярная доставка контейнеров осуществлялась путем нанесения суспензии частиц на исследуемую поверхность кожи и последующего их внедрения в придатки кожи при помощи терапевтического ультразвука интенсивностью не более 1 Вт/см² в течение 1-4 минут. Высвобождение иммобилизованного в контейнеры БАВ в глубь фолликула и прилегающие области осуществлялось в процессе деградации внедренных частиц. Применение ультразвука частотой 1 МГц интенсивностью 1 Вт/см² как фактора, ускоряющего разложение внедренного в фолликулы контейнера, позволяло сократить процесс высвобождения иммобилизованного БАВ и обеспечивало управление этим процессом путем варьирования длительности пост-воздействия.

Примеры реализации способа

Влияние интенсивности ультразвука на заполнение волосяных фолликулов частицами при фиксированной длительности воздействия.

Пример 1.

Нанесение суспензии частиц карбоната кальция со средним диаметром 700 нм на поверхность кожи in vivo с последующим массированием области нанесения (в отсутствие УЗ-воздействия).

Исследование проводится in vivo на поверхности спины самца лабораторной крысы-альбиноса возрастом 1 год, весом 250 г. Перед проведением исследования крыса подвергается анестезии, и волосы в зоне спины выстригаются ножницами максимально коротко (до 1 мм длины волос). Проводится мониторинг состояния волосяных фолликулов с помощью установки для спектральной оптической когерентной томографии (ОКТ) OCP930SR (Thorlabs, USA). Результаты представлены на Фигуре 4. Навеска высушенных частиц массой 100 мг диспергируется в 100 мкл 70% этилового спирта. Изображение внедряемых частиц приведено на Фигуре 1.

После нанесения полученной суспензии на поверхность кожи спины лабораторной крысы осуществляется массаж в течение 2 минут на область нанесения. Затем избыток частиц смывается с поверхности кожи ватным тампоном, смоченным в воде. Далее осуществляется in vivo визуализация волосяных фолликулов данного участка кожи с помощью ОКТ. Результаты представлены на Фигуре 5.

Вывод: при использовании массажа как внедряющего воздействия наблюдается сосредоточение контейнеров на поверхности кожи и в верхней части волосяных воронок, не происходит обильного внедрения контейнеров в волосяные фолликулы. Данный режим признан неэффективным.

Пример 2.

Нанесение суспензии частиц карбоната кальция со средним диаметром 700 нм на поверхность кожи in vivo с последующим воздействием при помощи низкоинтенсивного терапевтического ультразвука (0.1 Вт/см², 2 минуты; доза ультразвуковой энергии 12 Дж) на область аппликации. Под дозой ультразвуковой энергии (воздействия) здесь и далее понимается энергия потока ультразвука, проходящего через площадь в 1 см²:

W_уз=I_уз*S*t_{воздействия}, где I_уз - интенсивность ультразвука, t_{воздействия} - длительность воздействия, S=1 см².

Исследование проводится in vivo на поверхности спины лабораторной крысы-альбиноса, как это описано в примере 1, с тем отличием, что после нанесения суспензии частиц на область нанесения осуществляется воздействие ультразвуком Dynatron 125 (Dynatronics, USA) частотой 1 МГц с диаметром ультразвукового зонда 2 см. Интенсивность УЗ-воздействия составляет 0.1 Вт/см², длительность - 2 минуты. Затем избыток частиц смывается с поверхности кожи ватным тампоном, смоченным в воде. Далее осуществляется in vivo визуализация волосяных фолликулов данного участка кожи с помощью ОКТ. Результаты представлены на Фигуре 6.

Вывод: аппликация частиц ватерита размером 0.7±0.1 мкм в сочетании с УЗ-воздействием интенсивностью 0.1 Вт/см² в течение 2 мин (доза ультразвуковой энергии 12 Дж) обеспечивает заполнение волосяных фолликулов, однако необильное и неоднородное: в верхней части фолликула плотнее. Данный режим позволяет внедрить частицы в волосяные фолликулы, однако не является оптимальным.

Пример 3.

Нанесение суспензии частиц карбоната кальция со средним диаметром 700 нм на поверхность кожи in vivo с последующим воздействием при помощи низкоинтенсивного терапевтического ультразвука (0.4 Вт/см², 2 минуты, доза воздействия 48 Дж) на область аппликации.

Исследование проводится in vivo на поверхности спины лабораторной крысы-альбиноса, как это описано в примере 2, с тем отличием, что интенсивность УЗ-воздействия, осуществляемого после нанесения суспензии частиц, составляет 0.4 Вт/см². Результаты in vivo визуализации волосяных фолликулов данного участка кожи с помощью ОКТ представлены на Фигуре 7.

Вывод: аппликация частиц ватерита размером 0.7±0.1 мкм в сочетании с УЗ-воздействием интенсивностью 0.4 Вт/см² в течение 2 мин (доза энергии 48 Дж) обеспечивает плотное однородное заполнение волосяных фолликулов. Данный режим является эффективным.

Пример 4.

Нанесение суспензии частиц карбоната кальция со средним диаметром 700 нм на поверхность кожи in vivo с последующим воздействием при помощи низкоинтенсивного терапевтического ультразвука (0.5 Вт/см², 2 минуты, доза воздействия 60 Дж) на область аппликации.

Исследование проводится in vivo на поверхности спины лабораторной крысы-альбиноса, как это описано в примере 2, с тем отличием, что интенсивность УЗ-воздействия, осуществляемого после нанесения суспензии частиц, составляет 0.5 Вт/см² на область нанесения. Результаты in vivo визуализации волосяных фолликулов данного участка кожи с помощью ОКТ представлены на Фигуре 8.

Для изучения распределения и состояния частиц в волосяном мешочке, осуществляется быстрая экстракция 10 волос вместе с луковицей при помощи пинцета из области исследования и из контрольной зоны, в которой не осуществлялось внедрение контейнеров. После этого ткань луковицы каждого выдернутого волоса разрушается при помощи лезвия, и материал исследуется методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на установке MIRA II LMU (Tescan). Результаты представлены на Фигурах 9 и 10.

Вывод: как показывают данные ОКТ, аппликация частиц ватерита размером 0.7±0.1 мкм в сочетании с УЗ-воздействием интенсивностью 0.5 Вт/см² в течение 2 мин (доза энергии 60 Дж) обеспечивает плотное однородное заполнение волосяных фолликулов. Отличительной особенностью данного режима является большая глубина заполнения фолликулов: частицы заполняют всю видимую для ОКТ область волосяного фолликула (более 600 нм вглубь). Данные СЭМ также свидетельствуют об обильном заполнении волосяных мешочков частицами карбоната кальция и об их налипании на внутреннюю стенку волосяной луковицы. Частицы обнаруживаются в большом количестве на всей глубине экстрагированной волосяной луковицы, что свидетельствует об их проникновении на всю глубину волосяного фолликула. При этом частицы ватерита сохраняют форму, что говорит об отсутствии разрушающего воздействия ультразвука на такую матрицу-носитель. Режим признан оптимальным.

Пример 5.

Нанесение суспензии частиц карбоната кальция со средним диаметром 700 нм на поверхность кожи in vivo с последующим воздействием при помощи низкоинтенсивного терапевтического ультразвука (1 Вт/см², 2 минуты, доза воздействия 120 Дж) на область аппликации.

Исследование проводится in vivo на поверхности спины лабораторной крысы-альбиноса, как это описано в примере 2, с тем отличием, что интенсивность УЗ-воздействия, осуществляемого после нанесения суспензии частиц, составляет 1 Вт/см² на область нанесения. Результаты in vivo визуализации волосяных фолликулов данного участка кожи с помощью ОКТ представлены на Фигуре 11.

Вывод: ультразвуковое воздействие интенсивностью 1 Вт/см² в течение 2 мин (доза энергии 120 Дж), дополняющее аппликацию частиц ватерита размером 0.7±0.1 мкм, является избыточным и приводит к разрушению частиц в фолликулах, и выражается более редким их заполнением. Оказывая разрушающее действие на матрицу-носитель, такой режим внедрения будет инициировать преждевременный выход инкапсулированного вещества из нее. Режим не является оптимальным.

Вывод по примерам 1-5:

Внедрение частиц ватерита размером 0.7±0.1 мкм в волосяные фолликулы in vivo обеспечивается при воздействии с помощью низкоинтенсивного терапевтического ультразвука во всем диапазоне интенсивности, однако оптимум заполнения достигается при 0.5 Вт/см² (доза энергии 60 Дж). Доза УЗ-воздействия до 12 Дж обеспечивает необильное заполнение фолликулов, доза ≥ 120 Дж является избыточной и приводит к разрушению внедряемых частиц. Результаты исследований, описанных в примерах 1-5 обобщены в разделе 1 таблицы 1, где оптимальные режимы внедрения, обеспечивающие обильное заполнение на глубину фолликула частицами без разрушения последних в процессе внедрения, обозначены как «+ +»; режимы, при которых не достигается внедрение частиц в волосяные фолликулы, обозначены как «-»; режимы, при которых достигается внедрение частиц в фолликулы, но которые однако не являются оптимальными, обозначены как «+/-».

Влияние длительности ультразвукового воздействия на заполнение волосяных фолликулов частицами при фиксированной интенсивности ультразвука

Пример 6.

Нанесение суспензии частиц карбоната кальция со средним диаметром 700 нм на поверхность кожи in vivo с последующим воздействием при помощи низкоинтенсивного терапевтического ультразвука (0.5 Вт/см², 1 минута, доза воздействия 30 Дж) на область аппликации.

Исследование проводится in vivo на поверхности спины самца лабораторной крысы-альбиноса возрастом 1 год, весом 230 г по схеме, приведенной в примере 4, с тем отличием, что воздействие ультразвуком интенсивностью 0.5 Вт/см² осуществляется в течение 1 минуты. Результаты in vivo визуализации волосяных фолликулов данного участка кожи с помощью ОКТ представлены на Фигуре 12.

Вывод: аппликация частиц ватерита размером 0.7±0.1 мкм в сочетании с УЗ-воздействием интенсивностью 0.5 Вт/см² в течение 1 минуты (доза энергии 30 Дж) обеспечивает заполнение волосяных фолликулов, однако неоднородное (в верхней части фолликула плотнее) и необильное, по сравнению с режимами, описанным в примерах 3 и 4.

Пример 7.

Нанесение суспензии частиц карбоната кальция со средним диаметром 700 нм на поверхность кожи in vivo с последующим воздействием при помощи низкоинтенсивного терапевтического ультразвука (0.5 Вт/см², 3 минуты, доза воздействия 90 Дж) на область аппликации.

Исследование проводится in vivo на поверхности спины самца лабо