Ферментативный путь для получения левулиновой кислоты, левулинатных сложных эфиров, валеролактона и их производных

Ферментативный путь для получения левулиновой кислоты, левулинатных сложных эфиров, валеролактона и их производных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИОРИТЕТ

[001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке США № 61/378199, поданной 30 августа 2010 года, которая включена в данный документ ссылкой.

ПРЕДПОСЫЛКИ

[002] Левулиновая кислота или 4-оксопентановая кислота представляет собой органическое соединение с формулой CH₃C(O)CH₂CH₂CO₂H. Это – кетокислота. Левулиновую кислоту, как правило, получают химически, например путем нагревания сахарозы с концентрированной соляной кислотой. Процесс протекает через промежуточное образование глюкозы, которая изомеризуется во фруктозу и затем гидроксиметилфурфурол.

Левулиновая кислота представляет собой потенциальный предшественник для нейлоноподобных полимеров, синтетических каучуков и пластмасс. Левулиновая кислота представляет собой универсальный синтетический промежуточный продукт, например, в синтезе фармацевтических препаратов, и является предшественником в промышленном производстве других химических продуктов, таких как метилтетрагидрофуран, валеролактон и этиллевулинат.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] В определенных аспектах и вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает химический путь для превращения пирувата, получаемого из сахаров или других углеродных источников, в ценные C5 материалы, такие как левулиновая кислота. Типичные C5 соединения показаны на Фигурах 1 и 2. При применении с сахарами в качестве углеродного источника ключом к данному пути является превращение C6 сахаров (таких как, без ограничения, глюкоза, фруктоза, галактоза) и/или C5 сахаров (таких как, без ограничения, ксилоза, арабиноза) в пируват, а затем превращение пирувата в одно или несколько ценных C5 соединений посредством химических или биохимических реакций альдольного присоединения, окисления, восстановления, дегидратации и циклизации. При применении с другим углеродным источником, таким как, без ограничения, жирные кислоты и глицерин, углеродный источник сначала превращают в пируват, а затем превращают в одно или несколько ценных C5 соединений, которые включают линейные C5 кетокислоты или сложные эфиры, или их циклизированные производные следующей общей формулы: C₅C₄(X)C₃C₂(Y)C₁(=O)(Z), где X представляет собой либо гидроксильный, либо кетоновый кислород, Y представляет собой либо водород, либо гидроксильный или кетоновый кислород, связь между C3 и C2 углеродами является либо одинарной, либо двойной (например, насыщенной или ненасыщенной), и Z представляет собой алкокси, сульфидную или феноксигруппу с тем, чтобы получить функциональную группу либо сложного эфира, либо сложного тиоэфира, либо карбоновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления C5 соединение представляет собой C₅C₄(O₁)C₃C₂(Y)C₁(=O)(O₁), где индекс “O₁” означает один и тот же кислородный атом так, что образуется циклический сложный эфир или лактон, и Y представляет собой либо водород, либо гидроксильный или кетоновый кислород. Все другие атомные валентности или связи, как предполагается, заняты водородными атомами, если ранее не указано иное.

[004] В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ создания соединения, которое представляет собой C5 кетокислоту или сложный эфир или C5 гидроксикислоту или сложный эфир или их циклическое производное. Способ включает превращение пирувата в C5 промежуточный продукт путем альдольного присоединения и превращение C5 промежуточного продукта в указанное соединение посредством химических или ферментативных этапов или их комбинации. В определенных вариантах осуществления C5 соединение имеет общую формулу C₅C₄(X)C₃C₂(Y)C₁(=O)(Z) или C₅C₄(O₁)C₃C₂(Y)C₁(=O)(O₁), которые описаны выше. В определенных вариантах осуществления соединение получают из 5-углеродного и/или 6-углеродного сахаров или сырья, подходящего в качестве углеродного источника для микробного хозяина. В этих вариантах осуществления способ включает образование пирувата из сахара или сырья (например, с помощью микробного хозяина) и альдольное присоединение ацетилальдегида к пирувату (например, в микробном хозяине или в бесклеточной системе) с получением, таким образом, 5-углеродной кетокислоты в качестве промежуточного продукта для получения желаемого C5 соединения. Ацетилальдегид для альдольного присоединения можно получить декарбоксилированием пирувата в микробном хозяине. Продукт альдольного присоединения может быть дополнительно подвержен одной или нескольким реакциям восстановления, окисления, дегидратации, переноса группы, гидролиза и/или лактонизации (например, каждая независимо в микробном хозяине или бесклеточной системе) с получением желаемого C5 продукта.

[005] Такие продукты можно применять в качестве структурных элементов для получения коммерчески ценных химических веществ и топлив. Например, лактоны, такие как 2-оксовалеролактон (соединение L7 на Фиг. 2), 2-гидроксивалеролактон (соединение L6 на Фиг. 2), ангеликалактоны (соединение L2, L3 и L10 на Фиг. 2) и 4-валеролактон (γ-валеролактон, соединение L1 на Фиг.2) можно применять в качестве растворителя. Ангеликалактон и 4-валеролактон также можно превратить химически в метиленметилбутиролактон (MeMBL) (смотри, например, WO/2006/015023, WO/2006/015024 касательно способов катализа этого превращения). Метиленметилбутиролактон можно применять в качестве мономера или сополимера для увеличения термической устойчивости полиметилакрилатных (PMMA) полимеров, широко применяемых в электронике и сферах применения, связанных с двигателем внутреннего сгорания, или для производства полимеров в целом (таких как Poly(MeMBL), смотри, например, WO/2005/028529). К тому же 4-валеролактон можно превращать с помощью химического катализа в валериановую кислоту и, дополнительно, в валератные сложные эфиры, а также изомерные бутены, бутадиен и другие алкены, включая алкены с восемью углеродами или более, как рассмотрено в Bozell J., Connecting Biomass petroleum Processing with a chemical bridge, Science 329:522-523 (2010). Левулиновую кислоту (соединение P1 на Фиг. 1) можно превратить в 1,4-пентандиол и дифеноловую кислоту, оба из которых можно применять для производства полимеров. δ-амминолевулиновая кислота (производное из левулиновой кислоты) представляет собой гербицид с оценочным спросом свыше 300 фунтов в год. Более того, левулиновую кислоту можно превратить в пирролидоны (WO/2004/085048), пирролидинoн (WO/2010/065833, WO/2004/085390, WO/2004/085349, WO/2004/084633), ангеликалактон (WO/2005/097723), 4-валеролактон и 2-метил-THF, которые являются конечными продуктами, или их можно дополнительно преобразовывать в другие соединения с различными полезными свойствами, такие как анионные жидкости (WO/2010/065833), биотоплива и топливные присадки. Левулиновую кислоту можно дополнительно использовать в качестве материала для батарей (например, патентный документ JP09190820), красок (патентный документ US5769929), покрытий (патентный документ JP06280041), антикоррозийных покрытий (патентный документ EP496555). Левулиновые сложные эфиры (или левулинатные сложные эфиры, соединения P9 на Фиг.1) представляют собой собственно полимерные структурные элементы, и после преобразования в кетали (патентный документ US 2008/0242721) и их можно также применять в качестве топливных присадок (как описано в патенте США 7153996, который включен в данный документ ссылкой в его полном объеме). К тому же, левулиновые сложные эфиры можно применять в продуктах личной гигиены (например, японский патент JP 05320023), поверхностно-активных веществах и смазочных средствах (патентный документ EP 882745), абсорбентах (смотри WO/1998/9843684). Все справочные материалы, упомянутые в этом абзаце, включены в данный документ ссылкой.

[006] И левулиновую кислоту, и левулиновые сложные эфиры, и некоторые из лактонов, перечисленных на Фиг. 2, также можно применять в производстве фармацевтически активных ингредиентов и фармацевтических областях применения, некоторые из которых перечислены в Bozell J., Production of levulinic acid and use as a platform chemical for derived products, Resources, Conservation and Recycling 28:227-239 (2000). Например, в WO/1995/022524 сообщается о применении левулинатного метилового сложного эфира для синтеза новых индоловых производных, применяемых в качестве противоопухолевых средств. Левулиновую кислоту и 4-гидроксипентановую кислоту также можно применять в качестве хирального реагента с широким полем потенциальных областей применения (смотри, например, Meyers et al., Stereoselective alkylations in rigid systems. Effect of remote substituents on p-facial additions to lactam enolates. Stereoelectronic and steric effects, J. Am. Chem. Soc. 120:7429-7438 (1998). Фармацевтические области применения C5, полученных с помощью настоящего изобретения, могут включать применение бутиро- и валеро-лактоновых производных в качестве антибиотиков и средств, препятствующих образованию биопленок, посредством того, что они нарушают молекулярный механизм «чувства кворума» у бактерий (смотри, например, патентные документы EP 1716131 и WO/2006/117113). Дополнительные применения могут проистекать из биологически активного протоанемонима (соединение L4 на Фиг. 2). В довершение ко всему, левулиновую кислоту и сложные эфиры применяли в отношении продуктов питания, вкусовой добавки и ароматизаторов (патентный документ EP1533364), а также добавок во множестве потребительских товарах. Например, левулиновую кислоту применяют в качестве добавки в сигаретах (патентный документ WO/2010/051076). Все справочные материалы в данном абзаце включены в данный документ посредством ссылки.

[007] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает превращение пирувата в 4-валеролактон. В другом варианте осуществления способ включает превращение пирувата в левулиновую кислоту. В другом варианте осуществления способ включает превращение пирувата в левулиновые сложные эфиры (левулинаты), такие как, без ограничения, этиллевулинат и пропиллевулинат. В другом альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает превращение пирувата в ангеликалактон, альфа- и альфа’-ангеликалактоны. В еще одних вариантах осуществления способ включает превращение пирувата в 2,4-дигидроксипентановую кислоту или ее циклизированную форму, 2-гидрокси-4-валеролактон. В еще одном варианте осуществления способ включает превращение пирувата в 2-оксо-4-гидроксипентановую кислоту или ее циклизированную форму, 2-оксо-4-валеролактон.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ включает множественные ферментативные этапы, объединённые в единый метаболический путь в эукариотическом, прокариотическом или archaea ферментирующем хозяине, включая, без ограничения, Saccharamyces sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp., Chrysosporium sp. и Escherichia coli. В этих и других вариантах осуществления способ включает один или несколько ферментативных этапов, проводимых в бесклеточной системе, или этапов химического катализа, или их комбинацию, при этом различные промежуточные продукты пути необязательно выделяют и/или очищают из ферментативного бульона, что необходимо для завершения процесса.

[008] Преимущество определенных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что они построены поверх основного метаболизма. Например, как C5, так и C6 метаболизм у эукариот, прокариот и archea может задействовать гликолиз для получения пирувата. Пируват представляет собой один из наиболее важных промежуточных продуктов основного метаболизма и помимо гликолиза может быть получен в результате метаболизма липидов, а также метаболизма аминокислот. Согласно способу настоящего изобретения берут пируват и превращают две молекулы пирувата в одну C5 молекулу, такую как левулиновая кислота и 4-валеролактон. В случае C6 сахаров выход углерода может составить до 80%. В случае C5 сахаров выход углерода теоретически может составить до 100%. Если в способе используют микробный штамм, способный к одновременному ферментированию C5 и C6, такой как, без ограничения, сконструированный Saccharomyces cerevisae и Pichia stipitis, то это делает возможным прямую ферментацию сахаров до левулиновой кислоты, 4-валеролактона или любого из C5 соединений, изображаемых на Фиг. 1 и Фиг. 2. Этот высокий достижимый выход представляет бесспорное промышленное преимущество по сравнению с альтернативными термохимическими способами получения левулиновой кислоты или гамма-валеролактона, в которых, как правило, получают молярные выходы 40% или менее.

[009] В одном варианте осуществления настоящего изобретения в соответствии со способом превращают поток сахаров в одно или несколько из C5 соединений, перечисленных на Фигурах 1 и 2. В другом варианте осуществления крахмал применяют в качестве сырья для процесса. В другом варианте осуществления в соответствии со способом превращают лигноцеллюлозное сырье (включая, без ограничения, кукурузную солому, древесные стружки, бытовые отходы, отбросы целлюлозных и бумажных заводов) по меньшей мере в одно из C5 соединений, перечисленных на Фигурах 1 и 2.

[0010] В одном варианте осуществления настоящего изобретения в соответствии со способом превращают C6 сахара в одно или несколько из C5 соединений, перечисленных на Фигурах 1 и 2, предпочтительно в ферментирующих штаммах, высокоэффективных при потреблении и ферментировании C6 сахаров, таких как, без ограничения, Saccharomyces cerevisiae, штамм Cargill CB1 (как описано в WO/2007/106524), Pseudomonas, Chrysosporium и Escherichia coli (E.coli). В другом варианте осуществления настоящего изобретения в соответствии со способом превращают C5 сахара в одно или несколько из C5 соединений, перечисленных на Фигурах 1 и 2, предпочтительно в ферментирующих штаммах, высокоэффективных при потреблении и ферментировании C5 сахаров, таких как, без ограничения, сконструированные Saccharomyces cerevisiae и Pichia stipitis. В варианте осуществления настоящего изобретения в соответствии со способом одновременно превращают C5 и C6 сахара в C5 соединение, предпочтительно в ферментирующих штаммах, высокоэффективных при потреблении и ферментировании как C5, так и C6 сахаров (например, Saccharomyces cerevisiae). В другом варианте осуществления настоящего изобретения ферментирующие штаммы демонстрируют высокий уровень устойчивости к ингибиторам гидролизата биомассы, таким как, без ограничения, фураны, и к низкому pH или среде с высоким титром органической кислоты.

[0011] В определенных вариантах осуществления сырье содержит один или несколько C6 сахаров, выбранных из аллозы, альтрозы, глюкозы, маннозы, гулозы, идозы, талозы, галактозы, фруктозы, псикозы, сорбозы и тагатозы. В этих или других вариантах осуществления сырье содержит один или несколько C5 сахаров, выбранных из ксилозы, арабинозы, рибозы, ликсозы, ксилулозы и рибулозы.

[0012] Если способ настоящего изобретения применяют для превращения C5 и C6 сахаров в 4-гидроксипентановую кислоту или 4-валеролактон, путь конструируют так, чтобы он был редокс (восстановление-окисление) уравновешенным: два восстановительных эквивалента (образование NAD(P)H) образуются во время гликолиза с выходом пирувата (одна молекула глюкозы к двум молекулам пирувата) и два восстанавительных эквивалента расходуются (образование NAD(P)) в дальнейшем процессе от пирувата до 4-гидроксипентановой кислоты или 4-валеролактона (γ-валеролактона). Тот факт, что этот путь является редокс-уравновешенным в отношении образования этих двух молекул, даст в результате оптимизированное превращение в случае ферментационного процесса и снизит или устранит потребность дополнительного конструирования ферментирующего хозяина для противодействия неуравновешенности. В том, что касается ферментации сахаров непосредственно во все другие соединения или структурные элементы (Фиг. 1), ферментирующий хозяин будет зависеть от отдельных побочных реакций для уравновешивания пути или внешнего источника редокс-эквивалента, подходящего для уравновешивания пути.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0013] На Фигуре 1 показаны молекулярные формулы для левулиновой кислоты (соединение P1 на Фиг. 1), а также ценные производные, которые могут быть получены на различных этапах в пути и в различных вариантах осуществления процессов, описанных в настоящем документе (соединения P1 - P16 на Фиг. 1).

[0014] На Фигуре 2 показаны молекулярные формулы для различных C5 лактонов, которые могут быть получены на различных этапах в пути в соответствии с различными вариантами осуществления способа (соединения L1 - L10).

[0015] На Фигуре 3 приведен общий обзор биохимических процессов превращения пирувата в любое из C5 соединений Фиг 1 или Фиг. 2 с выделением определенных этапов. Некоторые возможные химические промежуточные продукты и субпути здесь не изображены. Смотри Фигуру 5 для более исчерпывающего изображения возможностей различных путей.

[0016] На Фигуре 4 приведен общий обзор биохимического пути и процессов в соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения, где порядок этапов окисления/восстановления (соответствующих этапам 3 и 4 на Фиг. 3) инвертирован. Как и на Фиг. 3, некоторые возможные химические промежуточные продукты и субпути здесь не изображены. Смотри Фиг. 6 для более исчерпывающего изображения возможностей различных путей.

[0017] На Фигуре 5 приведен общий обзор биохимического пути/процессов Фиг. 3, где этап 4 и этап 5 сокращены в один этап с применением окислительной дегидратазы.

[0018] На Фигуре 6 приведен детальный обзор биохимического пути/процессов превращения пирувата в любое из C5 соединений или структурных элементов Фиг. 1 или 2. Вдобавок к химическим этапам, изображаемым на Фиг. 3, 4 и 5, изображены различные циклические промежуточные продукты, которые могут быть получены в результате реакции циклизации из промежуточных продуктов от основного пути, а также химическое преобразование, которое ведет от циклических лактоновых промежуточных продуктов к различным C5 соединениям или структурным элементам. Дополнительно также представлены различные CoA промежуточные продукты, которые могут быть получены из промежуточных продуктов в основном пути. Путь можно использовать для производства левулинил-CoA, из которого могут быть легко получены либо левулиновая кислота и 4-валеролактон, либо левулинат и/или другие пентановые сложные эфиры, такие как 4-оксопентановый сложный эфир (соединение P9) на Фиг. 1.

[0019] На Фигуре 7 показан принцип получения левулиновых сложных эфиров (левулинатов) и левулиновой кислоты из промежуточного продукта левулинил-CoA посредством действия либо тиоэстеразы, либо трансферазы. Боковая цепь R может быть любой функциональной группой, такой как, без ограничения, метильная, этильная, пропильная, арильная, фенильная, нафтильная и другие ароматические группы, а также алкильная группа с кислородными и азотными заместителями, как, например, кетоны, первичные, вторичные и третичные спирты, первичные, вторичные и третичные амины и т.д.

[0020] На Фигуре 8 показаны кинетические кривые, полученные при вступлении в реакцию двух ферментов еноатредуктаз (номера доступа в Genbank AAA64522 и AAD16106, обозначенные 6001 и 6002 на Фигуре 8) с субстратом 4-оксо-2-пентеновая кислота (так же известная, как ацетилакриловая кислота, смотри соединение P2 на Фигуре 1) и субстратом циклогексенон в качестве контроля. Кривая, обозначенная “6001 ацето” и “6002 ацето”, демонстрирует активность белков в присутствии 100 мкM NADPH и субстрата 4-оксо-2-пентеновая кислота. Кривая, обозначенная “6001 цикло” и “6002 цикло”, демонстрирует активность белков в присутствии 100 мкM NADPH и субстрата циклогексенон. Отслеживается уменьшение поглощения при 340 нм, отображающее превращение NADPH в окисленную форму NADP+. Эта кривая демонстрирует превращение субстрата 4-оксо-2-пентеновая кислота в левулиновую кислоту (соединение P1 на Фигуре 1) с помощью обоих белков. Контрольные кривые (обозначенные “6001 буфер”, и “6002 буфер”, и “буфер цикло”, и “буфер ацето”) демонстрируют уменьшение поглощающей способности с субстратами отдельно в буфере или белками отдельно в буфере. Не обнаружено значимой активности при данных условиях. Все кривые получены в буфере на основе фосфата калия 100 мM, pH 7,0 и при комнатной температуре (25ºC). Начальная концентрация NADPH 100 мкM, начальная концентрация 4-оксо-2-пентеновой кислоты 100 мM, начальная концентрация циклогексенона 50 мM. Концентрация белка варьировала.

[0021] На Фигуре 9 продемонстрирована активность фермента альдолазы класса II из Pseudomonas putida, HpaI альдолазы (номер доступа в Genbank ADA63518) на субстратах ацетальдегид и пируват. Условия анализа были следующими: экспрессировали белок, и очистили на Ni из E. Coli, и ввели в реакцию со смесью ацетальдегида и пирувата при начальной концентрации 100 мг/мл, в Тris буфере, pH 8,0, дополненным 100 мM MnCl₂. Белок и субстраты инкубировали при комнатной температуре на протяжении 30 мин. перед гашением посредством HCl и запуском в ВЭЖХ с полярной колонкой EPIC. На фигуре 9 показаны полученные кривые ВЭЖХ, при этом пики, соответствующие субстратам и продуктам, указаны на фигуре черной стрелкой. Химическая идентичность продукта, 4-гидрокси-2-оксопентановая кислота, была подтверждена LC/MS (данные не показаны).

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0022] В определенных аспектах и вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает химический путь для превращения пирувата, получаемого из сахаров или других углеродных источников, в ценные C5 материалы, такие как левулиновая кислота. По сути, способ настоящего изобретения обеспечивает путь, который организован по меньшей мере в два этапа, и в некоторых вариантах осуществления 4-8 этапов, как, например, 7-8 этапов (смотри 8 основных этапов, изображаемых на Фиг. 3), с до 4 добавочными этапами циклизации промежуточных продуктов, полученных на всем протяжении пути. Присоединение промежуточного продукта на множественных стадиях к кoфермент A (CoA)-фрагменту позволяет пути привести к образованию CoA-промежуточных продуктов, таких как левулинил-CoA (смотри Фиг. 6). К тому же, четыре необязательных этапа могут привести к образованию циклизированных вариантов ключевых промежуточных продуктов в данном пути (смотри снова Фиг. 6).

[0023] В соответствии с различными вариантами осуществления первый этап представляет собой гликолиз, в котором сахара (например, из биомассы) превращаются в пируват, или, альтернативно, любое химическое превращение из сахаров в пируват. На втором этапе две молекулы пирувата превращаются в одну молекулу 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты и CO₂. На необязательном этапе циклизации получают соответствующий лактон, 2-оксо-4-валеролактон. Необязательный этап присоединения CoA может привести к образованию 4-гидрокси-2-оксопентаноил-CoA. В третьем этапе 4-гидрокси-2-оксопентановая кислота восстанавливается до 2,4-дигидроксипентановой кислоты, или 4-гидрокси-2-оксопентаноил-CoA – до 2,4-дигидрокси-пентаноил-CoA, или 2-оксо-4-валеролактон – до 2-гидрокси-4-валеролактона. На необязательном этапе циклизации получают соответствующий лактон, 2-гидрокси-4-валеролактон, либо из 2,4-дигидроксипентановой кислоты, либо из 2,4-дигидрокси-пентаноил-CoA. Необязательный этап присоединения CoA приводит к образованию 2,4-дигидрокси-пентаноил-CoA из 2,4-дигидроксипентановой кислоты. На четвертом этапе 2,4-дигидроксипентановая кислота окисляется до 2-гидрокси-4-оксопентановой кислоты, или 2,4-дигидрокси-пентаноил-CoA – до 2-гидрокси-4-оксопентаноил-CoA. На необязательном этапе присоединения CoA 2-гидрокси-4-оксопентановая кислота превращается в 2-гидрокси-4-оксопентаноил-CoA. На пятом этапе 2-гидрокси-4-оксопентановая кислота дегидратируется до 4-оксо-2-пентеновой кислоты, или 2-гидрокси-4-оксопентаноил-CoA – до 4-оксо-2-пентеноил-CoA. На необязательном этапе присоединения CoA 4-оксо-2-пентеновая кислота превращается в 4-оксо-2-пентеноил-CoA. На необязательном этапе дополнительно 4-оксо-2-пентеновая кислота восстанавливается до 4-гидрокси-2-пентеновой кислоты, или 4-оксо-2-пентеновая кислота – до 4-гидрокси-2-пентеноил-CoA, оба из которых могут необязательно циклизироваться с образованием ангеликалактона. Другой необязательный этап присоединения CoA приводит к образованию 4-гидрокси-2-пентеноил-CoA из 4-гидрокси-2-пентеновой кислоты, который снова может необязательно циклизироваться с образованием ангеликалактона. Альтернативный вариант осуществления настоящего изобретения “сокращает” четвертый и пятый этап в один единый этап. На шестом этапе в результате образуется левулиновая кислота (4-гидроксипентановая кислота) путем восстановления 4-оксо-2-пентеновой кислоты сходным образом, как описывалось выше. На необязательном этапе кофермент A (CoA) присоединяется к левулиновой кислоте, что приводит к образованию левулинил-CoA. Левулинил-CoA может затем преобразовываться в разнообразные левулиновые сложные эфиры с помощью трансферазы, вступая в реакцию с подходящим спиртом. В некоторых вариантах осуществления на седьмом этапе левулиновая кислота дополнительно восстанавливается с образованием 4-гидроксипентановой кислоты. На восьмом этапе 4-гидроксипентановую кислоту циклизируют с выходом 4-валеролактона.

[0024] В определенных вариантах осуществления этапы 4 и 5 можно осуществлять за одно преобразование, окислительной дегидратацией. В другом варианте осуществления настоящего изобретения этапы 3 и 4 обращены порядком так, что 2-гидрокси-4-оксопентановая кислота первоначально окисляется до 2,4-диоксопентановой кислоты и затем восстанавливается до 2-оксо-4-гидроксипентановой кислоты, так что путь Фиг. 3 становится таким, как представлено на Фиг. 4.

[0025] В другом варианте осуществления настоящего изобретения этапы 3, 5 и 6 (Фиг. 3) проводят непосредственно на соответствующих лактонах L1, L2, L6, L7, L8, L9 и L10, где ответвление от линейных промежуточных продуктов, полученных изначально из пирувата и ацетальдегида, происходит на любом из этапов циклизации, описанных на Фигуре 6. Этот вариант осуществления настоящего изобретения можно применять либо для получения непосредственно лактонов, либо после гидролиза для получения обратно любого из соединений P1 - P16 (включая левулиновую кислоту).

[0026] Еще в одном аспекте настоящего изобретения этапы 2, 3, 4, 5 и 6 (Фиг. 3) проводят на промежуточных продуктах CoA, где ответвление от линейных промежуточных продуктов, полученных изначально из пирувата и ацетальдегида, происходит на любом из этапов присоединения CoA, описанных в абзаце Фигуры 6. Этот вариант осуществления настоящего изобретения можно применять для получения любого из соединений P1 - P16 (включая левулиновую кислоту) с помощью тиоэстераз. Левулиновые сложные эфиры (P9) можно получить из левулинил-CoA и соответствующего спирта с помощью трансферазы.

Этап 1: превращение сахаров в пируват

[0027] Превращение сахаров в пируват является частью хорошо исследованного метаболического пути, гликолиза. В гликолизе действие множества ферментов приводит к превращению каждой молекулы C6 сахара, такого как глюкоза, в две молекулы пирувата, две молекулы ATP и два восстановительных эквивалента в форме двух молекул NAD(P)H.

[0028] В одном варианте осуществления настоящего изобретения пируват получают в результате гликолиза в ферментирующем организме и впоследствии применяют в дальнейшем пути в ферментирующем хозяине. В альтернативном варианте осуществления пируват выделяют из ферментативного бульона и потом обрабатывают в соответствии с дальнейшим путем.

Этап 2: превращение пирувата в 4-гидрокси-2-оксопентановую кислоту

[0029] 4-гидрокси-2-оксопентановую кислоту можно получить путем альдольного присоединения ацетальдегида (альдегида) к пирувату (α кето-кислоте). В присоединении реагирует один эквивалент ацетальдегида с одним эквивалентом пирувата. Ацетилальдегид можно получить различными способами. Например, пируватдекарбоксилаза катализирует неокислительное декарбоксилирование пирувата до ацетальдегида. Следовательно, можно использовать пируватдекарбоксилазу из множества эукариотических или прокариотических источников (например Saccharomcyes cerevisiae). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ацетилальдегид получают из пирувата с ферментом пируватдекарбоксилаза.

[0030] Было выделено множество альдолаз, которые, как было продемонстрировано, катализируют альдольное присоединение пирувата с ацетальдегидом. Альдолаза класса I, альдолаза 4-гидрокси-2-кето-пентановой кислоты (HKP-альдолаза), представляет собой альдолазу, задействующую Шиффово основание с остатком лизина, и катализирует прямую и обратную реакцию. В одном варианте осуществления настоящего изобретения альдольное присоединение пирувата с ацетальдегидом катализируется HKP-альдолазой из E. coli, описанной в Pollard, JR et al., Substrate selectivity and biochemical properties of 4-hydroxy-2-keto-pentanoic acid aldolase from E. coli, Appl. and Environ. Microbiology, 64(10):4093-4094 (1998), или ее гомологом, или ее мутантами (при этом эти мутанты необязательно получены с помощью методов белковой инженерии с использованием компьютерного расчета, техник направленного развития или рационального мутагенеза или их комбинации). Техники компьютерного расчета раскрыты в патентных документах US 2009-0191607 и WO 2010/077470, которые включены в данный документ ссылкой во всей полноте.

[0031] Известно, что по меньшей мере две альдолазы класса II катализируют присоединение пирувата к ацетальдегиду, и две (BphI и HpaI) были охарактеризованы с некоторой степенью детализации в Wang W et al., Comparison of two metal-dependent pyruvate aldolases related by convergent evolution: substrate specificity, kinetic mechanism and substrate channeling, Biochemistry, 49:3774-3782 (2010). Эти ферменты используют металлический кo-фактор (в основном либо Zn, либо Mn). BphI и HpaI не имеют выявляемого общего сходства последовательностей. Поскольку BphI является стереоселективным и приводит к образованию 4S аддукта, HpaI, благодаря своему очень открытому активному сайту, производит рацемическую смесь (4R и 4S аддукты). BphI аллостерически связана с BphJ, ацетальдегиддегидрогеназой, и не активна и стабильна при экспрессии в изоляции. HpaI однако, может экспрессироваться сама по себе в E. coli и демонстрирует активность. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения альдольное присоединение пирувата к ацетальдегиду катализируется HpaI, или BphI, или их мутантами (при этом эти мутанты необязательно получены с помощью методов белковой инженерии с использованием компьютерного расчета, техник направленного развития или рационального мутагенеза или комбинации трех).

[0032] В продолжение, любую подходящую пируватальдолазу и другие сходные альдолазы (например, KDPG-альдолаза), катализирующие альдольное присоединение альдегида к кетону, предположительно можно реконструировать для катализа альдольного присоединения ацетальдегида к пирувату. Реконструкция может включать, без ограничения, достижение желаемой субстратной специфичности как к пирувату, так и к ацетальдегиду, контроль желаемой стереоселективности для образования либо рацемических, либо энантиочистых аддуктов ((R)4-гидрокси-2-оксопентановая кислота и (S)4-гидрокси-3-оксопентановая кислота), стабилизацию фермента для получения желаемой каталитической активности в промышленных условиях, в которых настоящее изобретение осуществляют на практике (например, термостабилизация или стабилизация при высоком титре органических веществ), и/или повышение экспрессируемости и растворимости фермента в контексте промышленных условий, в которых настоящее изобретение осуществляют на практике (например в метаболическом пути в Saccharomyces cerevisiae). В другом варианте осуществления настоящего изобретения альдольное присоединение пирувата к ацетальдегиду катализируется пируватальдолазой или любыми ее гомологами и мутантами (при этом эти мутанты необязательно получены с помощью методов белковой инженерии с использованием компьютерного расчета, техник направленного развития или рационального мутагенеза или комбинации трех).

[0033] Наконец, с помощью техники конструирования фермента de novo, такой как та, что описана у Zanghellini, A. et al., New Algorithms and an in silico Benchmark for Computational Enzyme Design, Protein Science 15:2785-2794 (2006), можно сконструировать новые альдолазные ферменты для субстратов, которые могут или не могут существовать в природе. До 70 таких альдолаз были сконструированы de novo, как описано в заявке на патент США 2009-0191607, которая включена в данный документ ссылкой во всей полноте. Применение данной методологии к субстратам пируват и ацетальдегид может привести к получению альдолаз с желаемой активностью. В другом варианте осуществления настоящего изобретения альдольное присоединение пирувата к ацетальдегиду катализируется сконструированой de novo альдолазой.

Этап 2’: циклизация 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты в 2-оксо-4-валеролактон

[0034] 4-Гидрокси-2-оксопентановую кислоту циклизируют в 2-гидрокси-4-валеролактон (соединение L7 на Фигуре 1). В кислотно-нейтральных растворах термодинамическое равновесие располагает к циклизации в лактон. Циклизацию в лактон можно кинетически увеличить посредством либо химического, либо биохимического катализа. Гомогенные и гетерогенные катализаторы для лактонизации включают сильные кислотные условия (например, серную кислоту), металлические катализаторы (например, палладий, рубидий). Биохимический катализ можно получить под действием липаз, эстераз, протеаз и лактоназ при условиях, которые способствуют прямой реакции лактонизации (низкий-нейтральный pH / высокий титр органического растворителя), как демострируется, например, в Martin CH, et al., Integrated bioprocessing for pH-dependent of 4-valerolactone from levulinate in Pseudomonas Putida KT2440, Appl. and Environ, Microbiology 76(2):417-424.

[0035] В одном варианте осуществления настоящего изобретения 2-оксо-4-валеролактон получают из 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты в присутствии катализатора после выделения 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты из ферментативного бульона или бесклеточного раствора. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лактонизация 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты в 2-оксо-4-валеролактон катализируется непосредственно липазой, или эстеразой, или протеазой, или лактоназой, или их мутантами (при этом эти мутанты необязательно получены с помощью методов белковой инженерии с использованием компьютерного расчета, техник направленного развития, рационального мутагенеза или комбинации трех).

Этап 3: восстановление 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты до 2,4-дигидроксипентановой кислоты

[0036] Среди широкого разнообразия природных дегидрогеназ с помощью in silico и/или экспериментального скрининга можно отобрать дегидрогеназы с субстратной специфичностью, которая допускает 4-гидрокси-2-оксопентановую кислоту и 2,4-дигидроксипентановую кислоту. К тому же компьютерный расчет, техники направленного развития, или рациональный мутагенез, или комбинацию трех можно применять для изменения или увеличения субстратной специфичности существующей дегидрогеназы по отношению к 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоте и 2,4-дигидроксипентановой кислоте. Примеры подходящих отправных точек дегидрогеназ включают L- и D-лактатдегидрогеназы (NAD(P)H- или гем-зависимые, эукариотического или бактериального происхождения), малат-, аспартат- и глутамат-дегидрогеназы (NAD(P)H-зависимые эукариотического или бактериального происхождения), а также алкогольдегидрогеназы (такие как NAD(P)H-зависимые дегидрогеназы алкиловых и фениловых спиртов). Примеры таких дегидрогеназ перечислены в разделе примеров.

[0037] В одном варианте осуществления настоящего изобретения 4-гидрокси-2-оксопентановую кислоту селективно восстанавливают до 2,4-дигидроксипентановой кислоты с помощью гомогенного или гетерогенного химического катализа. Для завершения данного этапа 2,4-дигидроксипентановая кислота может быть или не быть выделена/очищена из ферментативного или бесклеточного раствора. Предпочтительно, 2,4-дигидроксипентановую кислоту выделяют из раствора или ферментативного бульона перед тем, как подвергнуть указанному восстановлению.

[0038] В одном варианте осуществления настоящего изобретения NAD(P)H-зависимую дегидрогеназу применяют для катализа восстановления кетона во 2 положении 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты. В другом варианте осуществления указанная дегидрогеназа восстанавливает кетон с высокой степенью субстратной специфичности к 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоте и высокой региоселективностью по кетону во 2 положении. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная дегидрогеназа не является стереоселективной и может принять как 4R, так и 4S энантиомеры. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная дегидрогеназа селективно восстанавливает либо 4R, либо 4S энантиомерную форму 4-гидрокси-2-оксопентановой кислоты.

[0039] В другом в