Штамм microbacterium, композиции и способы для борьбы с фузариозом

Штамм microbacterium, композиции и способы для борьбы с фузариозом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[0001] Содержание прилагаемого Перечня последовательностей включено здесь во всей его полноте посредством ссылки. Прилагаемый файл под наименованием «SGI1520-lWO_ST25.txt» был создан 24 июля 2012 г. и имеет размер 55 Кб. Этот файл открыт для доступа с помощью Microsoft Word на компьютере с операционной системой Window OS.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Настоящее изобретение относится к биологическим методам борьбы с фитопатогенными болезнями. В частности, изобретение относится к композициям и способам, которые могут использоваться в борьбе с фузариозом злаковых растений, таких как пшеница и ячмень.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Фузариоз, известный также как парша, плесневидная розовая гниль и фузариоз, является болезнью, опустошающей сельскохозяйственные угодья пшеницы, ячменя и многих других злаковых культур во всем мире и, особенно, в США, Европе и Китае. Эта болезнь может достигать эпидемических масштабов и наносить обширные уроны зерновым культурам, особенно пшенице и ячменю, во влажных и полувлажных ареалах выращивания хлебных злаков, включая Индию, Россию, Францию, Германию и Великобританию. В частности, фузариоз или фузариоз пшеницы является одной из наиболее убыточных болезней пшеницы в Соединенных Штатах. В общенациональных масштабах эта болезнь, развившаяся на Среднем Западе и на Высоких Равнинах, принесла производству пшеницы потери, достигающие миллионов долларов, и стала, таким образом, главным препятствием для успешного функционирования этой индустрии в последние годы. Фузариоз, помимо пшеницы, поражает также ячмень, овес, кукурузу и множество других зерновых культур, и репродуцируется на них.

[0004] Эта болезнь может вызываться множеством различных фитопатогенов и, в первую очередь, несколькими видами грибов рода Fusarium. В число вероятных возбудителей фузариоза пшеницы входит множество различных видов Fusarium, например, F. culmorum, F. graminearum (телеоморф, Gibberella zeae), F. avenaceum (телеоморф, G. avenacea), F. poae, а также патогены, не относящиеся к роду Fusarium, такие как Microdochium nivale (телеоморф, Monographella nivalis), и Microdochium majus. В Соединенных Штатах, Европе и других наиболее важных агрономических ареалах мира доминирующим возбудителем фузариоза выступает Fusarium graminearum (телеоморф, Gibberella zeae в буквальном смысле).

[0005] Эти патогены, как правило, выживают на растительных остатках. На колоски злаков они попадают и поражают их во время цветения, останавливая или частично задерживая развитие зерна в колосе злака. В результате, попавший на растение патоген может убить часть колоса либо весь колос. Некоторые инфицированные семена имеют настолько низкую энергию прорастания, что зачастую не могут прорасти. Проросшие инфицированные семена часто рано погибают в фазе прорастания вследствие пелликуляриоза или корневой гнили, вызывающих плохой хлебостой выросшего злака. Здоровые сеянцы могут инфицироваться также в фазе появления всходов. Помимо плохого, неэкономичного хлебостоя, потери урожая вследствие поражения патогеном могут быть довольно высокими, если условия благоприятствуют развитию болезни.

[0006] Грибные патогены рода Fusarium распространяются по ареалам культивирования злаков во всем мире и наносят особенно большой ущерб в местах выпадения больших осадков в период между цветением и наливом зерна. Если возбудителем заболевания является Fusarium graminearum, то данная болезнь требует первоочередного вмешательства, не только потому что она снижает коммерческие показатели пораженного зерна, вдобавок к прямым потерям урожая, но также потому, что заражение грибом Fusarium может приводить к накоплению микотоксинов, трихотеценов, в зернах, создавая, таким образом, угрозу здоровью людей и скота. Трихотецены представляют собой главное микотоксиновое загрязнение зерновых культур во всем мире, способное у нежвачных животных вызывать отказ от пищи, рвоту, диарею и потерю веса и создавать угрозу здоровью для других животных и людей в случаях высоких уровней воздействия этих токсинов. В Соединенных Штатах эта угроза возросла еще больше вследствие недавно произошедшего смещения в штаммах F. graminearum в сторону повышения выработки и силы токсинов. Микотоксинами, обнаруживаемыми чаще всего, являются дезоксиниваленол (DON, известный также как вомитоксин) и зеараленон (ZEA). Дезоксиниваленол является особенно опасным токсином, вызывающим желудочно-кишечные расстройства, которые сопровождаются кровотечениями и другими тяжелыми состояниями у людей и животных, принявших в пищу инфицированные зерна, и в некоторых случаях могут привести к смерти. Поскольку дезоксиниваленол в общем случае является стойким к изменениям pH и к высоким температурам, дезинтоксикация может проходить очень тяжело. Таким образом, зерна, загрязненные выше определенного уровня, не могут использоваться в пивоварении, переработке, корме для скота и, следовательно, должны удаляться в отходы.

[0007] На сегодняшний день разработано множество различных стратегий по борьбе с фузариозом у сельскохозяйственных культур. Наиболее перспективными среди них являются химические методы, разработка стойких сортов культур, а также традиционные методы севооборота и обработки полей. Среди этих направлений определенную эффективность в снижении заражения фузариозом можно получить от применения химических пестицидов, однако остатки фунгицидов, использованных на поздних стадиях роста культур, как правило, в периоды цветения, всего за несколько недель до сбора урожая, снижают привлекательность этих методов. С другой стороны, альтернативный подход в борьбе с этой болезнью представляют методы традиционной селекции и генной инженерии, благодаря которым происходит заметный прогресс в разработках стойких сортов агрокультур. Генная инженерия позволяет изменять продуцирование фитогормона и осуществлять манипуляции в его сигнальном пути. Достигнутый в последние годы прогресс в области традиционной селекции позволил значительно продвинуться в понимании генетических основ стойкости к фузариозу и получить сведения о множестве генов и локусах количественных признаков (QTL: quantitative trait loci), придающих этой стойкости. Однако прогресс в повышении стойкости агрокультур к фузариозу был медленным, что объясняется, в первую очередь, трудностью изучения данной болезни. Фактически о механизмах, определяющих стойкость или восприимчивость растений к фузариозу, в настоящее время известно сравнительно мало. Кроме того, генетическое разнообразие грибов вида Fusarium, которые являются преобладающими возбудителями болезни, часто создает проблемы в определении того, насколько длительной должна быть эффективность химических фунгицидов и насколько стойкими должны быть защищаемые агрокультуры. В результате, в настоящее время практически все сорта пшеницы в агропромышленном производстве остаются уязвимыми для инфицирования.

[0008] Кроме того, несмотря на определенный успех в борьбе с фузариозом, который могут давать традиционные методы пахотной обработки с закапыванием пожнивных остатков, инфицированных возбудителем, например, F. graminearum, обычная вспашка почвы после жнив является несовместимой с устоявшейся практикой охраны почв, то есть с условием минимальной пахотной обработки. Принимая во внимание вероятность разброса инокулята на большие расстояния и то, что различные культуры могут становиться альтернативными хозяевами патогенов, метод севооборота нередко оказывается неприемлемым. Помимо загрязнения окружающей среды пестицидами, их использование может порождать проблемы, связанные с пестицидостойкостью. Кроме того, с их использованием могут быть связаны также зарегистрированные случаи роста содержания DON в зернах. Помимо этого, расходы и растущие проблемы как в государственном, так и в частном секторах, связанные с загрязнением пестицидами окружающей среды и требованиями к безопасности пищевых продуктов, делают данный способ борьбы с такими болезнями менее привлекательным и заставляют в уходе за агрокультурами применять пестициды как можно меньше.

[0009] Подводя итог, можно сказать, что, несмотря на существенное продвижение в области разработок способов борьбы с фузариозом, уменьшение влияния этой губительной болезни на производство и качество зерна пока остается нерешенной проблемой. Следовательно, для повышения продуктивности производства и качества многих зерновых культур важно вести поиск и разработку новых способов борьбы с фузариозом. Эти проблемы требуют срочного решения не только в Соединенных Штатах, но и на всем земном шаре, включая Азию и Европу.

[0010] Борьба с фузариозом с помощью биологических агентов стала привлекать к себе внимание, начиная с середины 1990-х годов. Биологические агенты для такой борьбы (BCA: Biological control agents), несмотря на то что количество их в настоящее время весьма ограничено, могут, при своей невраждебности к окружающей среде, быть очень эффективными в снижении уровня заболеваемости, инициируемой патогенами рода Fusarium. Общественное признание, совместимость с другими средствами борьбы с болезнями агрокультур, долговечность и стойкость - все это, наряду с другими положительными факторами, говорит о необходимости разработок стратегий биологической борьбы с фузариозом. Средства такой биологической борьбы могут сыграть важную роль в органической зерновой индустрии. В обычном производстве зерна такие средства могут продлить защиту колосков на время после фазы цветения, когда химические фунгициды применяться больше не могут. На сегодняшний день, в области биологической борьбы уже достигнут значительный прогресс. Так, например, некоторые штаммы споро-продуцирующих бактерий (например, видов Bacillus и Pseudomonas) и дрожжей (например, вида Cryptococcus) демонстрируют качества, требующиеся для борьбы с фузариозом и для снижения микотоксинового загрязнения. Однако, несмотря на этот прогресс, остается неудовлетворенной потребность в улучшенных микроорганизмах для их использования в борьбе с фузариозом. Хотя сами по себе BCA-средства уже признаны более подходящим инструментом для борьбы с фитопатогенами, а BCA-продукты находят на рынке значительно более широкий сбыт, чем когда-либо ранее, все же на сегодняшний день было предпринято совсем мало попыток разработать стратегии и антагонистический микроорганизм для биологической борьбы с фузариозом. Кроме того, жизненный цикл рода Fusarium и других возбудителей фузариоза указывает на то, что эти патогены потенциально могут быть подходящими для использования их в методах биоборьбы с помощью антагонистических микроорганизмов на различных фазах роста и развития. Таким образом, существует потребность в поиске новых средств биологической борьбы, желательно с различными способами активности, а также способов биоборьбы, которые бы позволяли эффективно предотвращать или подавлять развитие фузариоза.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Изобретение относится к композициям, содержащим микробиологические штаммы и культуры. Некоторые штаммы, культуры и их композиции могут использоваться для борьбы с фузариозом, например, различных сельскохозяйственных культур, включая пшеницу и другие зерновые. Изобретение также относится к композициям для биологической борьбы и способам использования этих композиций для предотвращения возникновения, подавления развития или лечения вызванной патогенами болезни и для сохранения урожая. Изобретение также относится к способам использования таких композиций в качестве средств биологической борьбы в комбинации с другими эффективными в сельском хозяйстве соединениями или композициями для борьбы с вредными фитопатогенами.

[0012] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным микробным штаммам, обладающим супрессорной активностью по отношению к фузариозу. Микробные штаммы в соответствии с этим аспектом выбираются из группы, состоящей из видов Microbacterium, Bacillus, Mycosphaerella и Variovorax. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения микробные штаммы выбираются из группы, состоящей из вида Mycosphaerella штамм SGI-010-HI 1 (депозит NRRL 50471), вида Microbacterium штамм SGI-014-C06 (депозит NRRL B-50470), вида Variovorax штамм SGI-014-G01 (депозит NRRL B-50469), вида Bacillus штамм SGI-Q15-F03 (депозит NRRL B-50760), вида Bacillus штамм SGI-015-H06 (депозит NRRL B-50761) и их вариантов, обладающих пестицидной активностью. Микробный штамм в соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления может содержать последовательность ДНК, демонстрирующую по меньшей мере 85% идентичность любой из нуклеотидных последовательностей, приведенных в прилагаемом Перечне последовательностей. Изобретение также относится к биологически чистым культурам и обогащенным культурам описанных здесь микробных штаммов.

[0013] В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к композициям, содержащим микробный штамм по изобретению или его культуру и эффективное для сельскохозяйственного производства количество соединения или композиции, выбранных из группы, состоящей из акарицида, бактерицида, фунгицида, инсектицида, микробицида, нематицида, пестицида и удобрения. Указанные композиции в некоторых вариантах осуществления этого аспекта могут быть получены в форме препарата, выбранного из группы, состоящей из эмульсии, коллоида, пылевидного препарата, частицы, гранулы, порошка, спрея и раствора; в некоторых других вариантах осуществления указанные композиции могут содержать носитель. В одном из предпочтительных вариантов носитель является приемлемым для сельскохозяйственного производства. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления изобретения носителем является семя растения. В других предпочтительных вариантах композицией является препарат покрытия семени. Кроме того, изобретение относится к семенам, покрытым композицией в соответствии с настоящим изобретением.

[0014] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, ингибирования или обработки против развития фитопатогена. Эти способы включают выращивание микробного штамма по изобретению или его культуры в питательной среде или почве растения-хозяина перед или одновременно с выращиванием растения-хозяина в питательной среде или почве, где в некоторых предпочтительных вариантах осуществления данного аспекта изобретения, фитопатоген вызывает фузариоз. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления фитопатогеном является Fusarium graminearum.

[0015] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, ингибирования или обработки против развития фузариоза растения. Эти способы включают поставку к растению или к среде, окружающей растение, эффективного количества микробного штамма по изобретению или его культуры. В одном из вариантов осуществления изобретения такой фузариоз вызывается грибом Fusarium graminearum. В некоторых вариантах осуществления этого аспекта микробный штамм или его культуру поставляют к почве, семени, корням, цветку, листу, части растения или всему растению, где в предпочтительном варианте растение является восприимчивым к Fusarium graminearum. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления изобретения растением является пшеница, кукуруза, ячмень или овес, в другом предпочтительном варианте осуществления микробный штамм по изобретению или его культуру вводят в растение в качестве эндофита.

[0016] В следующем аспекте изобретение относится к растениям неприродного происхождения. Растения неприродного происхождения искусственно инфицируются микробным штаммом по изобретению или его культурой. Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления этого аспекта изобретение относится к семени, репродуктивной ткани, вегетативной ткани, частям растения и потомству растения неприродного происхождения.

[0017] В другом аспекте изобретение относится к способу получения сельскохозяйственной композиции. Этот способ включает инокуляцию микробного штамма в соответствии с настоящим изобретением или его культуры в субстрат или на субстрат и выращивание его при температуре 1-37°C до получения клеток или спор в количестве по меньшей мере 10²-10³ на миллилитр или на грамм.

[0018] Этим и другим целям и признакам данного изобретения дано более полное разъяснение в нижеследующем подробном описании и формуле изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0019] Если не указано иного, то все используемые в настоящем описании термины, относящиеся к данной области техники, условные обозначения и другие научные термины несут общепринятые значения, известные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Некоторым терминам с общеизвестными значениями здесь даны определения в целях избегания разночтения и/или для облегчения ссылок, и включение здесь таких определений не должно рассматриваться как представляющее существенное отличие от значений, общепринятых среди специалистов. Многие способы и процедуры, которые здесь описаны или на которые делаются ссылки, должны быть специалистам хорошо известными и широко используемыми ими в соответствии с обычными методологиями.

[0020] Если из контекста данного описания ясно не вытекает иного, то единственное число существительных предполагает равным образом их значения во множественном числе. Например, термин «клетка» может означать как одну, так и множество клеток, включая их смеси.

[0021] Выражения «антагонистический микроорганизм» и «микробный антагонист» - оба означают микроорганизм, штамм которого показывает степень ингибирования фузариоза, которая на статистически значимом уровне превышает степень ингибирования от необработанного контроля.

[0022] Антибиотик: термин «антибиотик» в данном описании означает субстанцию, способную убить или ингибировать рост микроорганизма. Антибиотики могут продуцироваться по меньшей мере одним из таких источников: 1) микроорганизмом, 2) процессом синтеза и 3) процессом полусинтеза. Антибиотиком может быть микроорганизм, выделяющий летучее органическое соединение. Кроме того, антибиотиком может быть летучее органическое соединение, выделяемое микроорганизмом.

[0023] Бактерицидный: термин «бактерицидный» в данном описании означает способность композиции или субстанции повысить смертность бактерий или ингибировать скорость их роста. Ингибирование скорости роста бактерий в большинстве случаев может оцениваться по уменьшению количества жизнеспособных бактериальных клеток с течением времени.

[0024] Биологическая борьба: термин «биологическая борьба» и его сокращенная форма «биоборьба» в данном описании означают борьбу с патогенном, либо с насекомым, либо с любым другим нежелательным организмом с помощью по меньшей мере одного другого организма, не являющегося человеком. В качестве примера известного механизма биологической борьбы можно привести использование микроорганизмов, которые борются с корневой гнилью путем вытеснения грибов из конкуренции за пространство на поверхности корня, или микроорганизмов, которые либо ингибируют рост патогена, либо убивают его. «Растением-хозяином» в контексте биологической борьбы является растение, восприимчивое к болезни, вызываемой данным патогеном. «Растением-хозяином» в контексте отделения принадлежащего к виду грибов организма от его естественной среды является такое растение, которое поддерживает рост гриба, то есть, например, растение вида, для которого гриб является эндофитом.

[0025] Термин «зерновой» в данном описании означает любой зерновой вид, который может быть восприимчивым к фузариозу. К числу таких восприимчивых зерновых культур относятся пшеница, ячмень, овес и тритикале; при этом пшеница и ячмень являются двумя культурами, для которых данная болезнь представляет особенно значительную экономическую проблему.

[0026] Термин «эффективное количество» означает количество, достаточное для получения полезных или целевых результатов. В отношении борьбы с болезнью, к лечебной обработке, ингибированию болезни или защиты от нее, эффективным является количество, достаточное для подавления, стабилизации, поворота хода болезни вспять, замедления или задержания развития инфекции-мишени или болезненного состояния. Таким образом, выражение «эффективное количество» в данном описании означает такое количество антагонистической обработки, которое является необходимым для снижения уровня развития патогена и/или уровня вызванной патогеном болезни по сравнению с уровнем, который наблюдается у необработанного контроля. Как правило, эффективное количество данной антагонистической обработки дает снижение по меньшей мере на: 20%; как правило, от 30 до 40% и больше; как правило, от 50 до 60% и больше; как правило, от 70 до 80% и больше; или, как правило, от 90 до 95% по сравнению с уровнем болезни и/или уровнем развития патогена, наблюдаемым у необработанного контроля в соответствующих условиях лечебной обработки. Эффективное количество может поставляться за один или больше приемов. Фактическая скорость поставки жидкого препарата обычно лежит в пределах приблизительно от минимум 1×10³ до 1×10¹⁰ жизнеспособных клеток/мл и предпочтительно приблизительно от 1×10⁶ до 5×10⁹ жизнеспособных клеток/мл. В большинстве состояний антагонистические микробные штаммы по изобретению, описанные в Примерах ниже, будут оптимально эффективными при скорости поставки в интервале приблизительно от 1×10⁶ до 1×10⁹ жизнеспособных клеток/мл, если при поставке обеспечивается практически однородный контакт по меньшей мере приблизительно 50% тканей растения. Если антагонисты поставляются в форме твердого препарата, то скорость поставки должна регулироваться таким образом, чтобы обеспечивать количество жизнеспособных клеток на единицу площади поверхности ткани растения, сравнимое с получаемым при вышеупомянутых величинах скорости обработки жидкостью. Как правило, средства биологической борьбы согласно изобретению являются биологически эффективными, если они поставляются в концентрации выше 10⁶ КОЕ/г (колониеобразующих единиц на грамм), предпочтительно, если выше 10⁷ КОЕ/г, еще предпочтительнее, если выше 10⁸ КОЕ/г, и наиболее предпочтительно, если в концентрации 10⁹ КОЕ/г.

[0027] Далее, выражение «эффективный микробный антагонист», используемое по отношению к микроорганизму, означает, что данный микробный штамм демонстрирует степень ингибирования фузариоза, которая на статистически значимом уровне превышает степень ингибирования, наблюдаемую у необработанного контроля. Как правило, эффективный микробный антагонист обладает способностью давать снижение по меньшей мере на: 20% и больше; как правило, от 30 до 40% и больше; как правило, от 50 до 60% и больше; как правило, от 70 до 80% и больше; как правило, от 90 до 95% относительно уровня болезни и/или уровня развития патогена, имеющего место в необработанном контроле при соответствующих условиях лечебной обработки.

[0028] Композиция: термин «композиция» означает комбинацию активного агента по меньшей мере с другим соединением, носителем или композицией, инертным(-й) (например, детектируемым агентом или меткой, жидким носителем и т.п.) или активным, например, пестицидом.

[0029] Выделенный микробный штамм, выделенная культура, биологически чистая культура и обогащенная культура: используемый в данном описании термин «выделенный» в применении к микроорганизму (например, бактерии или микрогрибу) означает микроорганизм, который был отделен и/или очищен от среды, где он природно возникает. Аналогично этому, термин «выделенный штамм» микроба означает штамм, который был отделен и/или очищен от своей естественной среды. Таким образом, термин «выделенный микроорганизм» не включает в свое значение микроорганизм, пребывающий в среде, в которой он нормально возникает. Кроме того, термин «выделенный» не обязательно отражает степень, до которой данный микроб был очищен. Термин «по существу чистая культура» микробного штамма означает культуру, которая по существу не содержит других микробов, кроме целевого микробного штамма или штаммов. Другими словами, «по существу чистая культура» микробного штамма по существу не содержит загрязнений, которые могут включать микробные загрязнения, а также нежелательные химические загрязнения. Кроме того, используемый здесь термин «биологически чистый» штамм означает штамм, выделенный из материалов, с которыми он нормально ассоциируется в природных условиях. Следует заметить, что штамм, ассоциированный с другими штаммами или соединениями, или материалами, которые в природных условиях нормально не встречаются, также имеет определение «биологически чистый». Вполне понятно, что монокультура того или иного штамма является «биологически чистой». Используемый здесь термин «обогащенная культура» выделенного микробного штамма означает микробную культуру, содержащую более 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% выделенного штамма.

[0030] Используемый здесь термин «эндофит» означает эндосимбионт, живущий внутри растения на протяжении по меньшей мере части своей жизни, не вызывая очевидной болезни. Трансмиссия эндофитов может происходить либо по вертикали (непосредственно от родителя к потомству) либо по горизонтали (от индивида к неродственному индивиду). Переданные по вертикали грибные эндофиты являются, как правило, бесполыми и переносятся от материнского растения к потомству путем проникновения в семена хозяина через грибные гифы. Бактериальные эндофиты могут переноситься по вертикали также от семян к саженцам (Ferreira et al., 2008). В противоположность этому, горизонтально передаваемые эндофиты, как правило, имеют пол и переносятся спорами ветром и/или насекомыми-переносчиками. Эндофиты возделываемых зерновых привлекли к себе большое внимание в связи с их способностью бороться как с болезнью, так и с заражением насекомыми, а также активировать рост растений.

[0031] Функционально сравнимый протеин: используемый здесь термин «функционально сравнимый протеин» относится к протеинам, имеющим по меньшей мере одну общую характеристику. Такими характеристиками могут быть подобие друг другу последовательностей, биохимическая активность, подобие друг другу схем транскрипции и фенотипичная активность. Как правило, функционально сравнимые протеины имеют некоторое подобие между собой последовательностей или являются подобными по меньшей мере по одному биохимическому признаку. В рамках этого определения функционально сравнимыми считаются гомологи, ортологи, паралоги и аналоги. Кроме того, функционально сравнимые протеины, в общем случае, имеют схожую по меньшей мере одну биохимическую и/или фенотипичную активность. Функционально сравнимые протеины придают одной и той же характеристике подобие, но не обязательно в одинаковой степени. Как правило, функционально сравнимые протеины дают одни и те же характеристики, которые в количественном измерении у одного из сравниваемых протеинов, составляют по меньшей мере 20% от таковых у другого, чаще от 30 до 40%; еще чаще от 50 до 60%, еще чаще от 70 до 80%, еще чаще от 90 до 95% и, как правило, от 98 до 100% от таковых у другого.

[0032] Фунгицидный: используемый здесь термин «фунгицидный» означает способность композиции или субстанции снизить скорость роста грибов или повысить смертность грибов.

[0033] Гриб Fusarium: в контексте данного изобретения термин «гриб Fusarium» включает в себя как половую (телеоморфную) фазу этого организма, так и бесполую (анаморфную) его фазу, называемые также фазами, соответственно, совершенных и несовершенных грибов. Например, анаморфной фазой гриба Fusarium graminearum является Gibberella zeae, то есть возбудитель фузариоза. Эта болезнь, как правило, возникает, когда цветок или семенная шапка инокулируется конидиями, выпускаемыми несовершенной формой, или аскоспорами, выпускаемыми совершенной формой этого гриба.

[0034] Мутант: используемый здесь термин «мутант» или «вариант» по отношению к микроорганизму означает модификацию родительского штамма, в котором целевая биологическая активность является подобной активности, выражаемой родительским штаммом. Например, в случае Microbacterium «родительским штаммом» называется оригинальный штамм Microbacterium до мутагенеза. Мутанты или варианты могут возникать в природе без вмешательства человека. Они могут быть получены также путем обработки одним или множеством способов и составов, известных специалистам в данной отрасли. Например, родительский штамм может быть обработан химикатом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанид, этилметансульфон, или же гамма-, рентгеновским либо ультрафиолетовым излучением, или любыми другими средствами, хорошо известными специалистам в данной отрасли.

[0035] Нематоцидный: термин «нематоцидный» в данном описании означает способность субстанции или композиции повысить смертность или ингибировать скорость роста нематодов.

[0036] Патоген: термин «патоген» в данном описании означает организм, такой как водоросль, паукообразное, бактерия, гриб, насекомое, нематод, растение-паразит, дрожжи, простейшее животное или вирус, способный продуцировать болезнь у растения или животного. Термин «фитопатоген» в данном описании означает патогенный организм, инфицирующий растение.

[0037] Процент идентичности: «процент идентичности последовательности», в соответствии с данным описанием, определяют путем локального сопоставления двух оптимально выровненных последовательностей на участке выравнивания, определяемом длиной локального выравнивания двух последовательностей. При оптимальном выравнивании двух последовательностей данная аминокислотная последовательность на участке выравнивания может содержать добавки или делеции (например, пробелы или оверхэнги) в сравнении с эталонной последовательностью (которая не содержит добавок или делеций). Локальное выравнивание двух последовательностей проводится только по тем сегментам каждой последовательности, которые предположительно являются достаточно подобными по определенному критерию, выбираемому в соответствии с алгоритмом, используемым для выравнивания (например, программой BLAST). Процент идентичности вычисляют путем определения количества совпадений позиций, в которых в обеих последовательностях размещаются идентичные основания нуклеиновых кислот или остатки аминокислот, деления полученной величины совпадений на общее количество позиций на данном участке выравнивания и умножения полученного результата на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей может осуществляться с помощью алгоритма локальной гомологии Смита-Ватермана (Smith and Waterman, Add. APL. Math. 2:482, 1981) или алгоритма глобальной гомологии Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), методом исследования подобия Пирсона-Липмана (Pearson and Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), эвристической имплементации этих алгоритмов (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ) или путем визуальных исследований. Если две последовательности были выбраны для выравнивания, то для проведения их оптимального выравнивания предпочтительно использовать алгоритмы GAP и BESTFIT. Как правило, по умолчанию задают величины 5.00 для веса пробелов и 0.30 для длины веса пробелов. Термин «существенная идентичность последовательностей» между полинуклеотидными или полипептидными последовательностями относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичность в сравнении с эталонной идентичностью, определенную с помощью компьютерной программы.

[0038] Анализ нуклеинокислотных и аминокислотных последовательностей может проводиться путем сопоставления их с соответствующими нуклеинокислотными или аминокислотными последовательностями, хранящимися в публичных или частных базах данных. Такие исследования могут проводиться с помощью программы NCBI BLAST v 2.18 Национального центра информации по биотехнологиями (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool). Программа NCBI BLAST доступна в сети Интернет по адресу blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (National Center for Biotechnology Information). В программе NCBI BLAST могут использоваться, как правило, следующие параметры: Опции фильтров устанавливают по умолчанию «default»; Матрицу выравнивания (Comparison Matrix) устанавливают на «BLOSUM62»; Издержки на пробелы (Gap Costs) устанавливают на «Existence: 11, Extension: 1», Размер слова (Word Size) устанавливают на 3, Порог ожидания Expect (E threshold) устанавливают на 1e-3, а минимальную длину локального выравнивания устанавливают на 50% длины анализируемой последовательности. Идентичность и сходство последовательности могут определяться также с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA).

[0039] Термин «пестицидный» в данном описании означает способность данной субстанции или композиции снизить скорость роста организма-вредителя, то есть нежелаемого организма, или повысить смертность организма-вредителя.

[0040] Под «супрессорной активностью» средства биологической борьбы с данным фитопатогеном понимают способность данного средства (агента) подавлять, ингибировать, стабилизировать, поворачивать ход болезни вспять, замедлять или задерживать развитие самого патогена или прогрессирование инфекции или болезненного состояния, вызванного данным патогеном.

[0041] Вариант: термин «вариант», используемый в данном описании по отношению к микроорганизму, означает штамм, имеющий идентифицирующие характеристики вида, к которому он принадлежит, и при этом по меньшей мере одну вариацию нуклеотидной последовательности или идентифицируемую отличительную особенность, относящуюся к родительскому штамму и являющуюся генетически (наследуемой). Например, штамм SGI-SGI-014-CQ6 вида Microbacterium, обладающий фунгицидной активностью и имеющий идентифицируемые особенности, включающие 1) способность подавлять рост гриба Fusarium graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae, 2) способность подавлять развитие фузариоза, 3) наличие обязательных генов с идентичностью более 95%, более 96%, более 97%, более 98% или более 99% с обязательными генами SGI-014-C06 вида Microbacterium, может использоваться для подтверждения того, что анализируемый вариант является SGI-014-C06 вида Microbacterium.

[0042] В отношении нуклеиновых кислот и полипептидов термин «вариант» используется здесь для обозначения полипептидной, протеиновой или полинуклеотидной молекулы с некоторыми отличиями, созданными искусственно или природным путем, в их аминокислотных или нуклеинокислотных последовательностях от эталонных полипептидов или полинуклеотидов, соответственно. Этими отличиями могут быть, например, замены, инсерции, делеции или любые целевые комбинации таких изменений в эталонном полипептиде или полипептиде. Полипептидные и протеиновые варианты могут, кроме того, состоять из изменений в заряде и/или посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования, метилирования, фосфорилирования и др.).

[0043] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены здесь посредством ссылки так, как если бы каждая из публикаций или патентных заявок была индивидуально включена посредством ссылки.

[0044] Ссылки не означают признания их известным уровнем техники или прототипом. Обсуждением ссылок констатируется, что их авторы декларируют, а заявители имеют право, оспаривать точность и релевантность цитированных документов. Вполне понятно, что, хотя здесь сделаны ссылки на множество публикаций известного уровня техники, эти ссылки не означают признания того, что любой из этих документов образует собой часть общеизвестных сведений в данной отрасли.

Методы таксономической идентификации

[0045] Микроорганизмы часто можно различать путем прямого микроскопического исследования (ведь все клетки в образце выглядят под микроскопом по-разному), по характеристикам окрашивания, путем простого молекулярного анализа (например, просто путем определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и т.д. В дополнение к иллюстративным примерам таких методов таксономического анализа, описанных ниже, в Примерах 2-3, в таксономической идентификации того или иного микроорганизма может использоваться до нескольких различных уровней анализа, и каждый анали