Слитый белок, ингибирующий ангиогенез или рост сосудов, и его применение

Слитый белок, ингибирующий ангиогенез или рост сосудов, и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к области генетической инженерии. В частности, настоящая заявка относится к слитому белку, ингибирующему ангиогенез или рост сосудов.

Предшествующий уровень техники

При нормальном физиологическом состоянии ангиогенез представляет собой процесс, строго регулируемый несколькими факторами, и играет существенную роль в репарации и поддержании нормального функционирования тела. Однако быстрый рост кровяных сосудов внутри опухоли является распространенным клиническим явлением. На многих животных моделях и в клинических исследованиях продемонстрировано, что ингибирование ангиогенеза в опухоли может ингибировать рост опухоли и индуцировать смерть опухолевых клеток, так что достигается терапевтический эффект. Поэтому ингибирование ангиогенеза становится важным направлением развития противоопухолевых лекарственных средств. Макромолекула антиангиогенного лекарственного средства, такого как «Авастин» одобрена Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (США). Также существуют лекарственные средства, находящиеся на этапе доклинических и клинических исследований. Кроме того, новые антиангиогенные лекарственные средства также широко применяют при лечении заболеваний, связанных с ангиогенезом, таких как возрастная дегенерация макулы (ВДМ), диабетическая ретинопатия, что приводит к существенному терапевтическому эффекту.

Ангиогенез представляет собой комплексный процесс, регулируемый многими активными биологическими факторами. Ключевым процессом ангиогенеза является связывание и активация поверхностного рецептора эндотелиальных клеток различными факторами роста, контролирующими активность эндотелиальной клетки посредством внутриклеточного сигналинга с фосфорилированием тирозина и улучшающими ангиогенез. Среди данных ростовых факторов фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) является наиболее важным фактором, вовлеченным в контроль ангиогенеза. ФРЭС является наиболее сильным и наиболее специфичным фактором в отношении индукции и улучшения ангиогенеза. Он экспрессируется на повышенном уровне почти во всех опухолях человека и таким образом становится важной молекулярной мишенью в развитии противоопухолевой терапии. ФРЭС имеет много рецепторов на поверхности клеток эндотелия сосудов, включая VEGFR-1 (также называемый Flt-1) и VEGFR-2 (также называемый KDR или Flk-1). VEGFR-1 и VEGFR-2 оба содержат внеклеточную часть, состоящую из 7 иммуноглобулино-подобных доменов (D1-D7) способных к связыванию ФРЭС, и внутриклеточную часть, содержащую группу тирозинкиназы. Когда рецептор активируется ФРЭС, происходит внутриклеточное фосфорилирование гена тирозинкиназы, которое приводит к сигнальному каскаду, и в конечном итоге к ангиогенезу. Из-за важности ФРЭС-сигналинга для ангиогенеза, блокирование ФРЭС или рецептора ФРЭС с целью ингибирования ангиогенеза оказывает важный противоопухолевый эффект, а также является существенным для лечения других заболеваний, связанных с ангиогенезом, таких как васкулопатия сетчатки.

Стабильность слитых белковых агентов оказывает важное влияние на их биотехнические применения, и также является значимой для улучшения качества лекарственного средства и реализации промышленной продукции. Пространственная структура белка изменяется при определенных физических и химических условиях, которые в свою очередь приводят к изменению физических или химических свойств или утрате биологической активности. Это называется денатурацией белка, которую применяют для описания процесса изменения белка, его внутримолекулярной структуры и свойств, когда он подвергается воздействию физических или химических факторов. Детекция термостабильности белка может быть применена для определения эффективности денатурации и таким образом может быть применена в качестве теста на стабильность белка в процессе разработки терапевтических белков. Детекцию термостабильности в основном выполняют при помощи облучения образца белка УФ-светом так, что образец белка испускает флуоресценцию, и определения температуры денатурации (Tm) образца белка посредством измерения длины волны и интенсивности света испускаемой флуоресценции, что отражает изменения в структуре белка. Также агрегацию белка детектируют посредством возбуждения в УФ-области спектра при помощи статического светорассеивания. Интенсивность света образца белка существенно изменена при агрегированном и неагрегированном состояниях. Начальная температура агрегации (Tagg) образца белка может быть точно определена в соответствии с изменением интенсивности света. Стабильность белка отражается температурой денатурации (Tm) и начальной температурой агрегации (Tagg) белка.

Строгие условия развития макромолекулярных лекарственных средств включают терапевтический эффект, стабильность, и возможность промышленного производства терапевтического агента. Необходимо обнаружить лекарственное средство, ингибирующее ангиогенез или рост сосудов, с определенным терапевтическим эффектом и высокой стабильностью.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предложить слитый белок для ингибирования ангиогенеза или роста сосудов с определенным терапевтическим эффектом и высокой стабильностью, где слитый белок ингибирует ангиогенез или рост сосудов посредством блокирования ФРЭС-сигналинга.

Для достижения вышеупомянутой цели предложены следующие технические решения.

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает слитый белок для ингибирования ангиогенеза и роста сосудов, состоящий из фрагмента рецептора ФРЭС человека и связанного с ним Fc-фрагмента иммуноглобулина человека, где аминокислотная последовательность фрагмента рецептора ФРЭС приведена в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5.

В одном воплощении Fc-фрагмент иммуноглобулина человека слитого белка выбран из группы, состоящей из следующих последовательностей: IgG1 Fc (аминокислотной последовательностью которой является SEQ ID NO: 7), IgG2 Fc (аминокислотной последовательностью которой является SEQ ID NO: 8), IgG3 Fc (аминокислотной последовательностью которой является SEQ ID NO: 9), и IgG4 Fc (аминокислотной последовательностью которой является SEQ ID NO: 10).

В дальнейшем воплощении слитый белок представляет собой,

KH02, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 14;

KH03, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 16; или

KH04, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 18.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой:

kh02, кодирующую слитый белок KH02, нуклеотидная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 13;

kh03, кодирующую слитый белок KH03, нуклеотидная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 15; или

kh04, кодирующую слитый белок KH04, нуклеотидная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 17.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает экспрессионный вектор или хозяйскую клетку, экспрессирующую слитый белок, где экспрессионный вектор содержит вышеупомянутую нуклеотидную последовательность слитого белка. Экспрессионный вектор может представлять собой рекомбинантный эукариотический экспрессионный вектор, предпочтительно экспрессионный вектор для клеток млекопитающих. Экспрессионный вектор также может представлять собой рекомбинантный вирусный экспрессионный вектор, предпочтительно вектор на основе адено-ассоциированного вируса или аденовируса. Экспрессионный вектор способен к репликации и экспрессии в трансформированной хозяйской клетке. Предпочтительно хозяйская клетка представляет собой клетку линии CHO или ее сублинии, или клетку линии 293 или ее сублинии.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения слитого белка, предусматривающий введение вышеупомянутого экспрессионного вектора в приемлемую хозяйскую клетку и экспрессию слитого белка.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую слитый белок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, обычно применяемый в области техники. Предпочтительно дозированной лекарственной формой препарата фармацевтической композиции является инъекция, лиофилизированный порошок для инъекции или офтальмологический гель. Препарат может быть получен способами, известными в области техники.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает применение вышеупомянутого слитого белка для получения лекарственного препарата для лечения заболеваний, вызванных ангиогенезом или ростом сосудов, где заболевание, вызванное ангиогенезом или ростом сосудов, предпочтительно является опухолью или заболеванием, вызванным ангиогенезом в глазу, где заболевание, вызванное ангиогенезом в глазу, предпочтительно является возрастной дегенерацией макулы, диабетической ретинопатией, хориоретинопатией и т.д.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ лечения заболевания, вызванного ангиогенезом или ростом сосудов, предусматривающий введение слитого белка или фармацевтической композиции по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в этом, где заболевание, вызванное ангиогенезом или ростом сосудов предпочтительно является опухолью или заболеванием, вызванным ангиогенезом в глазу, где заболевание, вызванное ангиогенезом в глазу предпочтительно является возрастной дегенерацией макулы, диабетической ретинопатией, хориоретинопатией и т.д.

Слитый белок по настоящему изобретению обладает высокой термостабильностью, и поэтому образование белковых агрегатов в течение ферментации существенно снижено, и чистота и выход белка существенно улучшены. Также настоящий слитый белок обладает хорошими биологическими активностями.

Описание графических материалов

Фигура 1 представляет собой график, демонстрирующий тенденцию к термической денатурации слитого белка рецептора ФРЭС. Кривая на графике отражает повышение внутреннего пика флуоресценции белка вместе с повышением температуры. Ордината BCM (нм) демонстрирует внутренний флуоресцентный пик, в то время как ось абсцисс показывает температуру.

Фигура 2 представляет собой график, демонстрирующий тенденцию к термической агрегации слитого белка рецептора ФРЭС. Кривая на графике отражает изменение интенсивности статического светорассеяния вместе с повышением температуры. Ордината SLS при 266 нм показывает интенсивность светорассеяния, в то время как ось абсцисс показывает температуру.

Фигура 3 представляет собой график, демонстрирующий ингибирование ФРЭС-индуцированной пролиферации клеток HUVEC посредством слитого белка рецептора ФРЭС. Ордината показывает концентрацию слитого белка, в то время как абсцисса – адсорбцию, отражающую клеточную гибель, тестируемую посредством способа CCK-8.

Фигура 4 представляет собой график, демонстрирующий ингибирование ФРЭС-индуцированной миграции клеток HUVEC посредством слитого белка рецептора ФРЭС. Ось абсцисс показывает молярное отношение слитого белка к ФРЭС, в то время как ось ординат показывает общую миграцию % (общая миграция %=(Fслитый белок-Fбазальный)/(Fобщий-Fбазальный), Fбазальный представляет собой среднее значение флуоресценции группы культуральной среды, Fобщий представляет собой среднее значение флуоресценции группы ФРЭС, Fслитый белок представляет собой среднее значение флуоресценции группы с различными молярными соотношениями).

Примеры

Настоящее изобретение в дальнейшем будет описано при помощи следующих примеров. Следует понимать, что данные примеры приведены только в качестве иллюстрации настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничено данными примерами. Любая модификация может быть сделана специалистом в области техники в свете настоящего раскрытия в пределах рассматриваемой формулы изобретения.

Описание последовательностей

Фрагмент 1 рецептора ФРЭС человека: аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 1, нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 2;

Фрагмент 2 рецептора ФРЭС человека: аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 3, нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 4;

Фрагмент 3 рецептора ФРЭ человека: аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 5, нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 6;

Слитый белок KH01: аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 12, нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 11;

Слитый белок KH02: аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 14, нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 13;

Слитый белок KH03: аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 16, нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 15;

Слитый белок KH04: аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 18, нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 17;

Слитый белок KH05: аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 20, нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 19.

Пример 1: Получение слитых белков

Материалы или реагенты

ПЦР-набор (содержащий 5× буфер, dNTP и фермент Phusion): M0530L, NEB Corp.

Электрофорез в агарозном геле: IQ300, GE Corp.

Буфер 4(lot no. :0101201): NEB Corp.

AvrII: R0174L, NEB Corp.

BstZ17I: R0594L, NEB Corp.

Набор для очистки ПЦР-продукта: QIAGEN Corp., CAT: 28106

10×T4 буфер: B0202S, NEB Corp.

T4 ДНК-лигаза: M0202L, NEB Corp.

Top10 E. coli: CB104, TIANGEN Corp.

2YT(KAN) среда для культивирования на чашках Петри: Shanghai Rui Cong Laboratory Equipment Co., Ltd.

Набор Freedom™ CHO-S™: A13696-01, LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION.

Clone Pix FL: Genetix Corp.

Колонка для аффинной хроматографии, заполненная агарозой и белком А HiTrap: HiTrap protein A HP, 5 x 1 мл; GE Corp.

PBS (фосфатно-солевой буфер: 20 мМ фосфат, pH 7,4): SD117-500 мл, Shanghai Biotech Co., Ltd.

Детектор биомолекулярных взаимодействий ForteBio: Octet QKe, Pall Corp.

Анализатор термостабильности белка: Optim2, Avacta Corp.

ФРЭС: R&D Systems Inc.

NHS-LCLC-биотин: Thermo Corp.

1. Построение плазмиды, содержащей последовательности, кодирующие слитый белок.

1.1 Синтез генов и праймеров

Синтетические фрагменты 1 (SEQ ID NO: 21) и 2 (SEQ ID NO: 22) и праймеры P1-P10 (последовательности приведены в SEQ ID NO: 23-32) синтезированы Beijing GENEWIZ, Inc. Синтетические фрагменты 1 и 2 рекомбинировали в плазмидный вектор pUC19 (Beijing GENEWIZ, Inc.). Синтетический фрагмент 1 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент рецептора ФРЭС человека и сигнальную пептидную последовательность, синтетический фрагмент 2 содержит кодирующую последовательность для IgG1 Fc человека. Кодирующие последовательности настоящих слитых белков сконструированы при помощи ПЦР с применением нижеприведенных праймеров и синтетических фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы для построения соответствующих слитых белков.

1.2 Получение кодирующих последовательностей для слитых белков

Кодирующую последовательность для каждого слитого белка амплифицируют по две части, где первая часть представляет собой фрагмент рецептора ФРЭС; и вторая часть представляет собой Fc-фрагмент IgG1. Соответствующий мишенный фрагмент для каждой части получают при помощи специфичных праймеров, и затем фрагмент рецептора ФРЭС человека и Fc-фрагмент IgG1 человека связывают при помощи ПЦР с перекрывающимися праймерами с образованием конечной полной последовательности гена. Реакционная смесь для ПЦР обеих первой и второй частей была следующая (общий объем 50 мкл): 10 мкл 5×буфер, 2 мкл dNTP, 1 мкл каждого из специфичных прямого и обратного праймеров, 1 мкл матрицы (вышеупомянутый синтетический фрагмент 1 или 2) и 0,5 мкл фермента Phusion (высокоточный фермент для ПЦР) доводили до 50 мкл бидистиллированной водой. Условия реакции были следующими: начальная денатурация при 98°C в течение 30 сек, затем 10 циклов 98°C в течение 10 сек и 68°C в течение 2 мин, затем 30 циклов 98°C в течение 10 сек, 55°C в течение 30 сек, и 72°C в течение 50 сек, и в конце 72°C в течение 5 мин. В частности, для kh02, праймерами для первой части были P1 и P6, матрица представляла собой синтетический фрагмент 1; праймерами для второй части были P5 и P2, матрица представляла собой синтетический фрагмент 2. Для kh03, праймерами для первой части были P1 и P8, матрица представляла собой синтетический фрагмент 1; праймерами для второй части были P7 и P2, матрица представляла собой синтетический фрагмент 2. Для kh04, праймерами для первой части были P1 и P10, матрица представляла собой синтетический фрагмент 1; праймерами для второй части были P9 и P2, матрица представляла собой синтетический фрагмент 2. Для кодирующей последовательности белка KH01 (kh01), праймерами для первой части были P1 и P4, матрица представляла собой синтетический фрагмент 1; праймерами для второй части были P3 и P2, матрица представляла собой синтетический фрагмент 2. Продукты генов детектировали при помощи электрофореза в агарозном геле. Всего получали 8 фрагментов, т.е. kh01-Q, kh01-H, kh02-Q, kh02-H, kh03-Q, kh03-H, kh04-Q и kh04-H. Реакционная смесь для ПЦР с перекрывающимися праймерами была следующая (общий объем 50 мкл): 10 мкл 5× буфера, 2 мкл dNTP, 1 мкл вышеупомянутого амплифицированного первого и второго фрагмента в качестве матрицы соответственно (например, для амплификации полной длины kh01 применяли 1 мкл kh01-Q ПЦР-продукта и 1 мкл kh01-H ПЦР-продукта), 1 мкл прямого и обратного праймеров (P1, P2) соответственно и 0,5 мкл фермента Phusion (высокоточный фермент для ПЦР) доводили до 50 мкл бидистиллированной водой. Условия реакции были следующими: начальная денатурация при 98°C в течение 30 сек, затем 30 циклов 98°C в течение 10 сек, 55°C в течение 30 сек, и 72°C в течение 50 сек, и в конце 72°C в течение 5 мин. Продукты генов анализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (IQ300, GE). Всего получали 4 фрагмента гена, а именно kh01-1 (соответствующий SEQ ID NO: 11, но с дополнительно последовательностью, кодирующей сигнальный пептид), kh02-1 (соответствующий SEQ ID NO: 13, но с дополнительной последовательностью кодирующей сигнальный пептид), kh03-1 (соответствующий SEQ ID NO: 15, но с дополнительной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид), и kh04-1 (соответствующий SEQ ID NO: 17, но с дополнительной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид). По результатам электрофореза амплифицированные фрагменты имели ожидаемый размер.

1.3 Ферментативное расщепление векторов и фрагментов гена

Плазмиду pCHO1.0 (от Life Technologies, каталожный №A13696-01), kh01-1, kh02-1, kh03-1 и kh04-1 подвергали двойному ферментативному расщеплению соответственно. Система для ферментативного расщепления была следующей: 40 мкл плазмиды pCHO1.0 и амплифицированного фрагмента kh01-1, kh02-1, kh03-1 или kh04-1, 10 мкл 10× буфера 4 (NEB), 5 мкл AvrII (R0174L, NEB) и BstZ17I (R0594L, NEB) каждой, и 45 мкл стерильной воды добавляли в 1,5 мл пробирки EP и смесь инкубировали при 37°C в течение 5 ч после равномерного перемешивания. Продукт получали при помощи кита для очистки ПЦР-продукта (CAT: 28106, QIAGEN).

1.4 Лигирование и трансформация рекомбинантной плазмиды

Полученный фрагмент pCHO1.0 (фрагмент большего размера, полученный за счет расщепления AvrII и BstZ17I, около 13 т.п.н.) и восстановленный фрагмент kh01-1, kh02-1, kh03-1 или kh04-1 (расщепленный AvrII и BstZ17I), полученные в результате расщепления этими же ферментами, лигировали вместе в присутствии Т4 ДНК-лигазы. Реакционная система для данной реакции была следующей. 2 мкл фрагмента pCHO1.0 (расщепленного AvrII и BstZ17I), 6 мкл фрагмента kh01-1, kh02-1, kh03-1 или kh04-1 (расщепленного AvrII и BstZ17I), 1 мкл 10× T4 буфера (B0202S, NEB), и 1 мкл T4 ДНК-лигазы (M0202L, NEB) добавляли в 1,5 мл пробирку EP, смесь равномерно перемешивали, и затем инкубировали при комнатной температуре (около 20°C) в течение 4 ч. Продукт лигирования трансформировали в компетентные клетки E. coli Top 10 (CB104, TIANGEN), и клетки высевали на 2YT(KAN) чашки Петри (Shanghai Ruicong Laboratory Equipment Co., Ltd), которые инкубировали в течение ночи при 37°C. Чашки идентифицировали как kh01, kh02, kh03 и kh04.

1.5 ПЦР-скрининг колоний с рекомбинантными плазмидами

Единичные рекомбинантные колонии откалывали с чашек kh01, kh02, kh03, и kh04 и инкубировали при 37°C в течение 3-5 ч. После инкубации, данные колонии использовали в качестве матриц для ПЦР-скрининга. Реакционная система для ПЦР-амплификации (общий объем 20 мкл) представляла собой следующее: 10 мкл 2×Taq HS (R013A, TAKATA), 2 мкл суспензии бактерий в качестве матрицы, и 1 мкл прямого и обратного праймера (P1 и P2, конечная концентрация каждого 0,3 мкмоль/л), доводили до 20 мкл бидистилированной водой. Условия реакции: 94°C в течение 3 мин, затем 30 циклов 94°C в течение 60 сек, 53°C в течение 60 сек, и 72°C в течение 120 сек, и в конце 72°C в течение 5 мин. В результате целевой бенд размером около 1,6 т.п.н. был амплифицирован со всех колоний, подтверждая, что данные колонии все являются позитивными клонами.

1.6 Идентификация рекомбинантной плазмиды при помощи ферментативного расщепления

Колонии, идентифицированные как положительные посредством ПЦР с колоний, инокулировали с последующим выделением плазмиды и идентификацией при помощи ферментативного расщепления. Во-первых, плазмиды выделяли из рекомбинантных бактерий и затем анализировали ферментативным расщеплением. Система для ферментативного расщепления была следующей. 2 мкл плазмиды, 1 мкл 10× буфера 4, 1 мкл AvrII и 1 мкл BstZ17I добавляли в 1,5 мл пробирку EP, и стерильной водой доводили общий объем до 10 мкл, и затем смесь равномерно перемешивали и оставляли реагировать при 37^oC в течение 4 ч. Электрофорез в агарозном геле подтверждал, что бенд около 1,6 т.п.н. после ферментативного расщепления был получен со всех колоний, подтверждая, что отколотые клоны все были позитивными клонами.

1.7 Идентификация рекомбинантной плазмиды при помощи секвенирования

Колонии, идентифицированные при помощи ПЦР с колоний и ферментативного расщепления в качестве позитивных, секвенировали (Suzhou GENEWIZ biotech Co. Ltd.). Результаты секвенирования соответствовали ожидаемым. Данные экспрессионные плазмиды хранили для дальнейшего применения. Клоны с положительными результатами секвенирования были пронумерованы следующим образом: kh01-1 как 610, kh02-1 как 711, kh03-1 как 812, kh04-1 как 915.

2. Трансфекция плазмиды и скрининг клеток

Трансфекцию проводили с применением хозяйских клеток CHO-S в ките Freedom™ CHO-S™ (A13696-01, LIFE TECHNOLOGIES) согласно производителю. Четыре плазмиды трансфецировали в данном эксперименте: 610, 915, 812 и 711. Клетки, трансфецированные плазмидами, культивировали во встряхиваемой колбе. Культивирование проводили в CD FortiCHO (from Life Technologies) в качестве среды для культивирования при 37°C, 8% CO₂ и 110 об/мин в течение 48 ч. Жизнеспособность и число клеток детектировали при помощи счетчика клеток.

Спустя 48 часов после трансфекции, двухфазную схему селекции проводили: 10P/100M, 20P/200M (P=10 мкг/мл пуромицина, M=нМ метотрексата (MTX)); 30P/500M, 50P/1000M, с CD-FortiCHO, применяемой в качестве среды для культивирования. Клетки, полученные после скрининга, представляли собой 610, 915, 812 и 711 (т.е. содержащие вышеупомянутую соответствующую плазмиду). Скрининг единичных клонов выполняли при плотности засева 500 живых клеток/мл, и спустя 48 часов после трансфекции, каждый клеточный пул засевали в 8 шестилуночных планшет и инкубировали в течение 1 недели в инкубаторе. Рост клеточного клона в каждой плашке наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Единичный клон откалывали при помощи Clone Pix FL (Genetix). Экспрессию белка и чистоту детектировали с целью выбора клона для более масштабного культивирования.

3. Экспрессия, очистка и идентификация белков

Клоны клеток с высоким выходом откалывали для более масштабного культивирования с 96-луночного планшета на 24-луночный планшет, затем в 6-луночный планшет и затем в 50 мл встряхиваемую колбу.

Надосадок клеточной культуры, инкубированный в течение 4-6 дней, собирали и центрифугировали для удаления клеточного осадка. Собранный надосадок фильтровали через 0,45 мкм фильтра. pH подводили до 7,4. Слитые белки очищали при помощи колонки для аффинной хроматографии с белком А HiTrap (HiTrap protein A HP, 5 x 1 мл; GE). Колонку промывали 5х деионизированной водой, и балансировали 5× буфером PBS (20 мМ фосфат, pH 7,4) (SD117-500ml, Shanghai Biotech Co., Ltd). Колонку нагружали образцами, и элюат собирали для детекции. Колонку промывали количеством буфера PBS (0,02 моль/л фосфат, pH 7,4), равным 10 объемам колонки, для удаления нецелевого белка, и целевой белок элюировали с колонки при помощи 0,1 М глицинового буфера (pH 3). Чистоты белков все детектировали как свыше 90% посредством SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле).

Пример 2. Анализ чистоты и выхода белка

Чистоту белков в ферментативном бульоне определяли посредством эксклюзионной ВЭЖХ. Также экспрессию каждого белка, полученного в примере 1, детектировали посредством детектора биомолекулярных взаимодействий ForteBio (Octet QKe, Pall). Результаты приведены в таблице 1. Можно увидеть, что уровни экспрессии и чистоты слитых белков KH02-KH04 лучше, чем таковые белка KH01. Среди данных белков, слитый белок KH02 является лучшим в отношении чистоты и уровня экспрессии. Чистота данного белка все еще остается свыше 80% на 9 день инкубации с добавлением питательных веществ.

Таблица 1: Сравнение чистоты надосадка клеточной культуры белков

Надосадок культуры	Чистота (%)	Уровень экспрессии(мг/л)
день 7	день 9	день 7	день 9
KH01	53,5	40,1	173,54	305,27
KH02	84,3	83,5	381,85	578,15
KH03	55,5	42,8	201,3	300,85
KH04	61,5	47,7	136,55	342,10

Пример 3. Определение термостабильности слитого белка рецептора ФРЭС

(1) Определение тенденции к термической денатурации слитого белка рецептора ФРЭС

Пространственная конформация белка будет развернутой в случае, когда белок подвергнется тепловой обработке. Гидрофобные аминокислотные остатки (такие как триптофан, тирозин и фенилаланин), содержащие ароматическую группу, будут доступны. Степень развернутости белка может быть отражена посредством интенсивности флуоресценции (ИФ) внутри ароматических групп. В течение развертывания белка спектр флуоресценции внутренних флуорофоров будет изменяться. Белок с естественной структурой (нормально свернутый) обладает более низкой интенсивностью внутренней флуоресценции и пиком в районе 330 нм. Для сравнения, денатурированный белок обладает значительно повышенной интенсивностью внутренней флуоресценции, и пик будет смещен к около 350 нм. Половина температуры термической денатурации Tm может быть вычислена посредством анализа изменения интенсивности внутренней флуоресценции и смещения пика белка, и непосредственно отражает тенденцию к термической денатурации.

Тенденцию к термической денатурации слитого белка рецептора ФРЭС определяли при помощи анализатора термостабильности белка (Optim2, Avacta). Около 15 мкл каждого анализируемого образца (1 мг/мл PBS, pH7,2, чистота свыше 90%) добавляли в реакционную пробирку Optim2. Диапазон температуры сканирования составил 25°C-95°C. Образцы инкубировали при каждой температуре в течение 60 сек. Данные обрабатывали при помощи программного обеспечения Optim2. Результаты приведены на Фигуре 1 и Таблице 2. Показано, что среди рекомбинантных белков, экспрессируемых в примере 1, KH02 обладает наиболее высокой температурой денатурации, что свидетельствует о наиболее низкой тенденции к термической денатурации. Говоря другими словами, KH02 обладает наиболее высокой термостабильностью.

Таблица 2: Параметры термической денатурации слитого белка рецептора ФРЭС

Образцы	Температура денатурации 1	Температура денатурации 2	Температура денатурации 3
KH01	43,9°C	61,2°C	71,2°C
KH02	48,0°C	63,7°C	77,6°C
KH03	/	63,4°C	76,7°C
KH04	/	63,3°C	77,1°C

(2) Анализ тенденции к термической агрегации слитого белка рецептора ФРЭС

Светорассеяние будет происходить, когда белок подвергается УФ-свету. В определенном диапазоне интенсивность статического светорассеяния линейно связана с размером белка (10-600 кДа). Определение интенсивности статического светорассеяния (SCS) может показать изменения в размерах белка. Тенденция к агрегации белка может непосредственно быть отражена посредством вычисления начальной температуры агрегации (Tagg) белка.

Тенденцию к термической агрегации слитого белка рецептора ФРЭС определяли посредством анализатора термической стабильности белка (Optim2, Avacta). Приблизительно 15 мкл каждого анализируемого образца (1 мг/мл PBS, pH7,2 чистота свыше 90%) добавляли в реакционную пробирку Optim2. Диапазон температурного сканирования составил 25°C-95°C. Образцы инкубировали при каждой температуре в течение 60 сек. Данные обрабатывали при помощи аналитического программного обеспечения Optim2. Результаты приведены на Фигуре 2 и в Таблице 3. Показано, что интенсивность статического светорассеяния повышается совместно с увеличением температуры, и среди рекомбинантных белков KH02 обладает наиболее высокой начальной температурой агрегации (Tagg), что свидетельствует о наиболее низкой способности к термической агрегации.

Таблица 3: Тенденция к термической агрегации слитого белка рецептора ФРЭС

Образец	Tagg
KH01	65,6°C
KH02	71,8°C
KH03	69,8°C
KH04	68,8°C

Пример 4. Определение биологических активностей слитого белка рецептора ФРЭС

(1) Пролиферация клеток HUVEC

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC, ScienCell), которые хорошо росли, засевали в 96-луночный планшет при 3×10³ клеток/лунку и 100 мкл/лунку при 37°C, 5% CO₂ в течение 20 часов. Среду ECM (Среда для эндотелиальных клеток, каталожный № 1001, Sciencell), содержащую 2% фетальной бычьей сыворотки, применяли для получения слитого белка рецептора ФРЭС с различными молярными концентрациями (0,0023, 0,007, 0,023, 0,065, 0,19, 0,57, 1,7, 5, 15, 45, 135 нМ), который затем равномерно смешивали с 40 нг/мл ФРЭС (R&D SYSTEMS) и инкубировали в течение 2 ч. Затем 100 мкл смеси добавляли к клеткам HUVEC в 96-луночном планшете в трипликатах. Планшеты непрерывно инкубировали с 5% CO₂ в течение 96 часов. В конце инкубации добавляли CCK8 (Dojindo). Ингибирующий эффект слитого белка рецептора ФРЭС отражен в виде EC₅₀. Результаты приведены на Фигуре 3 и в Таблице 4. Слитые белки рецептора ФРЭС все могут эффективно ингибировать пролиферацию клеток HUVEC, стимулированных ФРЭС, что свидетельствует о том, что настоящие слитые белки рецептора ФРЭС обладают хорошей биологической активностью в отношении ингибирования ФРЭС.

Таблица 4: Слитые белки рецептора ФРЭС ингибируют пролиферацию клеток HUVEC, стимулированную ФРЭС

Образец	EC50 (нМ)
KH01	1,93
KH02	1,26
KH03	2,11
KH04	1,43

(2) Миграция клеток HUVEC

Влияние настоящего слитого белка на миграцию клеток HUVEC изучали посредством применения модифицированной камеры Бойдена (FluoroBlokTM Biocoat angiogenesis system: Endothelial cell migration, BD). Клетки HUVEC, которые хорошо росли, засевали в верхний компартмент камеры Бойдена при 3×10⁵ клеток/мл и 75 мкл/лунку. Основную среду ECM (каталожный номер 1001, Sciencell), содержащую 2% фетальную бычью сыворотку, применяли для приготовления слитого белка рецептора ФРЭС с различными молярными концентрациями (13333 нМ, 4444 нМ 1481 нМ, 494 нМ, 164,5 нМ, 54,8 нМ, 18,3 нМ, 6,1 нМ), который затем равномерно перемешивали с 500 пкМ ФРЭС (R&D SYSTEMS), инкубировали в течение 2 ч, и затем добавляли в нижний компартмент камеры Бойдена при 225 мкл/лунку. Всю камеру инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 20-24 ч. Среду для культивирования из нижнего компартмента удаляли. Добавляли флуоресцентный краситель Calcein AM (Anaspec) с конечной концентрацией 5 мкг/мл, полученной при помощи буфера HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса). Камеру инкубировали при 37°C с 5% CO₂ в течение 90 минут в темноте, и затем величину флуоресценции детектировали при длине волны возбуждения 494 нм и длины волны детекции 517 нм на мультимодальном ридере. Вычисляли относительную миграцию клеток. Как показано на фигуре 4, слитые белки рецептора ФРЭС по настоящему изобретению были практически одинаковы по ингибированию миграции клеток HUVEC, индуцированной ФРЭС. Это подтверждает, что слитый белок KH02 по настоящему изобретению обладает лучшей биологической активностью в отношении ингибирования ФРЭС.

Пример 5. Изучение аффинности связывания между слитым белком рецептора ФРЭС и ФРЭС

Аффинность связывания между слитым белком рецептора ФРЭС человека и ФРЭС человека определяли на детекторе биомолекулярного взаимодействия ForteBio (Octet QKe, Pall) посредством биослойной интерферометрии (BLI). ФРЭС человека (каталожный № 293-VE-010, R&D SYSTEMS) и NHS-LCLC-биотин (каталожный № 21338, Thermo) равномерно смешивали в молярном соотношении 1:3 и выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем оставшийся NHS-LCLC-биотин удаляли, получая 50 мкг/мл конечного меченного продукта биотин-чФРЭС (ФРЭС человека, меченный биотином). 50 мкг/л биотин-чФРЭС помещали на стрептавидиновый сенсор. Образцы, подлежащие тестированию, получали в различных концентрациях (600 нМ, 200 нМ, 66,7 нМ, 22,2 нМ, 7,4 нМ, 2.46 нМ, 0,82 нМ соответственно) при помощи буфера для разбавления образцов (PBS, 0,1% БСА, 0,02% Tween-20, 0,003% NaN₃). Буфер для разбавления образцов применяли в качестве контроля. Параметры кинетик связывания между чФРЭС и слитым белком рецептора детектировали кинетическим методом анализа. Результаты приведены в таблице 5. Показано, что слитые белки рецептора ФРЭС, экспрессированные в примере 1, все в значительной степени связывали ФРЭС человека. Среди данных белков значение KD KH02 составило приблизительно 0,33 нМ. В частности, скорость динамической диссоциации комплекса KH02 с ФРЭС была ниже, чем таковая других слитых белков, что свидетельствует о более высокой аффинности связывания.

Таблица 5: Параметры аффинности связывания между слитым белком рецептора ФРЭС и ФРЭС человека

	KD (нМ)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
KH01	0,51±0,04	6,91±0,09×104	3,53±0,06×10-5
KH02	0,33±0,02	5,16±0,05×104	1,70±0,05×10