Новый класс генов устойчивости к глифосату

Новый класс генов устойчивости к глифосату

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по временной патентной заявке США с серийным номером № 61/593555, поданной 1 февраля 2012 года, и также по временной патентной заявке США с серийным номером № 61/625222, поданной 17 апреля 2012 года.

ПОЛОЖЕНИЕ В СООТВЕТСТВИИ С 37 C.F.R. § 1.821(c) или (e) - СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА ASCII

В соответствии с 37 C.F.R. § 1.821(c) или (e), файл, содержащий текстовую версию ASCII списка последовательностей, предоставлен совместно с настоящей заявкой.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к биотехнологии растений. Некоторые варианты осуществления относятся к новым полипептидам, вовлеченным в метаболизм N-(фосфонометил)глицина, нуклеиновым кислотам, кодирующим такие полипептиды, и к способам их идентификации. Конкретные варианты осуществления относятся к растениям, частям растений и клеткам растений, которые содержат указанные выше полипептиды и/или нуклеиновые кислоты.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Виды сорных растений давно являются проблемой на возделываемых полях. Хотя борьба с сорняками может быть трудоемкой работой, она упростилась благодаря доступности эффективных уничтожающих сорняки химических гербицидов. Повсеместное применение гербицидов, совместно с усовершенствованными сортами сельскохозяйственных растений и удобрениями для них, внесло значительный вклад в "зеленую революцию" в сельском хозяйстве. В частности, пригодными являются гербициды, которые обладают широким спектром гербицидной активности. К сожалению, гербициды широкого спектра, как правило, обладают вредоносным эффектом на сельскохозяйственные культуры, подвергнутые воздействию гербицида. Одним способом преодоления этой проблемы является получение сельскохозяйственных культур, устойчивых к гербициду широкого спектра.

Одним примером гербицида широкого спектра является N-фосфонометилглицин, также известный как глифосат. Глифосат широко используется фермерами по всему миру для борьбы с сорняками перед посевом культуры, например, при нулевой обработке почвы. Кроме того, глифосат является эффективным средством для борьбы с сорняками и самосевными растениями между циклами производства или чередованием культур. Глифосат не переносится в почву после применения, и он повсеместно считается одним из наиболее безопасных для окружающей среды и широкоэффективных химических гербицидов, доступных для применения в сельском хозяйстве.

Глифосат уничтожает растения путем ингибирования каскада шикимовой кислоты. Этот каскад приводит к биосинтезу ароматических соединений, включая аминокислоты, витамины и гормоны растений. Глифосат блокирует конденсацию фосфоенолпировиноградной кислоты (PEP) и 3-фосфошикимовой кислоты в 5-енолпирувил-3-фосфошикимовую кислоту путем связывания и ингибирования активности фермента 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, обычно обозначаемой как "EPSP-синтаза" и "EPSPS".

К сожалению, неизвестны сельскохозяйственные культуры, которые естественным образом устойчивы к глифосату, и, таким образом, применимость этого гербицида для борьбы с сорняками в сельскохозяйственных культурах ограничена. Одним из способов получения устойчивых к глифосату сельскохозяйственных культур является введение гена, кодирующего гетерологичную устойчивую к глифосату форму гена EPSPS, в культурное растение с использованием способов генной инженерии. С использованием химического мутагенеза были получены устойчивые к глифосату формы EPSPS в бактериях, и гетерологичные гены были введены в растения с получением устойчивых к глифосату растений. См., например, Comai et al. (1983) Science 221:370-71. Гетерологичные гены EPSPS можно сверхэкспрессировать в сельскохозяйственных культурах с получением желаемого уровня устойчивости.

EPSPS сворачивается в два сходных домена, каждый из которых содержит три копии элемента фолдинга βαβαββ (Stallings et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5046-50). Lys-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386 и Lys-411 являются консервативными остатками EPSPS из E. coli (Schonbrunn et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:1376-80). Консервативные остатки, важные для активности EPSPS, также включают Arg-100, Asp-242 и Asp-384 (Selvapandiyan et al. (1995) FEBS Letters 374:253-6). Arg-27 связывается с S3P (Shuttleworth et al. (1999) Biochemistry 38:296-302).

Были выделены варианты EPSPS дикого типа, которые являются устойчивыми к глифосату в результате изменений последовательности, кодирующей аминокислоты EPSPS (Kishore and Shah (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:627-63; Wang et al. (2003) J. Plant Res. 116:455-60; Eschenburg et al. (2002) Planta 216:129-35). He et al. (2001) Biochim et Biophysica Acta 1568:1-6) разработали ферменты EPSPS с увеличенной устойчивостью к глифосату путем мутагенеза и рекомбинации между генами EPSPS E. coli и Salmonella typhimurium, и предположили, что мутации в положении 42 (T42M) и в положении 230 (Q230K), вероятно, ответственны за наблюдаемую устойчивость. Последующая работа (He et al. (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67:1405-9) демонстрирует, что мутация T42M (треонин на метионин) является достаточной для повышения устойчивости ферментов как E. coli, так и S. typhimurium.

В настоящее время существует три основных класса EPSPS, которые известны в данной области: класс I (чувствительные к глифосату); класс II (международная публикация патента PCT № WO2006/012080 A2; Liang et al. (2009) J. Biotechnol. 144(4):330-6); и класс III (международная публикация патента PCT № WO2007/0082269 A2; публикация патента США № US 2010/0144530 A1).

Указанные выше примеры из уровня техники и ограничения, связанные с ними, являются иллюстративными, но не исключающими. Другие ограничения уровня техники станут понятными специалистам в данной области при прочтении описания.

ОПИСАНИЕ

В настоящем описании описан новый класс ферментов EPSPS, которые определяются консервативными мотивами аминокислотной последовательности (первичная структура) и вторичными и третичными структурными элементами. Эти новые ферменты EPSPS обозначают в настоящем описании как ферменты EPSPS "класса IV". В соответствии с некоторыми вариантами осуществления структуру этих ферментов можно изменять, как проиллюстрировано в настоящем описании, чтобы влиять на метаболизм глифосата в клетке или организме, гетерологично экспрессирующем фермент(ы), например, для обеспечения устойчивости к глифосату в клетке или организме. В конкретных вариантах осуществления консервативные структурные элементы ферментов EPSPS класса IV используют для идентификации дополнительных ферментов EPSPS, которые могут сообщать трансгенному организму (например, растению) устойчивость к глифосату.

Таким образом, некоторые варианты осуществления включают выделенный полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью по меньшей мере с одним EPSPS класса IV, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 67, 68, 69, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 и 168; и/или выделенный полипептид, содержащий SEQ ID NO:170-173.

Некоторые варианты осуществления включают нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью по меньшей мере с одним EPSPS класса IV, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 и 168; и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент EPSPS, содержащий SEQ ID NO:170-173. В некоторых примерах нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью по меньшей мере с одним EPSPS класса IV, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 и 168, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая фермент EPSPS, содержащий SEQ ID NO:170-173, содержит нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью (например, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере приблизительно 81%, по меньшей мере приблизительно 82%, по меньшей мере приблизительно 83%, по меньшей мере приблизительно 84%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно 99,5%, и по меньшей мере приблизительно 99,9% идентичностью) по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167 и 169.

Некоторые варианты осуществления включают растение, часть растения, орган растения, семя растения и/или клетку растения, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью по меньшей мере с одним EPSPS класса IV, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 и 168. Некоторые варианты осуществления включают растение, часть растения, орган растения, семя растения и/или клетку растения, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий SEQ ID NO:170-173.

В следующих вариантах осуществления изобретение относится к способам получения растения, части растения, органа растения, семени растения и/или клетки растения, устойчивых к глифосату, включающим: трансформацию растения, части растения, органа растения, семени растения и/или клетки растения нуклеиновой кислотой, кодирующей EPSPS класса IV; и экспрессию нуклеиновой кислоты так, чтобы получить EPSPS класса IV. Конкретные варианты осуществления включают устойчивые к глифосату растения и клетки растений, экспрессирующие гетерологичную EPSPS класса IV.

Некоторые варианты осуществления включают векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую EPSPS класса IV. Конкретные примеры включают векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент EPSPS, содержащий SEQ ID NO:170-173.

Дополнительные варианты осуществления включают способы борьбы с сорняками на поле или возделываемой посевной площади с устойчивыми к глифосату растениями, где такой способ может включать: посев растения или семени растения, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный EPSPS класса IV, на поле или возделываемую посевную площадь; и внесение на поле или возделываемую посевную площадь достаточного количества глифосата для борьбы с сорняками на поле без существенного влияния на растение.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится способным к регенерации клеткам для применения в тканевой культуре растений, устойчивых к глифосату. Такая тканевая культура может быть способна регенерировать растения, обладающие физиологическими и морфологическими характеристиками указанных выше устойчивых к глифосату растений, а также регенерировать растения, имеющие по существу тот же генотип, что и у устойчивых к глифосату растений. Способные к регенерации клетки в таких тканевых культурах могут представлять собой, например, эмбрионы, протопласты, клетки меристемы, каллюс, пыльцу, листья, пыльники, корни, корневые кончики, цветки, семена, стручки и стебли. Конкретные варианты осуществления относятся к растениям, способным регенерировать из тканевой культуры в соответствии с вышеуказанным.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к клеткам, которые не регенерируют с образованием растений, например, для применения для получения линий клеток растений, устойчивых к глифосату. В других вариантах осуществления изобретение относится к растениям, частично содержащим такие клетки.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению множества гербицидов к сельскохозяйственным культурам, посеянным на возделываемой посевной площади. Поверхностное внесение глифосата в дополнение к нескольким гербицидам обладает преимуществом, состоящим в различных гербицидных свойствах, так что обеспечивается борьба с сорняками с усовершенствованной комбинацией универсальности и экономичности. Например, отдельные гербициды могут иметь различный срок действия на возделываемой посевной площади; т.е. некоторые гербициды могут оставаться и быть эффективными в течение относительно длительного периода времени после их внесения на площадь, в то время как другие гербициды могут быстро разлагаться на другие и/или неактивные соединения. Усовершенствованная система использования гербицидов в соответствии с конкретными вариантами осуществления позволяет использовать глифосат и несколько гербицидов так, чтобы растениевод мог адаптировать выбор конкретных гербицидов для применения в конкретной ситуации.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам и композициям для получения и применения растения, которое является устойчивым более чем к одному гербициду или классу или подклассу гербицидов, как описано ниже. В конкретных вариантах осуществления предусматривается растение, которое является устойчивым как к глифосату, так и по меньшей мере к одному другому гербициду (или классу или подклассу гербицидов) или химическому реагенту (или классу или подклассу химических реагентов) (например, фунгициды, инсектициды, регуляторы роста растений и т.п.). Такие растения могут быть применимы, например, в способах, включающих обработку сельскохозяйственных культур несколькими гербицидами. Таким образом, изобретение относится к устойчивым к гербицидам растениям, которые выдерживают обработку гербицидом или комбинацией гербицидов (включая комбинацию гербицидов, каждый из которых действует посредством отличающегося механизма гербицидной активности) или которые выдерживают обработку комбинацией по меньшей мере одного гербицида и по меньшей мере одного другого химического реагента. Таким образом, в настоящем описании описаны усовершенствованные способы выращивания сельскохозяйственных культур, в которых осуществляется селективная борьба с сорняками.

Устойчивое к гербицидам растение в соответствии с некоторыми вариантами осуществления может включать молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует гетерологичный полипептид, который сообщает устойчивость к глифосату, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте (2,4-D). В соответствии с представленными выше абзацами, предусматриваются растения, которые содержат по меньшей мере третью молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, сообщающий растению признак, выбранный из группы, состоящей из признака устойчивости к гербицидам; признака устойчивости к насекомым; агрономического признака; признака устойчивости к заболеванию; признака модифицированной жирной кислоты; и признака сниженного содержания фитатов.

В некоторых примерах устойчивое к гербицидам растение содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к глифосату, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к глюфосинату. Некоторые примеры включают устойчивое к гербицидам растение, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, сообщающий растению признак, выбранный из группы, состоящей из признака устойчивости к гербицидам; признака устойчивости к насекомым; агрономического признака; признака устойчивости к заболеванию; признака модифицированной жирной кислоты; и признака сниженного содержания фитатов.

В конкретных примерах устойчивое к гербицидам растение содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к глифосату, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к гербициду, который ингибирует ацетолактатсинтазу (ALS) (Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241), также известный как фермент синтаза ацетогидроксикислот (AHAS) (Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449). Некоторые примеры включают устойчивое к гербицидам растение, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, сообщающий растению признак, выбранный из группы, состоящей из признака устойчивости к гербицидам; признака устойчивости к насекомым; агрономического признака; признака устойчивости к заболеванию; признака модифицированной жирной кислоты; и признака сниженного содержания фитатов.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту можно комбинировать (или "пакетировать") в растении с любой молекулой нуклеиновой кислоты, например, но не ограничиваясь этим, для обеспечения дополнительной устойчивости к глифосату или другому гербициду, для обеспечения устойчивости к отдельным насекомым или заболеваниям, для обеспечения улучшения питания, для обеспечения улучшенных агрономических характеристик и для обеспечения белка или другого продукта, пригодного в кормах, продуктах питания, в промышленных способах применения, фармацевтических способах применения и/или в других применениях. Примеры включают пакетирование двух или более представляющих интерес нуклеиновых кислот в геноме растения. Такое "пакетирование генов" можно осуществлять посредством общепринятого разведения растений с использованием двух или более трансгенных объектов, трансформации растения конструкцией, которая содержит представляющие интерес последовательности, повторной трансформации трансгенного растения или добавления новых признаков посредством направленного встраивания способом гомологичной рекомбинации. Конкретные примеры такого набора включают любую из следующих комбинаций: нуклеиновая кислота dgt-28; нуклеиновая кислота dgt-31; нуклеиновая кислота dgt-32; нуклеиновая кислота dgt-33; нуклеиновая кислота Cry34Ab1; нуклеиновая кислота Cry35Ab1; нуклеиновая кислота Cry1F; нуклеиновая кислота Cry1Ac; нуклеиновая кислота aad-12; нуклеиновая кислота aad-1; нуклеиновая кислота pat; и нуклеиновая кислота DSM-2.

В дополнение к иллюстративным аспектам и вариантам осуществления, описанным выше, дополнительные аспекты и варианты осуществления станут очевидными путем изучения представленного ниже описания.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

В списке последовательностей предоставлены аминокислотные последовательности для 17 иллюстративных белков EPSPS класса IV. В SEQ ID NO:1 представлена аминокислотная последовательность DGT-28.

В SEQ ID NO:67 представлена аминокислотная последовательность DGT-33.

В SEQ ID NO:68 представлена аминокислотная последовательность DGT-32.

В SEQ ID NO:145 представлена аминокислотная последовательность DGT-31.

В SEQ ID NO:146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 и 168 представлена аминокислотная последовательность иллюстративных белков EPSPS класса IV.

SEQ ID NO:147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167 и 169 включают иллюстративные нуклеиновые кислоты, которые кодируют EPSPS класса IV.

В SEQ ID NO:170 представлена консервативная аминокислотная последовательность, которая является характерной для белков EPSPS класса IV: TARXLF, где X представляет собой A или G.

В SEQ ID NO:171 представлена консервативная аминокислотная последовательность, которая является характерной для белков EPSPS класса IV: EGFXEG, где X представляет собой T или A.

В SEQ ID NO:172 представлена консервативная аминокислотная последовательность, которая является характерной для белков EPSPS класса IV: GATTARFLPX₁LX₂AA, где X₁ представляет собой T или A, и X₂ представляет собой A или V.

В SEQ ID NO:173 представлена консервативная аминокислотная последовательность, которая является характерной для белков EPSPS класса IV: FDAS.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ.1(a-g) включает множественное выравнивание последовательностей, сравнивающее три ранее описанных класса ферментов EPSPS (например, чувствительный к глифосату aroA) с иллюстративными ферментами EPSPS класса IV (например, DGT-28, DGT-31, DGT-32 и DGT-33) (SEQ ID NO:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 и 168). Консервативные мотивы показаны красным цветом под выравниванием.

ФИГ.2 включает выравнивание иллюстративных ферментов DGT (т.е. DGT-1, DGT-3 и DGT-7). Положение мутантного аминокислотного остатка, который был изменен с глицина на аланин, указано первой звездочкой. Положение второго мутантного аминокислотного остатка, который был изменен с треонина на изолейцин, указано второй звездочкой. Положение третьего мутантного аминокислотного остатка, который был изменен с пролина на серин, указано третьей звездочкой.

ФИГ.3-30 включают карты различных иллюстративных плазмид: pDAB107527 (ФИГ.3); pDAB105530 (ФИГ.4); pDAB105531 (ФИГ.5); pDAB105532 (ФИГ.6); pDAB105533 (ФИГ.7); pDAB105534 (ФИГ.8); pDAB4104 (ФИГ.9); pDAB102715 (ФИГ.10); pDAB107532 (ФИГ.11); pDAB107534 (ФИГ.12); pDAB102785 (ФИГ.13); pDAB100445 (ФИГ.14); pDAB102946 (ФИГ.15); pDAB100469 (ФИГ.16); pDAB102028 (ФИГ.17); pDAB102029 (ФИГ.18); pDAB102032 (ФИГ.19); pDAB102034 (ФИГ.20); pDAB100429 (ФИГ.21); pDAB100442 (ФИГ.22); pDAB100430 (ФИГ.23); pDAB102036 (ФИГ.24); pDAB102038 (ФИГ.25); pDAB102040 (ФИГ.26); pDAB102042 (ФИГ.27); pDAB107712 (ФИГ.28); pDAB107713 (ФИГ.29) и pDAB107714 (ФИГ.30).

ФИГ.31 включает величины IC₅₀, полученные после внесения различных мутаций в DGT-1 (A) и DGT-7 (B) с использованием 1 мМ PEP. Для кривых IC₅₀ как ФИГ.31(A), так и ФИГ.31(B), закрашенные треугольники соответствуют дикому типу, закрашенные круги соответствуют мутантам GA, незакрашенные квадраты соответствуют мутантам GAPS, и закрашенные квадраты соответствуют мутантам TIPS.

ФИГ.32-54 включают карты различных иллюстративных плазмид: pDAB102719 (ФИГ.32); pDAB102718 (ФИГ.33); pDAB107663 (ФИГ.34); pDAB107664 (ФИГ.35); pDAB107665 (ФИГ.36); pDAB107666 (ФИГ.37); pDAB109812 (ФИГ.38); pDAB101556 (ФИГ.39); pDAB107698 (ФИГ.40); pDAB108384 (ФИГ.41); pDAB108385 (ФИГ.42); pDAB108386 (ФИГ.43); pDAB108387 (ФИГ.44); pDAB102716 (ФИГ.45) и pDAB102717 (ФИГ.46).

ФИГ.55 включает ленточное представление общей структуры в модели высокого разрешения для синтазы SsvESPS. Два лиганда (S3P и глифосат) представлены в качестве ван-дер-ваальсовых сфер. Внутренняя спираль, которая содержит Ala-84, показана синим цветом.

ФИГ.56 включает крупный план активных центров ESPS-синтаз E. coli и S. sviceus, подчеркивающий отличия, которые определяют устойчивые ферменты класса IV. Следует отметить, что в SsvESPS-синтазе внутренняя спираль, которая содержит Ala-84 (первичная детерминанта устойчивости к гербициду), продвинута далее в связывающий глифосат карман, что препятствует связыванию этого лиганда.

СПОСОБ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор

В настоящем описании описаны новые полипептиды, вовлеченные в метаболизм N-(фосфонометил)глицина, и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды. В некоторых примерах такой полипептид сообщает (или увеличивает) устойчивость к глифосату в клетке растения, где полипептид гетерологично экспрессируется, например, без неблагоприятного влияния на связывание EPSP-синтазы с ее природным субстратом фосфоенолпируватом (PEP).

II. Термины

Чтобы дополнительно пояснить объем настоящего изобретения, предоставлены следующие конкретные определения, термины и сокращения.

Если конкретно не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в данной области. Если не очевидно из контекста, в котором находится термин, термин в форме единственного числа включает множественное число, и подразумевают, что термины во множественном числе включают единственное число. Таким образом, элемент или компонент в форме единственного числа является неограничивающим в отношении количества экземпляров (т.е. случаев) элемента или компонента. Когда в настоящем описании предусматриваются диапазоны числовых величин (например, "менее чем приблизительно X", "менее чем X" и "например, X₁… и X₂"), подразумевают, что диапазоны включают все величины и диапазоны величин, включенные в предоставленный диапазон, как если бы эти включенные величины и диапазоны были явно перечислены.

Как используют в рамках изобретения, термины "содержащий", "включающий," "имеющий" и "содержащий" и их варианты являются открытыми (т.е. неисключающими). Например, композиция или способ, которые включают перечень элементов, необязательно ограничиваются только этими элементами. Такая композиция или способ могут включать (или могут не включать) другие элементы, явно не указанные или не присущие композиции или способу. Кроме того, если явно не указано иное, "или" используют во включающем (а не исключающем) значении. Например, условие "A или B" удовлетворяется любым из следующих: A является истинным (или присутствует) и B является ложным (или отсутствует); A является ложным (или отсутствует) и B является истинным (или присутствует); и как A, так и B, являются истинными (или присутствуют).

Растение: как используют в рамках изобретения, термин "растение" включает целое растение и любого потомка, клетку, ткань или часть растения. Термин "части растений" включает любую часть(и) растения, включая, например, но не ограничиваясь этим: семена (включая зрелое семя и незрелое семя); черенок растения; клетку растения; культуру клеток растения; орган растения (например, пыльцу, эмбрионы, цветки, плоды, побеги, листья, корни, стебли и эксплантаты). Ткань растения или орган растения могут представлять собой семя, протопласт, каллюс или любую другую группу клеток растений, которые организованы в структурный или функциональный элемент. Клетка растения или культура тканей могут быть способны регенерировать растение, имеющее физиологические и морфологические характеристики растения, из которого были получены клетка или ткань, и регенерировать растение, имеющее по существу тот же генотип, что и у растения. В противоположность этому, некоторые клетки растений не способны регенерировать с образованием растений. Регенерируемые клетки в клетке растения или тканевой культуры могут представлять собой эмбрионы, протопласты, клетки меристемы, каллюс, пыльцу, листья, пыльники, корни, корневые кончики, столбики початка, цветки, зерна, колосья, початки, пленку зерна или цветоножки.

Части растений включают пожинаемые части и части, пригодные для размножения растений-потомков. Части растений, пригодные для размножения, включают, например, но не ограничиваясь ими: семя; плод; черенок; проросток; клубень и корневище. Пожинаемая часть растения может представлять собой любую часть растения, включая, например, но не ограничиваясь ими: цветок; пыльцу; проросток; клубень; лист; стебель; плод; семя и корень.

Клетка растения представляет собой структурный и физиологический элемент растения, содержащий протопласт и клеточную стенку. Клетка растения может быть в форме выделенной отдельной клетки или совокупности клеток (например, рыхлый каллюс и культивируемая клетка), и она может быть частью более высоко организованного элемента (например, ткань растения, орган растения и растение). Таким образом, клетка растения может представлять собой протопласт, продуцирующую гаметы клетку, или клетку или группу клеток, которые регенерируют в целое растение. По существу, в вариантах осуществления, описанных в настоящем описании, семя, которое содержит множество клеток растений и способно регенерировать в целое растение, считают "клеткой растения".

Резистентность/устойчивость к гербицидам: при указании на растения, которые являются резистентными или устойчивыми к глифосату, подразумевают, что применение некоторого количества глифосата к растению не оказывает значительного влияния или не уничтожает растение, где растение дикого типа того же вида значительно повреждалось и/или погибало бы при использовании этого количества глифосата. Растение может быть естественным образом устойчивым к конкретному гербициду или растению можно сообщать устойчивость к гербициду с помощью способов генной инженерии, например, таких как селекция; генетическая трансформация и/или внесение трансгена в геном растения. "Устойчивое к глифосату растение" относится к растению, содержащему полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, которые сообщают устойчивость к гербициду, когда их предоставляют гетерологичному растению или другому организму, экспрессирующему их (т.е. делают растение или другой организм устойчивыми к гербициду).

Растение, которое является резистентным или устойчивым к глифосату, может демонстрировать некоторый минимальный эффект от применения глифосата к растению. Например, может происходить изменение нормального роста и развития растения, где растение может проявлять признаки или симптомы, которые ассоциированы со стрессом или заболеванием. Такой минимальный эффект вследствие применения глифосата к растениям, которые являются резистентными или толерантными к глифосату, отличается от неблагоприятного эффекта, который является результатом применения глифосата к растениям, которые чувствительны к глифосату. Специалист в данной области может различить растения, которые являются устойчивыми к глифосату, и растения, которые являются чувствительными к глифосату. Применение глифосата к растениям, содержащим нуклеиновую кислоту, которая сообщает устойчивость к глифосату, приводит к значительно меньшему эффекту, чем применение того же количества глифосата к растению того же вида, которое не содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая сообщает устойчивость к глифосату.

Растение, которое является устойчивым к гербициду или другому химическому реагенту, демонстрирует увеличенную устойчивость по сравнению с соответствующим контрольным растением. Повреждение вследствие гербицида или другой химической обработки можно оценивать посредством оценки любого параметра роста или благополучия растения. Такие параметры известны специалистам в данной области и их выбор осуществляется, исходя из мнения квалифицированного специалиста. Повреждение растения можно оценивать путем визуального исследования и/или посредством статистического анализа одного или нескольких подходящих параметров роста или благополучия растения в индивидуальном растении или группе(ах) растений. Таким образом, повреждение можно оценивать путем оценки параметров, включающих, например, и не ограничивающихся ими: высоту растения; массу растения; цвет листьев; длину листьев; цветение; способность к размножению; выметывание пестичных столбиков; выход и продукцию семян. Повреждение также можно оценивать путем оценки времени, прошедшего до конкретной стадии развития (например, выметывание пестичных столбиков, цветение и сбрасывание пыльцы), или времени, пошедшего до тех пор, пока растение не восстановится после обработки конкретным химическим реагентом и/или гербицидом.

При проведении оценки повреждений, конкретным степеням повреждения можно приписывать величины так, чтобы можно было проводить статистический анализ или количественные сравнения. Использование диапазонов величин для описания конкретных степеней повреждения известно в данной области, и можно использовать любой походящий диапазон или шкалу. Например, можно присваивать показатели повреждения гербицидом (также называемые показателями устойчивости). Таким образом, на устойчивость к гербициду могут указывать другие оценки на этой шкале, где соответствующее контрольное растение (или группа контрольных растений) проявляет статистически более низкий показатель по шкале в ответ на обработку гербицидом, чем группа рассматриваемых растений.

Повреждение, вызываемое гербицидом или другим химическим реагентом, можно оценивать в различные моменты времени после обработки растения гербицидом. Часто, повреждение оценивают приблизительно в момент времени, когда контрольное растение проявляет максимальное повреждение. Иногда повреждение оценивают после периода времени, на протяжении которого контрольное растение, которое не было обработано гербицидом или другим химическим реагентом, выросло и/или развилось на поддающемся измерению уровне по сравнению с размером или стадией, при которых проводили обработку. Повреждение можно оценивать в любой из множества подходящих периодов времени, например, через 12 часов; через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и/или 14 суток; через 3 и/или 4 недели или более, после того, как рассматриваемое растение обработали гербицидом. Является пригодным любой момент времени оценки при условии, что он позволяет обнаружение различий в ответ на обработку исследуемого и контрольного растений.

Гербицид не вызывает "значительного повреждения" растения, либо когда он не имеет эффекта на растение, либо когда он имеет некоторый эффект на растение, после которого растение впоследствии восстанавливается, либо когда он имеет эффект на растение, который является вредоносным, но который уравновешивается, например, воздействием конкретного гербицида на сорняки. Таким образом, например, сельскохозяйственная культура может "не повреждаться значительно" гербицидом или другой обработкой, если растение проявляет менее чем приблизительно 25%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 9%, менее чем приблизительно 8%, менее чем приблизительно 7%, менее чем приблизительно 6%, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 4%, менее чем приблизительно 3%, менее чем приблизительно 2% или менее чем приблизительно 1% снижение по меньшей мере одного подходящего параметра, который указывает на здоровье и/или продуктивность растения, по сравнению с соответствующим контрольным растением (например, необработанное растение того же вида). В конкретных вариантах осуществления растение является устойчивым к гербициду или другому химическому реагенту, если оно демонстрирует повреждение по сравнению с соответствующим контрольным растением, которое является меньшим, чем повреждение, которое проявляет контрольное растение, по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% или 1000% или более. Сельскохозяйственная культура, на которую гербицид или другая обработка не оказывает значительного влияния, может проявлять снижение по меньшей мере одного параметра, однако это снижение является временным, и растение полностью восстанавливается в пределах, например, приблизительно 1 недели, приблизительно 2 недель, приблизительно 3 недель, приблизительно 4 недель или приблизительно 6 недель. В конкретных вариантах осуществления растение, которое является устойчивым к гербициду или другому химическому реагенту, может быть характеризовано тем, что применение гербицида или другого химического реагента не оказывает существенного влияния на растение.

Подходящие параметры, которые указывают на здоровье и/или продуктивность растения, включают, например, но не ограничиваясь ими: высоту растения; вес растения; длину листа; время, прошедшее до конкретной стадии развития; цветение; выход и продукцию семян. Оценку параметра можно проводить путем визуального исследования и/или посредством статистического анализа параметра. После оценки в рассматриваемом растении и контрольном растении, можно проводить сравнение так, чтобы определить, повреждается или не повреждается ли рассматриваемое растение гербицидом или другой обработкой

Соответствующие контрольные растения, которые можно использовать для определения устойчивости к гербициду (или другому химическому реагенту), включают растения того же вида, которые не содержат предполагаемую гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или полипептид, сообщающие устойчивость к гербициду, и растения, которые содержат предполагаемую гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или полипептид, сообщающие устойчивость к гербициду, но которые не обработаны гербицидом.

Гербицид: "гербицид" представляет собой химическое вещество, которое вызывает временное или постоянное повреждение растения. Неограничивающие примеры гербицидов приведены и более подробно рассмотрены в настоящем описании. Гербицид может включаться в растение или в его клетки, или он может действовать на растение или его клетки без включения. "Активный ингредиент" представляет собой химическое вещество в гербицидном составе, которое ответственно за фитотоксичность состава. Активные ингредиенты в коммерческих гербицидных составах, как правило, обозначают как активный ингредиент на товарной этикетке. Информация товарных этикеток доступна от U.S. Environmental Protection Agency, и она обновляется в сети Интернет на oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own. Информация товарных этикеток также доступна в сети Интернет на www.cdms.net.

При использовании в отношении гербицида, термин "эквивалент кислоты" относится к уровню или количеству относительно гербицидно активной исходной кислоты.

Выделенный: "выделенный" биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или полипептид) по существу отделен, продуцирован отдельно или очищен от других биолог