Способы лечения и предупреждения инфекций стафилококка золотистого и связанных с ними нарушений

Способы лечения и предупреждения инфекций стафилококка золотистого и связанных с ними нарушений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США сер. № 61/498596, поданной 19 июня 2011 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение относится к способам скрининга, лечения и предупреждения инфекций Стафилококка золотистого и связанных с ними нарушений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Стафилококк золотистый («S. aureus») представляет собой бактерию, которая комменсально заселяет более 25% населения. Важно заметить, что этот организм способен разрушать свой начальный участок колонизации, вызывая распространение бактерий и болезнь. S. aureus является главной причиной внутрибольничных инфекций, наиболее распространенных этиологическим агентом инфекционного эндокардита, а также инфекций кожи и мягких тканей, и одной из четырех главных причин пищевых отравлений. В целом, S. aureus заражает более 1,2 миллиона пациентов в год в больницах США. Угроза S. aureus здоровью человека еще раз подчеркивается появлением резистентных к антибиотикам штаммов (например, резистентные к метициллину штаммы Staphylococcus aureus (MRSA)), включая штаммы, резистентные к ванкомицину, антибиотику, который считается последней линией защиты против инфекции S. aureus. Данные факты подчеркивают важность разработки новых терапевтических препаратов против этого сильного возбудителя.

[0004] S. aureus выпускает широкий спектр факторов вирулентности и токсинов, которые позволяют этой бактерии нейтрализовать и противостоять атакам различных видов клеток иммунной системы, в частности субпопуляции белых кровяных клеток, из которых состоят тела первичной системы защиты. Создание этих факторов вирулентности и токсинов позволяют S. aureus сохранять инфекционное состояние, см. Низет, «Понимание того, как главные бактериальные патогены разрушают врожденный иммунитет для выявления новых терапевтических целей», - J. Allergy Clin. Immunol. 120(1):13-22 (2007). Среди этих факторов вирулентности, S. aureus производит несколько би-компонентных лейкотоксинов, разрушающих мембраны клеток, которые отвечают за иммунную защиту организма, и эритроцитов синергетического действия двух не связанных белков или субъединиц (см. Менестрина и др., «Механизм действия бета бочкообразных порообразующих токсинов семейства альфа-гемолизиновых стафилококков», Токсикол. 39(11):1661 1672 (2001)). Среди этих би-компонентных лейкотоксинов лучше всего описан гамма-гемолизин (HlgAB и HlgCB) и лейкоцидин Пантон-Валентина (PVL).

[0005] Токсичность лейкоцидинов в клетках млекопитающих включает в себя действия двух компонентов или субъединиц. Первая субъединица называется субъединицей класса S (т.е. «медленно элюирующая»), а вторая субъединица называется субъединицей класса F (т.е. «быстро элюирующая»). S- и F-субъединицы действуют синергически для формирования пор в белых клетках крови, в том числе моноцитах, макрофагах, дендритных клетках и нейтрофилах (в целом известных, как фагоциты) (см. Менестрина и др., «Механизм действия бета бочкообразных порообразующих токсинов семейства альфа-гемолизиновых стафилококков», Токсикол. 39(11):1661 1672 (2001)). Механизм, с помощью которого би-компонентные токсины образуют поры в клетках-мишенях мембран, не совсем понятен. Предполагаемый механизм действия этих токсинов включает в себя связывание S-субъединицы к мембране клетки-мишени, вероятно, за счет рецепторов с последующим связыванием F-субъединицы и S-субъединицы, тем самым формируя олигомер, который, в свою очередь, формирует предпору, которая вводится в мембрану клетки-мишени, Jayasinghe и др., «Пора лейкосодина: Данные для октамера с четырьмя субъединицами LukF, а также четырьмя субъединицами LukS переменной вокруг центральной оси», Protein. Sci. 14(10):2550 2561 (2005). Поры, образованные би-компонентными лекотоксинами, обычно катионоизбирательные. Порообразование приводит к гибели клеток через медленное ослабление, которое приводит целевые белые кровяные клетки, как сообщают, к осмотическому дисбалансу из-за притока катионов (Майлз и др., «Лейкоцидин стафилококка би-компонентного токсина формирует большие ионные каналы», Биохимия 40(29):8514 8522 (2001)).

[0006] В дополнение к PVL (также известного как лейкоцидин S/F-PV или LukSF-PV) и гамма-гемолизин (HlgAB и HlgCB), набор би-компонентных лейкотоксинов вызванных S. aureus, как известно, включает лейкоцидин E/D («LukE/D»), лейкоцидин A/B («LukAB») и лейкоцидин М/F («LukMF»). Таким образом, субъединицы класса S этих би-компонентных лейкоцидинов включают HlgA, HlgC, LukE, LukS-PV, LukA и LukM, и субъединицы класса F включают HlgB, LukD, LukF-PV, LukB, и LukF'-PV. S- и F-субъединицы S. aureus не являются характерными лейкоцидинами. То есть, они являются взаимозаменяемыми таким образом, что другие би-компонентные комбинации могли бы образовать функциональную пору в белых кровяных клетках, что значительно увеличивает набор лейкотоксинов, Мэйер и др., «Анализ специфики связи лейкоцидина Пантон-Валентина и компонента F гамма-гемолизина,» Infect. Immun. 77(1):266 273 (2009)).

[0007] Создание эффективной терапии для лечения инфекции MRSA было особенно сложным. В дополнение к резистентности к метициллину и соответствующим антибиотикам, в MRSA также были обнаружены существенные уровни резистентности к макролидам (например, эритромицину), бета-лактамазным ингибиторным комбинациям (например, уназину, аугментину), фторхинолонам (например, ципрофлоксацину), а также клиндамицину, триметоприму/сульфаметоксизолу (бактрим), и рифампину. В случае тяжелой инфекции S. aureus, врачи прибегают к введению ванкомицина внутривенной инъекцией. Тем не менее, есть доклады о резистентности S. aureus к ванкомицину. Таким образом, существует необходимость разработать новые способы лечения, эффективного противодействия инфекции S. aureus.

[0008] Настоящее изобретение направлено на преодоление этих и других ограничений в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Первый аспект данного изобретения относится к композиции, содержащей терапевтически фактическое количество изолированного белка или полипептида лейкоцидина E (LukE), изолированного белка или полипептида лейкоцидина D (LukD) или их комбинацию, и фармацевтически допустимого носителя.

[0010] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу иммунизации против инфекции золотистого стафилококка у пациента. Этот способ включает в себя введение композиции настоящего изобретения в эффективной дозе для создания устойчивости иммунитета против инфекции S. aureus у пациента.

[0011] Следующий аспект данного изобретения относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антител, выбранных из группы, которая содержит антитело к LukE, антитело к LukD, или их комбинации, и фармацевтически допустимый носитель.

[0012] Следующий аспект настоящего изобретения направлен на способ профилактики инфекции S. aureus и/или состояний здоровья человека, связанных с S. aureus. Этот способ включает в себя применение композиции, содержащей антитело, которое выбрано из группы, которая содержит антитело к LukE, антитело к LukD, или их комбинации, в эффективной дозе для профилактики инфекции S. aureus и/или состояния здоровья человека, связанного с S. Aureus.

[0013] Следующий аспект изобретения направлен на способ лечения инфекции S. aureus и/или состояний здоровья человека, связанных с S. aureus. Этот способ включает в себя применение композиции, содержащей один или несколько ингибиторов LukE/D, которые служат связующим звеном цитотоксичности в эффективной дозе при лечении инфекции S. aureus и/или S. aureus, связанного с состоянием здоровья человека.

[0014] Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу прогнозирования тяжести инфекции S. aureus. Этот способ включает культивирование бактерий S. aureus, полученных от зараженного человека посредством образца жидкости или ткани у пациента, и количественное выражение LukE и/или LukD культивированных бактерий S. aureus. Количество LukE и/или LukD в образце человека, по сравнению с количеством LukE и/или LukD в контрольном образце, который вырабатывает малое или неопределенное количество LukE и/или LukD, и тяжесть инфекции S. aureus прогнозируется на основе вышеуказанного сравнения.

[0015] Следующий аспект данного изобретения связан со способом лечения пациента с инфекцией S. aureus. Этот способ включает культивирование бактерий S. aureus, полученных от зараженного пациента посредством жидкости или ткани пациента и количественного выражения LukE и/или LukD культивированных бактерий S. aureus. Количество LukE и/или LukD в образце пациента по сравнению с количеством LukE и/или LukD в контрольном образце, который вырабатывает малое или неопределенное количество LukE и/или LukD, и соответствующее лечение пациента определяется на основе этого сравнения. Способ предполагает дальнейшее применение определенного соответствующего курса лечения для пациента с инфекцией S. aureus.

[0016] Следующий аспект настоящего изобретения связан со способом определения ингибиторов LukE/D цитотоксичности. Этот способ предусматривает популяцию клетки, препарат, содержащий LukE/D, и применяемый ингибитор LukE/D. Популяция клетки подвергается воздействию препарата, содержащего LukE/D в присутствии и в отсутствие применяемого ингибитора, и опосредованная цитотоксичность LukE/D измеряется в присутствии и в отсутствие применяемого ингибитора. Измеряемое количество цитотоксичности сравнивается в присутствии и в отсутствие применяемого ингибитора и ингибитор цитотоксичности LukE/D определяется на основе этого сравнения.

[0017] Следующий аспект настоящего изобретения связан со способом определения ингибиторов опосредованного порообразования LukE/D. Этот способ предусматривает популяцию лейкоцитов, препарат, содержащий LukE и LukD, и применяемый ингибитор. Популяция лейкоцитов подвергается воздействию препарата, содержащего LukE и LukD в присутствии и в отсутствие применяемого ингибитора, и порообразование популяции лейкоцитов измеряется в присутствии и в отсутствие кандидата ингибитора. Сравнивается измеряемое количество порообразования в присутствии и в отсутствие применяемого ингибитора, и ингибитор LukE/D опосредованного порообразования определяется на основе сравнения.

[0018] Следующий аспект настоящего изобретения направлен на способ идентификации ингибиторов LukE и/или LukD, связывающихся с лейкоцитами. Этот способ предусматривает популяцию лейкоцитов, препарат, содержащий выявленные меченые LukE и LukD, и применяемый ингибитор. Популяция клетки подвергается воздействию препарата, содержащего выявленные меченые LukE и LukD в присутствии и в отсутствие применяемого ингибитора, и меченые LukE и/или LukD, связывающиеся с популяцией лейкоцитов, измеряются в присутствии и в отсутствие применяемого ингибитора. Сравнивается измеряемое количество LukE и/или LukD, связывающихся с лейкоцитами в присутствии и в отсутствие применяемого ингибитора и ингибитор LukE и/или LukD, связывающийся с лейкоцитами, определяется на основе сравнения.

[0019] Большой успех S. aureus в качестве возбудителя достигает отчасти из-за своей способности отображать большое количество факторов, которые наносят вред человеку. Среди этих факторов можно выделить ряд бактериальных белковых токсинов, которые скрываются во внеклеточной среде, где они действуют, убивая клетки человека. Лейкоцидин E/D (LukE/D) представляет собой плохо характеризующийся токсин, вырабатываемый S. aureus. Как показано в настоящем изобретении, этот токсин поражает и убивает лейкоциты человека, которые являются ключевыми иммунными клетками, участвующими в защите организма человека от инфекции S. aureus. Данные исследования иллюстрируют, что LukE/D является критическим фактором патогенеза в организме человека, подчеркивают важность этого токсина в процессе болезни. Как описано здесь, иммунизация LukE и/или LukD производит нейтрализующие антитела против S. aureus. Таким образом, активные и/или пассивные стратегии вакцинации предлагают новую терапевтическую стратегию для профилактики инфекции S. aureus. Кроме прямого торможения LukE/D опосредованная цитотоксичность предлагает новое средство лечения пациентов с инфекцией S. Aureus.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0020] Фигуры 1А-1B иллюстрируют делецию поврежденного гена при отсутствии локуса S. aureus agr (ΔagrΔrot), который восстанавливает вирулентность у мышей на уровне дикого типа («ДТ») и приводит к переработке LukE/D. На фигуре 1А кривая выживания показывает, что удвоенный мутант Δagr Δrot показывает характеристики вирулентности у мышей ДТ. Наблюдалась выживаемость мышей после введения внутривенной инъекцией ~1×10⁷ CFU S. aureus ДТ, Δagr, или удвоенных мутантов ΔagrΔrot. Общее количество мышей в каждой группе составляло N=6. Статистическая значимость между кривыми была определена с помощью логрангового критерия (критерия Кокса-Мантеля) ***, p≤0,0005. На фигуре 1B выработка лейкотоксинов восстанавливается у удвоенных мутантов ΔagrΔrot. Проиллюстрированы образцы белка иммуноблотов из трихлоруксусной кислоты (ТХК), которые образуют осадок бактериальных супернатантов активированных клеток (выращенных в течение 5 часов в RPMI+CAS) следующих штаммов: ДТ, Δagr, и ΔagrΔrot. Отрицательные контрольные полосы содержат ТХК, которые образуют осадок из супернатанта лейкотоксина соответствующих разрушенных мутантов (ΔlukE/D, ΔlukA/B, Δhla, ΔhlgC). Δ lukE/D ΔhlgACB двойных мутантных эксопротеинов были также опробованы во всех иммуноболитах LukE в качестве контроля для перекрестной реактивности антитела LukE.

[0021] Фигуры 2А-2В показывают, что делеция повреждения вызывает гипервирулентность только у животных, фенотипа, вызванного дерепрессией и получающейся в результате переработки LukE/D. Кривая выживания на фигуре 2А показывает гипервирулентность мутанта Δrot по сравнению с родительским штаммом ДТ. Наблюдалась выживаемость мышей после введения внутривенной инъекцией ~1×10⁷ CFU S. aureus ДТ и штаммов Δrot. Общее количество мышей в каждой группе: ДТ, N=17; Δrot, N=12. Выработка LukE/D увеличивается в отсутствии транскрипционного репрессора Rot, в то время как выработка других лейкотоксинов в значительной степени остается неизменной. В иммуноблотах на фигуре 2B показаны образцы белка ТХУ осажденных бактериальных супернатантных активированных клеток (выращиваемых в течение 5 часов в RPMI+CAS) следующих штаммов: ДТ, и Δrot. Отрицательные контрольные полосы содержат осажденный супернатант ТХК из соответствующих токсинраспадающихся двойных мутантов (Δrot ΔlukE/D, Δrot ΔlukA/B, Δrot Δhla, и Δrot ΔhlgACB). Также были испытаны тройные мутирующие эксопротеины Δrot ΔlukE/D ΔhlgACB во всех иммуноблотах LukE в качестве контроля для перекрестной реактивности антитела LukE.

Как показано на кривой выживания, на фигуре 2C гипервирулентность мутанта Δrot увеличивается за счет выработки LukE/D. Наблюдалась выживаемость мышей после введения внутривенной инъекцией ~1×10⁷ CFU S. aureus ДТ, Δrot, и Δrot ΔlukE/D. Статистическая значимость между кривыми выживаемости была определена с помощью логрангового критерия (критерия Кокса-Мантеля) **, p≤0,005; ***, p≤0,0005.

[0022] Фигуры 3А-3В иллюстрируют, что ген распада связывает промотор lukE/D и подавляет выражение генов. Как показано на фигуре 3А, оптимальное выражение генов зависит от дерепрессии распада. Были использованы транскрипционные сплавы зоны промотора lukE/D к GFP для измерения активации промотора в бульонной культуре в следующих фонах штамма (ДТ, Δagr, Δrot, и Δagr Δrot). Флуоресценция GFP была измерена с течением времени и значения выражены в виде относительных флуоресцентных единиц (RFU) после нормализации бактериальной оптической плотности в 600 нм. Показанные значения являются результатом трех экспериментов, представленных в трех экземплярах. На фигуре 3B ген распада связывает промотор lukE/D. На фигуре 3B иммуноблот промотора или снижает биотинилированный внутригенный ДНК (неспецифический), или промотор lukE/D ДНК привязывается к стрептавидиновым магнитным шарикам M280 и инкубируется со всеми клеточными лизатами S. aureus. Ген распада был обнаружен с помощью иммуноблота с использованием антител анти-распада.

[0023] Фигуры 4A-4F свидетельствуют о том, что единственный мутант ΔlukE/D значительно ослабляется по степени вирулентности в модели мыши системной инфекции. Фигуры 4A и 4B иллюстрируют верификацию делеции lukE/D в S. aureus по Ньюмену. На фигуре 4А показана ПЦР геномной ДНК S. aureus со специфическими праймерами lukE. На фигуре 4B проиллюстрированы образцы белка иммуноблотов из ТХК осажденных бактериальных супернатантов активированных клеток (выращиваемых в течение 5 часов в RPMI+CAS) следующих штаммов: ДТ, ΔlukE/D, ΔlukE/D::plukE/D, ΔhlgACB, и ΔhlgACB. Эксопротеины мутанта ΔlukE/D исследовались также в качестве контроля для перекрестной реакции антитела LukE. Фигуры 4C-4F иллюстрируют, что мутант ΔlukE/D подвергается серьезному риску при вирулентности у мышей. На фигурах 4C и 4D наблюдается выживаемость мышей после введения внутривенной инъекцией ~1×10⁷ CFU (Фиг. 4C) или ~1×10⁸ CFU (фигура 4D) S. aureus ДТ, ΔlukE/D, и ΔlukE/D::plukE/D штаммов. Общее количество мышей в каждой группе составляло N=6. Статистическая значимость между кривыми выживаемости была определена с помощью логрангового критерия (критерия Кокса-Мантеля) **, p≤0,005; ***, p≤0,0005. Фигуры 4E и 4F изображают подсчет бактериальной КОЕ (фигура 4Е) и явной патологии (фигура 4F) почек на протяжении 96 часов после заражения ~1×10⁷ CFU тех же штаммов, описанных на фигурах 4C и 4D. Стрелки обозначают расположение нарывов на почках. Статистическая значимость была определена по способу 1-Way ANOVA с помощью итогового тестирования множественного сравнения Тьюки **, p≤0,005; ***, p≤0,0005.

[0024] Фигуры 5A-5E иллюстрируют, что LukE/D токсичен и образует поры в иммунных клетках. Фигура 5A - представляет собой кривую жизнеспособности клеток, показывающую, что очищенный рекомбинантный LukE/D является токсичным для моноцитарно-подобной клеточной линии THP-1 человека. Клеточная линия THP-1 была заражена рекомбинантным LukE, LukD, или смесью LukE+LukD (LukE/D). За жизнеспособностью клеток следили в течение 1 часа после интоксикации с помощью CellTiter, где клетки, обработанные средством, были определены как 100% жизнеспособные. Результаты представляют собой среднее из тройных образцов ± С.О. (стандартное отклонение). Очищенный рекомбинантный ген LukE/D не является токсичным для клеток человека линии HL60, как показано на кривой жизнеспособности клеток на фигуре 5В. Линия клеток HL60 была заражена (см. выше) и за жизнеспособностью клеток следили в течение 1 часа после интоксикации с помощью CellTiter, где клетки, обработанные средством, были определены как 100% жизнеспособные. В отличие от этого, кривые жизнеспособности клеток на фигуре 5C иллюстрируют очищенный рекомбинантный LukE/D, который токсичен для нейтрофилов как человека (левый график), так и мышей (правый график) (также известные как полиморфноядерные нейтрофилы, или PMNs). PMNs были заражены, как указывалось выше, и за жизнеспособностью клеток следили в течение 1 часа после интоксикации с помощью CellTiter, где клетки, обработанные средством, были определены как 100% жизнеспособные. Ген LukE/D является посредником цитотоксичности по отношению к принимающей клетке THP-1 клетки, формируя поры в мембране клетки, как показано на фигуре 5D. Клетки THP-1 и HL60 были культивированы очищенным геном LukE/D, и порообразование определялось смешанным анализом с бромидом эдития. Была показана низкая флуоресценция тройных экспериментов как для THP-1, так и для HL60. Фигура 5E показывает флуоресцентное микроскопическое изображение поглощения очищенного гена LukE/D бромидом эдития (30 мг/мл) и контроль (без токсинов) THP-1 клетки.

[0025] Фигуры 6А-6В иллюстрируют, что цитотоксичность LukE/D нейтрализуется сходством с поликлональным очищенным антителом α-LukE. Клетки THP-1, находившиеся в отравленном состоянии с 1,5 мг рекомбинантными LukE/D после инкубации с 0,1 мг α-LukE поликлональным антителом или предиммунной сывороткой. Жизнеспособность клеток (фигура 6A) и порообразование (фигура 6B) контролировались с помощью CellTiter и БЭ соответственно. Для анализов CellTiter, клетки, обработанные средством, были определены как 100% жизнеспособные. Результаты представляют собой среднее значение дубликатов проб ± стандартное отклонение (С.О.).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0026] Первый аспект настоящего изобретения относится к композиции, которая содержит терапевтически эффективное количество изолированного белка LukE или его полипептида, изолированного белка LukD или его полипептида, или их комбинацию, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0027] В одном примере изобретения композиция содержит изолированный белок LukE или полипептид. В другом примере изобретения композиция содержит изолированный белок LukD или его полипептид. В другом примере изобретения содержатся белки, как LukE, так и LukD и их полипептиды.

[0028] В соответствии с этим аспектом изобретения соответствующие изолированные белки LukE включают производные от любого штамма S. aureus. Последовательность аминокислот белков LukE различных штаммов S. aureus, которые подходят для композиции данного изобретения, приведена в Таблице 1 ниже (т.е. SEQ ID NOS:1-10). SEQ ID NO:11 Таблица 1 представляет собой консенсусную последовательность LukE, которая показывает высокий уровень идентичной последовательности у белков LukE различных штаммов S. aureus. Соответственно, в одном из примеров изобретения, изолированный белок LukE содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11. В другом примере настоящего изобретения изолированный белок LukE содержит аминокислотную последовательность, которая имеет около 70-80% идентичной последовательности SEQ ID NO:11, преимущественно около 80-90% идентичной последовательности SEQ ID NO:11, и преимущественно 90-95% идентичной последовательности SEQ ID NO:11, и преимущественно 95-99% идентичной последовательности SEQ ID NO:11.

[0029] В другом примере настоящего изобретения композиция содержит изолированный иммуногенный полипептид LukE. Соответствующие полипептиды LukE содержат от 50 до 100 аминокислот в длину. Более предпочтительные полипептиды LukE содержат около 100-200 аминокислот в длину, преимущественно 200-250 аминокислот в длину, и наиболее предпочтительно 250-300 аминокислот в длину. N-терминальные аминокислотные остатки полной длины LukE представляют врожденную секрецию/последовательность сигналов. Таким образом, «зрелая» секретная форма LukE представлена аминокислотными остатками 29-311 в каждом SEQ ID NO:1-10 и SEQ ID NO:11. Соответственно, аминокислотные остатки 1-311 в каждом SEQ ID NO:1-10 и SEQ ID NO:11 называются «незрелые» в форме LukE. Соответственно, в одном из примеров изобретения, полипептид LukE содержит аминокислотные остатки 29-311 SEQ ID NO:11. Кроме того, полипептид LukE изобретения содержит аминокислотные остатки 48-291, аминокислоты 29-301, или аминокислоты 48-301 SEQ ID NO:11. Этих полипептидов LukE недостаточно для деятельности LukE, но они поддерживают антигенность. В любом случае, к соответствующим полипептидам LukE также относятся те полипептиды, которые включают последовательность аминокислот и имеют 70-80% идентичной последовательности, преимущественно 80-90% идентичной последовательности, более предпочтительно 90-95% идентичной последовательности, и наиболее предпочтительно 95-99% идентичной последовательности аминокислотных остатков 29-311 SEQ ID NO:11, аминокислотных остатков 48-291 SEQ ID NO:11, аминокислотных остатков 29-301 SEQ ID NO:11, или аминокислотных остатков 48-301 SEQ ID NO:11.

[0030] В соответствии с этим аспектом изобретения соответствующие изолированные белки LukD включают те протеины, которые получены из любого штамма S. aureus. Последовательность аминокислот белков LukD из различных штаммов S. aureus, которые подходят для композиции данного изобретения, приведена в Таблице 2 ниже (т.е. SEQ ID NO: 12-21). SEQ ID NO:22 Таблица 2 представляет собой консенсусную последовательность LukD и показывает высокий уровень идентичной последовательности белков LukD различных штаммов S. aureus. Соответственно, в одном из примеров изобретения изолированный белок LukD состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:22. В другом примере настоящего изобретения изолированный белок LukD содержит аминокислотную последовательность, которая имеет 70-80% идентичной последовательности для SEQ ID NO:22, преимущественно 80-90% идентичной последовательности для SEQ ID NO:22, и более предпочтительно 90-95% идентичной последовательности для SEQ ID NO:22, и наиболее предпочтительно 95-99% идентичной последовательности для SEQ ID NO:22.

[0031] В другом примере настоящего изобретения композиция состоит из изолированного иммуногенного полипептида LukD. Соответствующие полипептиды LukD имеют от 50 до 100 аминокислот в длину. Более предпочтительны полипептиды LukD с 100-200 аминокислотами в длину, более предпочтительны с 200-250 аминокислотами в длину, и наиболее предпочтительно с 250-300 аминокислотами в длину. N-терминальные аминокислотные остатки LukD в полную длину представляют врожденную секрецию/последовательность сигналов. Таким образом, зрелые секретированные формы LukD представлены аминокислотными остатками 27-327 в каждом SEQ ID NO:12-21 и SEQ ID NO:22. Соответственно, аминокислотные остатки 1-327 SEQ ID NO:12-21 и SEQ ID NO:22 называются «незрелой» формой LukD. Соответственно, в одном из примеров изобретения полипептид LukE состоит из аминокислотных остатков 27-327 SEQ ID NO:22. Кроме того, полипептид LukE изобретения содержит аминокислотные остатки 46-307, 27-312, и 46-312 SEQ ID NO:22. Этих полипептидов LukD недостаточно для деятельности LukD, но они поддерживают антигенность. В любом случае соответствующие полипептиды также включают те полипептиды, которые содержат последовательность аминокислот с 70-80% идентичной последовательностью, преимущественно с 80-90% идентичной последовательностью, более предпочтительно с 90-95% идентичной последовательностью, и наиболее предпочтительно с 95-99% идентичной последовательностью аминокислотных остатков 27-327 SEQ ID NO:22, аминокислотных остатков 46-307 SEQ ID NO:22, аминокислотных остатков 27-312 SEQ ID NO:22 или аминокислотных остатков 46-312 SEQ ID NO:22.

Таблица 1Выстраивание последовательности S. aureus LukE
Штамм S. aureus
Newman	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:1
MW2	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:2
USA_300_FPR3757	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:3
COL	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:4
USA_300_TCH1516	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:5
N315	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:6
D30	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:7
Mu50	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:8
TCH_70	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:9
MRSA131	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:10
	**************************************************
LukE Консенсусная последовательность	MFKKKMLAATLSVGLIAPLASPIQESRANTNIENIGDGAEVIKRTEDVSS 50 SEQ ID NO:11
Newman	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
MW2	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
USA_300_FPR3757	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
COL	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
USA_300_TCH1516	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
N315	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
D30	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
Mu50	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
TCH_70	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100

MRSA131	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK 100
	**************************************************
LukE Консенсусная последовательность	KKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTK
Newman	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
MW2	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
USA_300_FPR3757	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
COL	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
USA_300_TCH1516	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
N315	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
D30	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
Mu50	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
TCH_70	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
MRSA131	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA 150
	**************************************************
LukE Консенсусная последовательность	RMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSA
Newman	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
MW2	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
USA_300_FPR3757	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
COL	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
USA_300_TCH1516	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
N315	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
D30	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
Mu50	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
TCH_70	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200

MRSA131	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK 200
	**************************************************
LukE Консенсусная последовательность	PSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKK
Newman	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
MW2	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
USA_300_FPR3757	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
COL	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
USA_300_TCH1516	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
N315	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
D30	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
Mu50	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
TCH_70	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
MRSA131	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG 250
	**************************************************
LukE Консенсусная последовательность	SAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKG
Newman	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
MW2	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
USA_300_FPR3757	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
COL	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
USA_300_TCH1516	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
N315	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
D30	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
Mu50	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
TCH_70	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300

MRSA131	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW 300
	**************************************************
LukE Консенсусная последовательность	SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW
Newman	KTHEIKVKGHN 311
MW2	KTHEIKVKGHN 311
USA_300_FPR3757	KTHEIKVKGHN 311
COL	KTHEIKVKGHN 311
USA_300_TCH1516	KTHEIKVKGHN 311
N315	KTHEIKVKGHN 311
D30	KTHEIKVKGHN 311
Mu50	KTHEIKVKGHN 311
TCH_70	KTHEIKVKGHN 311
MRSA131	KTHEIKVKGHN 311
	***********
LukE Консенсусная последовательность	KTHEIKVKGHN