Прокоагулянтные пептиды, их производные и их применение

Прокоагулянтные пептиды, их производные и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Заявка, рассматриваемая в данный момент, содержит Список последовательностей, который представлялся в формате ASCII посредством системы EFS-Web, и включен путем ссылки в полном объеме в настоящую заявку. Упомянутая копия в формате ASCII, созданная 28 июня 2011 года, называется ETH5623.txt и имеет размер 4.912 байт.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в общем к реагентам и устройствам для стимуляции гемостаза и материалам для заживления тканей, а конкретнее к синтетическим пептидам, обладающим сильными гемостатическими свойствами и свойствами заживления тканей в сочетании с каркасами, такими как гемостатическими каркасами, основанными на желатине.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Кровь - это жидкая ткань, содержащая эритроциты, лейкоциты, форменные элементы крови и тромбоциты, растворенные в жидкой фазе. Жидкой фазой является плазма, которая содержит кислоты, липиды, растворенные электролиты и белки. Особым белком, пребывающим во взвешенном состоянии в жидкой фазе, является фибриноген. При возникновении кровотечения фибриноген вступает в реакцию с водой и тромбином (энзим) и образует фибрин, вещество, нерастворимое в крови, и образующее сгустки при полимеризации.

При самых различных условиях животные, в том числе люди, могут страдать кровотечениями, связанными с ранами или хирургическими процедурами. В некоторых ситуациях, кровотечение сравнительно слабое, и нормальных функций свертывания крови, дополненных применением простых приемов первой помощи, оказывается достаточно. В иных ситуациях может иметь место существенное кровотечение. В таких ситуациях обычно требуется специализированное оборудование и материалы, а также обученный персонал для оказания необходимой помощи.

Для решения упомянутых выше проблем были разработаны материалы для контроля чрезмерного кровотечения.

Ранее использовались известные материалы, такие как желатин, коллаген, окисленная целлюлоза, тромбин, фибриноген и другие материалы, но каждый из этих материалов имеет свои ограничения к применению. Например, одним из видов коагулирующих материалов, используемых ранее в данной области, являются белки или энзимы, произведенные на основе крови, в том числе фибриноген и/или тромбин, являющиеся дорогими, требующими специальных условий хранения и интенсивной очистки для предотвращения возможности заражения инфекционными заболеваниями, передающимися через кровь.

Гемостатические устройства, содержащие жидкий тромбин, имеют особые требования к обращению для поддержания биологической активности тромбина. Например, жидкий тромбин необходимо охлаждать, чтобы поддерживать его стабильность во время хранения. Опасения вызывает и безопасность, которой требуется уделять внимание, и которая связана с использованием тромбина человеческого или животного происхождения, так как существует риск заражения или иммуногенности. К тому же тромбин и фибриноген, очищенные от человеческой или животной плазмы, очень дороги. Таким образом, выгодной представляется разработка инновационного гемостаза с большей стабильностью при хранении, более низким риском вирусного и другого заражения и более низкой иммуногенностью, который будет дешевле и сможет работать в среде гепаринизированной крови.

Белок человека Тромбоспондин-1 (TSP-1) и родственные белки, как указывается в литературе, принимают участие в ангиогенезе и агрегации тромбоцитов. TSP-1 является гомотримерным гликопротеином (MW ~450K) и впервые был обнаружен в тромбоцитах как белок, чувствительный к тромбину.

В статье «Эволюционирующая роль тромбоспондина-1(TSP1) в гемостазе и сосудистой биологии» авторов Боннефой и др., Cell. Mol. Life Sci. 65 (2008) 713-727 указывается, что TSP1 принимает участие в ангиогенезе, воспалительных процессах, заживлении ран и гемостазе, в статье также рассматривается структура и домены TSP1, равно как и связывание аминокислотного (SEQ ID NO: 1) пептида для CD47.

Статья «Агрегация тромбоцитов, вызванная C-терминальным пептидом тромбоспондина-1, нуждается в стыковочном белке, но в значительной степени независима от альфа II b/бета3» авторов Трумел и др., напечатанная в журнале «Тромбоз и гемостаз», выпуск от 02/2003;1(2):320-9, указывает на то, что тромбоспондин-1 (TSP1) обильно выделяется во время активации тромбоцитов и играет определенную роль в необратимой агрегации тромбоцитов. Пептид, получаемый из С-терминального домена TSP1, SEQ ID NO: 1 способен по меньшей мере частично активировать тромбоциты человека путем связывания с белком, связанным с интегрином.

Статья «Тромбоспондин действует посредством белка, связанного с интегрином, для активации интегрина тромбоцитов» авторов Чунг и др., J Biol Chem 1997; 272 № 23, выпуск от 6 июня, с. 14740-14746, сообщает о том, что пептид из CBD, SEQ ID NO: 2 (4N1K), был идентифицирован как IAP-агонист. TS1, CBD и пептид IAP-агонист (4N1K), образованный из CBD из TS1, активируют интегрин тромбоцита aIIbb3, в результате чего тромбоциты распространяются на иммобилизированный фибриноген, происходит стимуляция агрегации тромбоцитов и усиленное фосфорилирование тирозином фокального слипания киназы.

Статья «Тромбоспондин стимулирует агрегацию белков» авторов Тусзынски и др., Blood, 72, 109-115 (1988), сообщает о том, что пока роль TSP в гемостазе до конца не ясна, теоретически допускается, что TSP поперечно связывает агрегат тромбоцит-фибриноген, стабилизирует формирование сгустков фибрина и модулирует фибринолиз, а также о том, что, исходя из результатов исследования, напрашивается вывод о способности TSP играть регулирующую роль в гемостазе путем замедления адгезии тромбоцитов и предоставления нетромбообразующей поверхности.

В статье «Тромбоспондин-1 действует посредством IAP/CD47 для сочетания с коллагеном в альфа2бета1-опосредованной активации тромбоцитов» авторов Чунг и др., Blood, выпуск от 15 июля 1999 г.; 94(2):642-8, описан пептид-агонист CD47, 4N1K (SEQ ID NO: 2), полученный из CBD, который сочетается с растворимым коллагеном при агрегации плазмы, насыщенной тромбоцитами. 4N1K и интактный TS1 также вызывают агрегацию промытых не размешанных тромбоцитов на иммобилизированном коллагене с резким повышением фосфолирования тирозина.

Статья «Стимуляция активации и агрегации тромбоцитов карбоксил-терминальным пептидом, полученным в результате связывания тромбоспондина с рецептором белка, связанного с интегрином» авторов Дораги и др., J. Biol Chem 1997; 272:1323-1330, сообщает о том, что пептид из карбоксильного сайта терминации транскрипции тромбоспондина, SEQ ID NO: 1, прямо и специфично вызывает активацию и агрегацию промытых тромбоцитов человека от различных доноров при концентрациях 5-25 ммоль. При менее высоких концентрациях пептид сочетается с близкими к оптимальным концентрациям ADP для стимулирования агрегации. Афинная хроматография и иммунопреципитация пептида с моноклональным антителом использовалась для идентификации рецептора для карбоксил-терминального пептида в качестве белка, связанного с интегрином. Белок, связанный с интегрином, оставался связанным с SEQ ID NO: 1, содержащим столбик пептида, при промывании со скремблированным пептидом в присутствии 5 ммоль ЭДТА, свидетельствуя о двухвалентной катион-независимой ассоциации. Напрашивается вывод о том, что белок, связанный с интегрином, является первичным сенсорным рецептором для тромбоспондина на поверхности покоящихся тромбоцитов и причастен к потенциированию реакции агрегации тромбоцитов.

Статья «Белок, связанный с интегрином и тромбоспондином (CD47) физически и функционально модифицирует интегрин альфа IIbбета3 своим внеклеточным доменом» авторов Фуджимото и др., J Biol Chem 2003; 278:26655-26665, сообщает о том, что пептид из связующего домена С-терминальной клетки, SEQ ID NO: 2 (4N1K), связывается с IAP и стимулирует интегрин-зависимые функции клетки, в том числе агрегацию тромбоцитов. Агрегация тромбоцитов, вызванная 4N1K, не полностью замедлялась элиминацией энергии азидом натрия и 2-дезокси-D-глюкозой, хотя реакция тромбоцитов, вызванная ADP или коллагеном, была полностью угнетена.

Статья «С-терминальный пептид тромбоспондина вызывает агрегацию тромбоцитов через сигнальный путь, связанный с цепочкой Fc-рецептора, и посредством агглютинации» авторов Туласне и др., Blood 2001; 98:3346-3352, сообщает о том, что пептид из С-терминального домена тромбоспондина-1 (Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys (SEQ ID NO: 1), известный как 4N1-1) вызывает агрегацию тромбоцитов и связывается с белком, связанным с интегрином (IAP), который также известен как CD47. Было обнаружено, что 4N1-1 или его производный пептид, 4N1K, вызывает резкое фосфорилирование g цепочки Fc-рецептора (FcR), Syk, SLP-76 и фосфолипазы C g2 в тромбоцитах человека. Данная ссылка сообщает о том, что С-терминальный пептид тромбоспондина вызывает агрегацию тромбоцитов через сигнальный путь, связанный с цепочкой Fc-рецептора, и посредством агглютинации.

Статья «С-терминальный пептид тромбоспондина-1 стимулирует четкий сигнальный путь, но вызывает агглютинацию тромбоцитов или других клеток, независящую от активации» авторов Войт и др., FEBS Letters, 2003; 544: 240-245, сообщает о том, что пептид из С-терминального домена тромбоспондина-1 (4N1-1) предлагается для стимуляции агрегации тромбоцитов с помощью инновационного механизма, подразумевающего как агглютинацию, независящую от активации, так и гликопротеин (GP) IIb/IIIa-опосредованную агрегацию, зависящую от активации, которая включает в себя GPVI сигнализирование, но не включает в себя CD47. Данное исследование показывает, что 4N1-1 стимулировал другую модель пути передачи сигнала по сравнению с той, которую стимулирует конвульксин GPVI-агониста. Более того, агрегация тромбоцитов, вызванная 4N1-1- не зависела от активации и GPVI или GPIIb/IIIa. 4N1-1 также стимулировал независящую от активации агглютинацию отличных мегакариоцитарных и немегакариоцитарных клеток. 4N1-1-вызывал агглютинацию клеток, но не замедлял сигнализирование тромбоцитов анти-CD47 антителами.

Статья «Модель агрегации тромбоцитов, включающая в себя многочисленные взаимодействия тромбоспондина-1, фибриногена и рецептора GPIIbIIIa» авторов Боннефой и др., J Biol Chem 2001; 276:5605-5612, сообщает о том, что Тромбоспондин-1 (TSP) может после выделения из α гранул тромбоцитов принимать участие в агрегации тромбоцитов, но механизм его действия мало понятен. В исследовании оценивалась способность TSP образовывать межтромбоцитарные поперечные мостики путем взаимодействия с фибриногеном (Fg), с применением либо гранул, покрытых Fg, либо Fg, связанного с активированным интегрином GPIIbIIIa (GPIIbIIIa*), иммобилизированном на гранулах или на активированных фиксированных тромбоцитах (AFP), т.е. в системе без тромбоцитного сигнализирования и механизмов секреции.

Патент США № 5399667 под названием «Пептиды, связывающиеся с рецептором тромбоспондина» авторов Фрейзиер и др. сообщает об инновационных коротких пептидах, которые связываются с рецептором тромбоспондина-1, который предпочтительно имеет пять аминокислотных остатков, которые разделяют тетрапептид Arg-Val-Ala-Val (SEQ ID NO: 20) и имеют особые последовательности. К тому же в упомянутом патенте говорится о пептиде, содержащем VVM, который связывается с рецептором тромбоспондина-1, который выбирают из группы, состоящей из RFYVVMWKQVTQS (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO:1 в ‘667) и их фрагментов, содержащих по меньшей мере последовательность SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 и их фрагментов, содержащих по меньшей мере последовательность SEQ ID NO: 5.

Патент США № 5190920 под названием “Способ использования синтетических аналогов тромбоспондина для угнетения метастатической активности“ авторов Джейкоб и др. относится в общем к фрагментам пептидов и синтетическим аналогам тромбоспондина (TSP), которые сохраняют активность, присущую тромбоспондину. Представляются соединения и композиции, содержащие фрагменты, и способы использования синтетических аналогов тромбоспондина для стимуляции или угнетения активности, присущей тромбоспондину.

В публикации международной патентной заявки 1996/040033 авторов Таддеус и др. описывается гемостатический участок, состоящий из биологически разлагаемой матрицы, эпсилон-аминокапроновых кислот (EACA) и пептидов, активирующих рецептор тромбина (TRAP). Это изобретение раскрывает множество вариантов осуществления, содержащих желатин, альгинаты, окисленную регенерированную целлюлозу или коллаген в качестве матрицы и EACA, TRAP, кальций, RGD-пептид и кальций в качестве активных компонентов. Раскрываемые последовательности включают SFLLRNPNDKYEPF (SEQ ID NO: 9), SFLLRNPNDKYEP (SEQ ID NO: 10), SFLLRNPNDKYE (SEQ ID NO: 11), SFLLRNPNDKY (SEQ ID NO: 12), SFLLRNPNDK (SEQ ID NO: 13), SFLLRNPND (SEQ ID NO: 14), SFLLRNPN (SEQ ID NO: 15), SFLLRNP (SEQ ID NO: 16), SFLLRN (SEQ ID NO: 17), SFLLR (SEQ ID NO: 18), SFLL (SEQ ID NO: 19), SFL и их производные.

В патенте США № 7285580 под названием «Способы использования праймер молекул для усовершенствования механической прочности тканевых клеев и заживителей» автора Стедронски сообщается о том, что кроме естественных белков различные рекомбинантно произведенные белки также могут найти применение в тканевых клеях и заживителях. Здесь могут найти применение не только описанные выше натуральные белки, произведенные рекомбинантно, но и различные поперечно-сшиваемые искусственные рекомбинантные белки. Предпочтительные искусственные рекомбинантно произведенные белки включают в себя белки, содержащие повторяющиеся участки встречающихся в природе блоков последовательностей аминокислот из таких встречающихся в природе структурных белков как фиброин, эластин, коллаген, кератин и т.п. Предпочтительные для использования белки с повторяющимися участками включают SELP8K, SELP0K-CS1 и SELP0K.

Публикация международной патентной заявки 2009/040034 под названием «ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕПТИДА В КАЧЕСТВЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА» автора Бевек и др. направлена на использование пептидного соединения Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-OH (SEQ ID NO: 1) в качестве терапевтического средства в профилактике и/или лечении рака, аутоиммунных заболеваний, фиброзов, воспалительных заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, инфекционных заболеваний, заболеваний легких, сердечнососудистых заболеваний и к тому же относится к фармацевтическим композициям предпочтительно в форме лиофилизата или жидкого буферного раствора или искусственной композиции материнского молока или заменителя материнского молока, содержащего пептид Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-OH (SEQ ID NO: 1) необязательно с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, криопротектантом, лиопротектантом, вспомогательным веществом и/или разжижающим кровь веществом.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на гемостатический материал или материал для заживления тканей, имеющий (a) пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1 или его последовательность аналогов аминокислот, и (b) каркас для упомянутого пептида или аналогичной последовательности аминокислот. Каркас представляет собой предпочтительно гемостатический материал, например, природный или генно-инженерный абсорбируемый полимер, синтетический абсорбируемый полимер или их комбинации. Природные или генно-инженерные полимеры могут быть выбраны из группы, состоящей из белка, полисахарида или их комбинаций. Белок может быть выбран из группы, состоящей из протромбина, тромбина, фибриногена, фибрина, фибронектина, гепариназы, фактора X/Xa, фактора VII/VIIa, фактора IX/IXa, фактора XI/XIa, фактора XII/XIIa, тканевого фактора, батроксобина, анкрода, экарина, фактора фон Виллебранда, коллагена, эластина, альбумина, желатина, гликопротеинов поверхности тромбоцитов, вазопрессина, аналогов вазопрессина, эпинефрина, селектина, прокоагулянтного яда, ингибитора активатора плазминогена, агентов, активирующих тромбоциты, пептидов или их комбинаций. Полисахарид может быть выбран из группы, состоящей из целлюлозы, алкилцеллюлозы, метилцеллюлозы, алкилгидроксиалкилцеллюлозы, гидроксиалкилцеллюлозы, сульфата целлюлозы, солей карбоксиметилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, карбоксиэтилцеллюлозы, хитина, карбоксиметил хитина, гиалуроновой кислоты, солей гиалуроновой кислоты, альгината, альгиновой кислоты, пропиленгликольальгината, гликогена, декстрана, декстрансульфата, курдлана, пектина, пуллулана, ксантана, хондроитина, хондроитинсульфатов, карбоксиметилдекстрана, карбоксиметил хитозана, гепарина, гепаринсульфата, гепарана, гепарансульфата, дерматансульфата, кератансульфата, каррагинанов, хитозана, крахмала, амилозы, амилопектина, поли-N-глюкозамина, полиманнуроновой кислоты, полиглюкуроновой кислоты, полигулуроновой кислоты, производных упомянутых полисахаридов или их комбинаций. Синтетический абсорбируемый полимер может представлять собой алифатический сложнополиэфирный полимер, алифатический сложнополиэфирный со-полимер или их комбинацию.

Желатин может быть в форме абсорбируемой гемостатической порошковой матрицы, губкообразной матрицы, пастообразной матрицы, гелеобразной матрицы или их комбинаций. К тому же желатин может являться поперечно сшитым и находиться в форме частиц с жидким носителем. Жидкий носитель может представлять собой нормальный физиологический раствор, причем желатин и пептид(ы) по существу однородно смешаны в сочетании с нормальным физиологическим раствором как с жидкой фазой. Концентрация желатина в упомянутом гемостатическом материале (порошок, губка, паста или гель) составляет от приблизительно 0,0025 ммоль до приблизительно 1,25 ммоль. Одна или несколько добавок или соединений может быть включена в гемостатическую смесь, выбранную из группы, состоящей из противомикробных агентов, поверхностно-активных веществ, антиоксидантов, увлажнителей, смачивающих агентов, лубрикантов, загустителей, разбавителей и стабилизаторов излучения. Кроме того, может быть добавлен глицерин в количестве, улучшающем экструзионное прессование.

В одном варианте осуществления, этот пептид конъюгирован с биосовместимым полимером. Биосовместимый полимер может представлять собой гидрофильный полимер, такой как полиэтиленгликоль, производные полиэтиленгликоля, полипропиленгликоль, полисахарид, модифицированный полисахарид, белок, модифицированный белок, пептид, полилактидгликолид, капролактон, триметиленкарбонат, крахмал, модифицированный крахмал, желатин, коллаген или их комбинации.

В альтернативном варианте, гидрофильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу, выбранную, чтобы обеспечить быстрый гемостаз или быстрое заживление ткани. Молекула полиэтиленгликоля может представлять собой линейную молекулу, разветвленную молекулу, звездообразную молекулу или их комбинацию. Молекулярная масса может быть в среднем от приблизительно 1000 дальтон до приблизительно 8000 дальтон, предпочтительно указанная молекулярная масса составляет в среднем 2000 или 5000 дальтон.

В альтернативном варианте осуществления гемостатический материал или материал для заживления тканей содержит последовательность аналогов аминокислот, полученную из последовательности SEQ ID NO: 1, где по меньшей мере одна аминокислота замещена соответствующим аналогом аминокислоты. Последовательность аналогов аминокислот может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и их комбинаций.

Настоящее изобретение также относится к способу обеспечения кровоостанавливающего лечения или заживления тканей в месте раны, включающего следующие этапы: (а) формирование гемостатического материала или материала для заживления тканей, как описано выше, и (b) нанесение гемостатического материала или материала для заживления тканей на место раны.

Настоящее изобретение также относится к способу получения гемостатического материала или материала для заживления тканей, включающему этапы: (а) получения пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1 или его последовательности аналогов аминокислот, причем указанный пептид дополнительно конъюгирован с полиэтиленгликолем; (b) получения абсорбируемого каркаса; и (с) смешивания указанного пептида с указанным абсорбируемым каркасом по существу гамогенно, формируя гемостатический материал или материал для заживления тканей.

В одном варианте осуществления гемостатический материал или материал для заживления тканей и способы, описанные выше, используют у пациента, имеющего гепаринизированную кровь или иначе содержащую агенты, предотвращающие образование сгустков или коагуляцию крови.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показаны данные времени до достижения гемостаза для нескольких исследованных систем.

На Фиг. 2 показаны данные времени до достижения гемостаза для нескольких исследованных систем.

На Фиг. 3 показаны данные времени до достижения гемостаза для нескольких исследованных систем.

На Фиг. 4 показаны данные времени до достижения гемостаза для нескольких исследованных систем.

На Фиг. 5 показаны данные времени до достижения гемостаза для нескольких исследованных систем.

На Фиг. 6 показаны данные времени до достижения гемостаза для нескольких исследованных систем.

На Фиг. 7 показаны данные времени до достижения гемостаза для нескольких исследованных систем в гепаринизированной крови.

На Фиг. 8 показаны данные времени до достижения гемостаза для двух исследованных систем в неактивированной модели тромбоцитов.

Подробное описание изобретения

Названия аминокислот и пептидов обычно сокращают, как показано ниже:

Обычное название	Символы	Систематическое название	Формула
Аланин	Ala	A	2-аминопропионовая кислота	CH3-CH(NH2)-COOH
Аргинин	Arg	R	2-амино-5-гуанидинопропионовая кислота	H2N-C(=NH)-NH-[CH2]3-CH(NH2)-COOH
Аспарагин	Asn	N	2-амино-3-карбамоил пропановая кислота	H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH
Аспарагиновая кислота	Asp	D	2-аминобутандикислота	HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH
Цистеин	Cys	C	2-амино-3-меркаптопропановая кислота	HS-CH2-CH(NH2)-COOH
Глутамин	Gln	Q	2-амино-4-карбамоилбутановая кислота	H2N-CO-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
Глутаминовая кислота	Glu	E	2-аминопентандиовая кислота	HOOC-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
Глицин	Gly	G	Аминоэтановая кислота	CH2(NH2)-COOH
Гистидин	His	H	2-амино-3-(1H-имидазол-4-ил)пропановая кислота
Изолейцин	Ile	I	2-амино-3-метилпентановая кислота	C2H5-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH
Лейцин	Leu	L	2-амино-4-метилпентановая кислота	(CH3)2CH-CH2-CH(NH2)-COOH
Лизин	Lys	K	2,6-диаминогексановая кислота	H2N-[CH2]4-CH(NH2)-COOH
Метионин	Met	M	2-амино-4-(метилтио)бутановая кислота	CH3-S-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
Фенилаланин	Phe	F	2-амино-3-фенилпропановая кислота	C6H5-CH2-CH(NH2)-COOH
Пролин	Pro	P	Пирролидин-2-карбоновая кислота
Серин	Ser	S	2-амино-3-гидроксипропановая кислота	HO-CH2-CH(NH2)-COOH
Треонин	Thr	T	2-амино-3-гидроксибутановая кислота	CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH
Триптофан	Trp	W	2-амино-3-(lH-индол-3-ил)пропановая кислота
Тирозин	Tyr	Y	2-амино-3-(4-гидроксифенил)пропановая кислота
Валин	Val	V	2-амино-3-метилбутановая кислота	(CH3)2CH-CH(NH2)-COOH

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения было определено, что 8-аминокислотный пептид, имеющий последовательность RFYVVMWK (Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys (SEQ ID NO: 1)), также называемый здесь RK-8 (необязательно PEG-конъюгированный или пегилированный), который может быть получен из белка человека TSP-1, имеет сильные гемостатические свойства и/или заживляющие ткани свойства при использовании в комбинации с каркасом, предпочтительно гемостатическим каркасным материалом.

Предпочтительные гемостатические каркасы являются натуральными или генно-инженерными абсорбируемыми полимерами или синтетическими абсорбируемыми полимерами или их смесями. Примерами натуральных или генно-инженерных абсорбируемых полимеров являются белки, полисахариды и их комбинации. Белки включают в себя протромбин, тромбин, фибриноген, фибрин, фибронектин, гепариназу, фактор X/Xa, фактор VII/VIIa, фактор IX/IXa, фактор XI/XIa, фактор XII/XIIa, тканевый фактор, батроксобин, анкрод, экарин, фактор фон Виллебранда, коллаген, эластин, альбумин, желатин, гликопротеины поверхности тромбоцитов, вазопрессин и аналоги вазопрессина, эпинефрин, селектин, прокоагулянтный яд, ингибитор активатора плазминогена, агенты, активирующие тромбоциты, синтетические пептиды гемостатического действия и/или их комбинации. Полисахариды включают без ограничения целлюлозу, алкилцеллюлозу, например, метилцеллюлозу, алкилгидроксиалкилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозу, сульфат целлюлозы, соли карбоксиметилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозу, карбоксиэтилцеллюлозу, хитин, карбоксиметилхитин, гиалуроновую кислоту, соли гиалуроновой кислоты, альгинат, альгиновую кислоту, пропиленгликольальгинат, гликоген, декстран, декстрансульфат, курдлан, пектин, пуллулан, ксантан, хондроитин, хондроитинсульфаты, карбоксиметилдекстран, карбоксиметилхитозан, хитозан, гепарин, гепаринсульфат, гепаран, гепарансульфат, дерматансульфат, кератансульфат, каррагинаны, хитозан, крахмал, амилозу, амилопектин, поли-N-глюкозамин, полиманнуроновую кислоту, полиглюкуроновую кислоту, полигулуроновую кислоту, производные любых упомянутых выше веществ. Примеры синтетических абсорбируемых полимеров представляют собой алифатические сложнополиэфирные полимеры, со-полимеры и/или их комбинации. Алифатические полиэфиры, как правило, синтезируют путем полимеризации с раскрытием цикла мономеров, включая, помимо прочего, молочную кислоту, лактид (включая L-, D-, мезо и D-, L-смеси), гликолевую кислоту, гликолид, ε-капролактон, п-диоксанон (1,4-диоксан-2-он) и триметиленкарбонат (1,3-диоксан-2-он). В одном варианте осуществления натуральный абсорбируемый полимер представляет собой желатин, например, SURGIFLO^TM, от компании «Ethicon, Inc», который представляет собой сшитый желатин в форме частиц, смешанный с жидким носителем и газовым компонентом в устройстве доставки, таком как шприц.

В одном из вариантов осуществления используется последовательность аналогов аминокислот, при этом по меньшей мере одна аминокислота в последовательности SEQ ID NO: 1 замещена аналогом или биологически подобной аминокислотой. Таблица аналогов или биологически подобных аминокислот приводится ниже:

Обычное название	Символы	Аналоги или биологически подобные аминокислоты
Аргинин	Arg	R	His (H), Lys (K)
Лизин	Lys	K	Arg (R), His (H)
Метионин	Met	M	Ala (A), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Trp (W), Tyr (Y), Val (V), Cys (C), Ser (S)
Триптофан	Trp	W	Ala (A), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Met (M), Tyr (Y), Val (V), His (H)
Тирозин	Tyr	Y	Ala (A), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Met (M), Trp (W), Val (V), His (H)
Валин	Val	V	Ala (A), Ile (I), Leu (L), Phe (F), Met (M), Trp (W), Val (V)
Фенилаланин	Phe	F	Trp (W), Tyr (Y), His (H), Ile (I), Leu (L)

Аминокислоты могут быть в форме L, D или их производных [например, псевдо аминокислота, функционализированная аминокислота (например, фторированная аминокислота … и т.д.), бета-аминокислота, гамма-аминокислота … и т.д.]. Примерами особенно предпочтительных аналогичных пептидов последовательности пептидов SEQ ID NO: 1 являются:

KRFYVVMWKK

(Lys-Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-Lys (SEQ ID NO: 2))

RFYVVM (Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met (SEQ ID NO: 3))

FIRVVMYEGKK

(Phe-Ile-Arg-Val-Val-Met-Tyr-Glu-Gly-Lys-Lys (SEQ ID NO: 4))

IRVVM (Ile-Arg-Val-Val-Met (SEQ ID NO: 5))

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения пептид дополнительно конъюгирован с биосовместимым полимером, более предпочтительно, с гидрофильным полимером. Гидрофильный полимер может представлять собой полиэтиленгликоль, производные полиэтиленгликоля, полипропиленгликоль, полисахарид, модифицированный полисахарид, белок, модифицированный белок, полипептид, полилактидгликолид, капролактон или триметиленкарбонат и/или их комбинации.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения амино пептиды, содержащие последовательность SEQ ID NO: 1 для гемостаза, которые объединены с каркасом (например, желатином), обеспечивают следующие преимущества: низкая молекулярная масса пептидов, таких как SEQ ID NO:1, являются более стабильными, чем большие белковые гемостатические агенты, такие как тромбин, и могут храниться без охлаждения. Крупномасштабное производство пептидов может выполняться посредством технологии рекомбинантной ДНК или химического пептидного синтеза, причем оба способа более экономически эффективны, чем очистка биологических продуктов (например, тромбина). Амино пептид SEQ ID NO: 1 и аналоговые пептиды, которые сопряжены с PEG, предпочтительно имеют улучшенную растворимость пептида. Кроме того, было обнаружено, что пегилированные пептиды более эффективны при более низких концентрациях для гемостаза и хорошо работают в гепаринизированной крови.

К тому же настоящее изобретение относится к методу проведения гемостатического лечения кровоточащих мест, включающему этапы приготовления гемостатического препарата, описанного выше, и к методу применения гемостатического препарата в местах кровотечения.

Настоящее изобретение также относится к способу получения полужидкого гемостатического препарата, включающему в себя этап смешивания гемостатической матрицы с агентом, способствующим гемостазу, содержащим аминокислотный пептид SEQ ID NO: 1 и/или его последовательность аналогов аминокислот, и этап нанесения полученного материала на место раны.

Описание носителей желатина. Желатиновым материалом в настоящем изобретении предпочтительно является жидкостно-проницаемая, нерастворимая в воде желатиновая губка или паста. Желатин, являющийся денатурируемой формой белка коллагена, используется в различных повязках на рану. Поскольку желатиновые гели имеют довольно низкую точку плавления, они не очень стабильны при температуре тела. Таким образом, обязательно нужно стабилизировать эти гели, устанавливая поперечные сшивки между цепочками белков. На практике, это достигается обычно обработкой желатина глутаральдегидом или формальдегидом или в ходе термообработки. Таким образом, сшитый желатин может быть сформирован в виде сухих губок, которые используются для провоцирования гемостаза в кровоточащих ранах, или переведен в форму пылевидного аэрозоля.

Используемый в настоящей заявке термин «гель» используется для обозначения разбухшей, гидратированной полимерной сети, по существу сплошной по объему. Белковый гель состоит из по существу сплошной сети соединенных молекул белка и жидкого (обычно водного) растворителя, который заполняет объем внутри белковой матрицы. Белковая матрица оказывает сильное вязкое сопротивление на молекулы растворителя, предотвращая их свободное течение. Составляющие гелевую сеть молекулы могут быть связаны ионными, гидрофобными, металлическими или ковалентными связями. Ковалентная связь является наиболее термически стабильной из перечисленных связей.

В одном варианте осуществления изобретения, стерильные композиции настоящего изобретения могут содержать твердые, пористые или непористые частицы биосовместимого полимера, подходящего для использования в гемостазе, биосовместимую жидкость и описанный выше гемостатический экстракт в качестве его трех основных составляющих. Частицы, жидкость и гемостатический экстракт соединяются и смешиваются при условиях, позволяющих получить практически однородное соединение, содержащее сплошную жидкую фазу, в состав которой входит гемостатический экстракт, и в которой гомогенно распределены твердые полимерные частицы. Количество и средний диаметр частиц, содержащихся в соединении, и относительное количество твердых частиц, жидкости и гемостатического экстракта эффективно для того, чтобы соед