Способ лечения аутоиммунного заболевания с использованием биосовместимых биоабсорбируемых наносфер

Способ лечения аутоиммунного заболевания с использованием биосовместимых биоабсорбируемых наносфер

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] В данной заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.С. § 119(е) предварительной заявки на патент США 61/387,873 поданной 29 сентября 2010, включенной сюда во всей полноте путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Данное изобретение касается композиций и способов, относящихся к иммунологии и медицине. В частности, данное изобретение касается диагностических и терапевтических средств для диагностирования и лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, диабета.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Вакцинация антигенами может применяться для индукции Т-клеточной толерантности при аутоиммунных процессах. Введение белковых или пептидных аутоантигенов в растворе может ослабить начало и/или прогрессирование аутоиммунных процессов в экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний (Wraith et al., 1989; Metzler and Wraith, 1993; Liu and Wraith, 1995; Anderton and Wraith, 1998; Karin et al., 1994). Однако, ограниченные клинические испытания у людей с применением аналогичных подходов практически все оказались неудачными (Weiner, 1993; Trentham et al., 1993; McKown et al., 1999; Pozzilli et al., 2000; Group, D.P.T.-T.D.S. 2002; Kappos et al., 2000; Bielekova et al., 2000). Это позволяет предположить, что принципы, на которых основан выбор лечения и их условия, являются нечеткими и, в результате, являются не подходящими для человека.

[0004] Спонтанные органоспецифичные аутоиммунные нарушения возникают в результате сложных ответных реакций на многочисленные эпитопы большого числа антигенов, появляющихся спонтанно в случайной и зачастую непредсказуемой последовательности. Ситуация усугубляется тем, что клоны лимфоцитов, распознающие идентичные эпитопы, захватывают комплексы антиген/молекула главного комплекса гистосовместимости (МНС) с авидностью, варьирующей в широких пределах, прочность этих связей коррелирует с патогенным потенциалом (Amrani et al., 2000; Santamaria, 2001; Liblau et al., 2002). Следовательно, конечный результат любого метода иммунизации для предупреждения аутоиммунных нарушений может зависеть от выбора аутоантигена(ов), дозировки, периодичности лечения и способа и формы введения.

[0005] Диабет 1 типа (СД1) у мышей связан с аутореактивными CD8⁺ Т-клетками. У мышей NOD (от англ. non-obese diabetic) развивается форма СД1, близко напоминающая СД1 человека, вследствие селективного разрушения β клеток поджелудочной железы Т-клетками, распознающими растущий перечень аутоангигенов (Lieberman and DiLorenzo, 2003). Несмотря на то, что для возникновения СД1 явно необходимо участие CD4⁺ клеток, существуют убедительные доказательства, что СД1 является зависимым от CD8⁺ Т-клеток (Santamaria, 2001; Liblau et al., 2002). Было обнаружено, что существенная доля ассоциированных с панкреатическими островками CD8⁺ клеток мышей NOD имеют CDR3-инвариантные Vα17-Jα42⁺ TCR, обозначаемые «8.3-TCR-подобные» (Santamaria et al., 1995; Verdaguer et al., 1996; Verdaguer et al., 1997; DiLorenzo et al., 1998). Эти клетки, распознающие мимеотоп NRP-A7 (определенный с применением комбинаторных пептидных библиотек) в контексте K^d молекулы МНС (Anderson et al., 1999), уже являются существенным компонентом самых ранних CD8⁺ инфильтратов панкреатических островков мышей NOD (DiLorenzo et al., 1998; Anderson et al., 1999; Amrani et al., 2001), являются диабетогенными (Verdaguer et al., 1996; Verdaguer et al., 1997) и направленно воздействуют на пептид островково-специфичного гомологичного каталитической субъединице глюкозо-6-фосфатазы белка (IGRP) (Lieberman et al., 2003), белка с неизвестной функцией (Arden et al., 1999; Martin et al., 2001). CD8⁺ клетки, распознающие этот пептид (IGRP_206-214, схожий с NRP-A7), содержатся в кровотоке в необычайно высокой концентрации (>1/200 CD8⁺ клеток) (Lieberman et al., 2003; Trudeau et al., 2003). Следует отметить, что прогрессирование инсулита в диабет у мышей NOD неизменно сопровождается циклическим увеличением пула циркулирующих способных реагировать с IGRP_206-214 CD8⁺ клеток (Trudeau et al., 2003) и созреванием авидности их ассоциированных с островками аналогов (Amrani et al., 2000). Недавно было показано, что ассоциированные с островками CD8⁺ клетки мышей NOD распознают множество эпитопов IGRP, что указывает на то, что IGRP представляет собой преобладающий аутоантиген для CD8⁺ клеток, по меньшей мере, при СД1 мышей (Han et al., 2005). Ассоциированные с островками CD8⁺ клетки мышей NOD, в частности те, что обнаруживаются в ранней стадии развития заболевания, также распознают эпитоп инсулина (Ins B_15-23 (Wong et al., 1999)).

[0006] Ассоциативные исследования позволили предположить, что некоторые аллели HLA класса I (т.е. HLA-A*0201) обусловливают предрасположенность к СД1 человека (Fennessy et al., 1994; Honeyman et al., 1995; Tait et al., 1995; Nejentsev et al., 1997; Nakanishi et al., 1999; Robles et al., 2002). Патологические исследования показали, что очаги поражения при инсулите у впервые диагностированных пациентов состоят преимущественно из (рестриктированных по HLA класса I) CD8⁺ Т-клеток (Bottazzo et al., 1985; Atkinson and Maclaren, 1990; Castano and Eisenbarth, 1990; Hanninen et al., 1992; Itoh et al., 1993; Somoza et al., 1994; Atkinson and Maclaren, 1994; Moriwaki et al., 1999; Imagawa et al., 2001), которые также представляют собой преобладающую клеточную популяцию у пациентов, которым была проведена изотрансплантация (от однояйцевых близнецов) или аллотрансплантация (от родственных доноров) поджелудочной железы (Sibley et al., 1985; Santamaria etal., 1992).

[0007] Инсулин представляет собой ключевую мишень для антительного и CD4⁺ ответа при СД1 как у мыши, так и у человека (Wong et al., 1999; Palmer et al., 1983; Chentoufi and Polychronakos, 2002; Toma et al., 2005; Nakayama et al., 2005; Kent et al., 2005). HLA-A*0201 презентируют эпитоп hInsB_10-18 В цепи инсулина человека аутореактивным CD8⁺ клеткам, как у реципиентов, которым пересаживают панкреатические островки (Pinkse et al., 2005), так и в ходе спонтанного развития заболевания (Toma et al., 2005). Кроме того, было идентифицировано четыре дополнительных пептида мышиного пре-проинсулина 1 или 2, которые распознаются ассоциированными с островками CD8⁺ Т-клетками HLA-A*0201-трансгенных мышей в контексте HLA-A*0201.

[0008] IGRP, кодируемый геном (расположенным на хромосоме 2q28-32 (Martin et al., 2001)), перекрывающимся с локусом предрасположенности к СД1, IDDM7 (2q31) (Pociot and McDermott, 2002; Owerbach, 2000), был также недавно идентифицирован в качестве бета-клеточного аутоантигена, имеющего потенциальное значение при СД1 человека (Takaki et al., 2006). Два эпитопа IGRP человека (hIGRP_228-236 и hIGRP_265-273), связывающих HLA-A*0201, распознаются ассоциированными с островками CD8⁺ клетками мышей NOD, не имеющих МНС I класса и экспрессирующих HLA-A*0201 трансген (Takaki et al., 2006). Следует отметить, что ассоциированные с островками CD8⁺ Т-клетки этих «гуманизированных» HLA-A*0201-трансгенных мышей были цитотоксическими по отношению к HLA-A*0201-положительным панкреатическим островкам человека (Takaki et al., 2006).

[0009] СД1 у мышей NOD можно предотвратить путем увеличения числа аутореактивных CD8⁺ Т-клеток с низкой авидностью. Введение растворимых пептидов (без адъюванта) представляет собой эффективный способ индукции антиген-специфичной Т-клеточной толерантности (Aichele et al., 1994; Toes et al., 1996). Ранее было показано, что терапия мышей NOD с преддиабетом растворимым NRP-A7 ослабляла созревание авидности субпопуляции IGRP_206-214-реактивных CD8⁺ клеток путем селективной элиминации клонотипов, экспрессирующих TCRs с наиболее высокой аффинностью к пептиду/МНС (Amrani et al., 2000). Эти наблюдения позволили предположить, что анти-СД1 активность NRP-A7 также опосредована тем, что он способствует заселению «ниши высокоавидных клонотипов» (опустошенной терапией NRP-A7) клонами с ‘низкой авидностью’ (и потенциально антидиабетогенными). Для проверки этой гипотезы были идентифицированы измененные пептидные лиганды (APL) обладающие частичной, полной или наивысшей агонистической активностью в отношении IGRP_206-214-реактивных CD8⁺ Т-клеток и проведено сравнение их анти-СД1 активности в большом диапазоне доз.

[0010] Хроническое лечение умеренными дозами APL (NRP-A7) средней аффинности или высокими дозами низкоаффинных APL (NRP-I4) обеспечивало защиту от СД1. Это было связано с локальным накоплением низкоавидных IGRP_206-214-реактивных CD8⁺ клеток за счет элиминации их высокоавидных аналогов. Неожиданным оказалось то, что хроническое лечение высокими дозами высокоаффинных APL (NRP-V7) или естественного лиганда (IGRP_206-214) обеспечивало только незначительную защиту. Удивительно, что островки этих мышей практически не содержали IGRP_206-214-реактивных CD8⁺ клеток, но имели увеличенную популяцию CD8⁺ клеток, распознающих другие эпитопы IGRP. Это позволило авторам изобретения сделать вывод, что пептидная терапия при аутоиммунных нарушениях может быть наиболее эффективной, когда она способствует заселению лимфоцитарной ниши органа-мишени непатогенными клонами с низкой авидностью (Han et al., 2005), это предположение было подтверждено путем математического моделирования (Maree et al., 2006). К сожалению, такой результат наблюдался только в узком диапазоне доз и авидности APL (в отношении TCR-мишеней), что предполагало, что пептидная терапия плохо подходит для предупреждения или лечения СД1.

[0011] Таким образом, существует потребность в дополнительных композициях и связанных с ними способах лечения диабета, а также других аутоиммунных нарушений.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Было бы тяжело лечить пациента пептидами, поскольку, как в случае IGRP, это бы требовало несколько миллиграммов пептида на каждую дозу. Здесь предложена доставка комплексов антиген/МНС, например, комплексов пептид/МНС/наносфера (без ко-стимулирующих молекул), на биологически совместимых, биоабсорбируемых наносферах. Предполагается, что эти комплексы будут более толерогенными по сравнению с пептидами в отдельности или с комплексами небиоабсорбируемых наносфер.

[0013] Аспекты и воплощения этой заявки включают разработку новой концепции терапии аутоиммунных процессов. Обычно вакцины применяли для увеличения числа Т-клеток, способных обеспечивать защиту от патогенов или онкологического заболевания, или для элиминации Т-клеток, способных вызывать аутоиммунные процессы. Аспекты данного изобретения относятся к новому типу «вакцины», которая избирательно индуцирует увеличение числа аутореактивных CD8⁺ клеток с противоаутоиммунными свойствами и, в то же время, элиминацию аутореактивных CD8⁺ клеток с патогенными (аутоиммунными) свойствами, и то, и другое обусловлено антигенной специфичностью Т клеток. Противоаутоиммунные аутореактивные CD8⁺ Т-клетки (анти-патогенные CD8⁺ клетки) подавляют ответ аутореактивных Т-клеток тканеспецифичным (после спонтанного рекрутирования в ткань-мишень), но антиген-неспецифичным образом (например, за счет локального подавления ответов других аутореактивных Т-клеток). В результате, лечение вакцинами такого типа может предотвращать возникновение и/или облегчать СД1, а также восстанавливать нормогликемию или снижать уровень глюкозы у мышей NOD с гипергликемией без развития генерализованной иммуносупрессии. Данная стратегия может использоваться при лечении других аутоиммунных заболеваний, опосредуемых Т-клетками, и может быть способна предупреждать повторное проявление СД1 после трансплантации панкреатических островков.

[0014] Некоторые воплощения данного изобретения относятся к способам селективного снижения или увеличения числа Т-клеток, в зависимости от антигенной специфичности Т-клеток. Таким образом, предполагают, что данное изобретение может применяться для снижения числа или удаления Т-клеток, распознающих аутоантигены, таких как Т-клеток, специфичных в отношении панкреатических клеток. Так, данное изобретение может применяться для предупреждения, лечения или облегчения аутоиммунных заболеваний, таких как ИЗСД. Кроме того, данное изобретение может применяться для увеличения числа необходимых Т-клеток, таких как Т-клетки, распознающие опухолевые антигены, для предупреждения, лечения и/или облегчения заболеваний, с которыми борются эти Т-клетки.

[0015] Воплощения изобретения касаются способов диагностики, предупреждения или лечения аутоиммунного нарушения, включающих введение комплекса антиген/МНС/биологически совместимая биоабсорбируемая наносфера индивиду в количестве, достаточном для увеличения числа антипатогенных аутореактивных Т клеток. Антиген включает любую или некоторые из молекул пептида, нуклеиновой кислоты, углевода, липида или другую молекулу или соединение, способное модулировать активность Т клеток или популяции Т клеток в контексте МНС или молекулы, подобной МНС, связанной с субстратом, но не ограничивается ими. Биоабсорбируемость комплексов с наносферами является критически важной для изобретения, поскольку препятствует долговременному накоплению наносфер in vivo и какую-либо связанную с этим токсичность.

[0016] Воплощения изобретения включают толерогенные наносферы, включая биологически совместимые биоабсорбируемые наносферы, связанные с комплексом антиген-МНС. Комплекс антиген-МНС может быть связан с такими наносферами напрямую или посредством линкера. Предпочтительные наносферы могут также включать биологически совместимое биоабсорбируемое металлическое ядро и биодеградируемое биоабсорбируемое покрытие. Наносфера может также содержать покрытие или оболочку, состоящие из других молекул, которые могут быть легко присоединены к комплексу антиген-МНС (например, стрептавидин или авидин или другие известные молекулы, применяемые для присоединения компонентов к наносферам). В некоторых аспектах биологически совместимые биодеградируемые наносферы содержат материал, выбранный из группы, состоящей, например, из оксида железа III, трикальций фосфата, хрома, галлия, а также биологически совместимых биоабсорбируемых полимеров, таких как PGLA, PLLA, PGA, PDLLA, PCL, PDLGA, PLDLA, PLC (все из них можно приобрести у Zeus, 3737 Industrial Blvd, Orangeburg, SC, 29118 USA под торговым названием Absorv™), гиалуроновой кислоты, альгината, полигидроксиалканоатов и т.п. В следующих аспектах биологически совместимая биоабсорбируемая наносфера представляет собой металлическую или намагничиваемую или суперпарамагнитную наносферу. Биологически совместимая биоабсорбируемая наносфера может также содержать биодеградируемое покрытие, образованное из декстранов; поли(этиленгликоля); поли(этиленоксида); маннитола; поли(гидроксалканоата) из класса PHB-PHV и других модифицированных полисахаридов, таких как крахмал, целлюлоза и хитозан.

[0017] Некоторые аспекты изобретения включают способы и композиции, касающиеся антигенных композиций, включающих сегменты, фрагменты или эпитопы полипептидов, пептидов нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и других молекул, которые провоцируют или индуцируют антигенный или иммунный ответ, как правило, обозначаемых антигенами. В конкретных аспектах антиген является производным, миметиком или аутореактивным антигеном и/или их комплексом.

[0018] Пептиды и антигены включают hInsB_10-18 (HLVEALYLV (SEQ ID NO:1)), hIGRP_228-236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2)), hIGRP_265-273 (VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3)), IGRP_206-214 (VYLKTNVFL (SEQ ID NO:4)), NRP-A7 (KYNKANAFL (SEQ ID NO:6)), NRP-14 (KYNIANVFL (SEQ ID NO:7)), NRP-V7 (KYNKANVFL (SEQ ID NO:8)), YAI/D^b (FQDENYLYL (SEQ ID NO:9)) и/или INS B_15-23 (LYLVCGERG (SEQ ID NO:10)), а также пептиды и белки, описанные в публикации U.S. 20050202032, включенной сюда во всей полноте путем ссылки, но не ограничиваются ими.

[0019] В некоторых аспектах пептидный антиген для лечения СД1 представляет собой GAD65_114-123, VMNILLQYW (SEQ ID NO:14); GAD65_536-545, RMMEYGTTMV (SEQ ID NO:15); GFAP_143-151, NLAQTDLATV (SEQ ID NO:16); GFAP_214-222, QLARQQVHV (SEQ ID NO:17); IA-2_172-180, SLSPLQAEL (SEQ ID NO:18); IA-2_482-490, SLAAGVKLL (SEQ ID NO:19); IA-2_805-813, VIVMLTPLV (SEQ ID NO:20); ppIAPP_5-13, KLQVFLIVL (SEQ ID NO:21); ppIAPP_9-17, FLIVLSVAL (SEQ ID NO:22); IGRP_152-160, FLWSVFMLI (SEQ ID NO:23); IGRP_211-219, NLFLFLFAV (SEQ ID NO:24); IGRP_215-223, FLFAVGFYL (SEQ ID NO:25); IGRP_222-230, YLLLRVLNI (SEQ ID NO:26); IGRP_228-236, LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2); IGRP_265-273, VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3); IGRP_293-301, RLLCALTSL (SEQ ID NO:27); про-инсулин_L2-10, ALWMRLLPL (SEQ ID NO:28); про-инсулин_L3-11, LWMRLLPLL (SEQ ID NO:29); про-инсулин_L6-14, RLLPLLALL (SEQ ID NO:30); про-инсулин_B5-14, HLCGSHLVEA (SEQ ID NO:31); про-инсулин_B10-18, HLVEALYLV (SEQ ID NO:1); про-инсулин_B14-22, ALYLVCGER (SEQ ID NO:32); про-инсулин_B15-24, LYLVCGERGF (SEQ ID NO:33); про-инсулин_B17-25, LVCGERGFF (SEQ ID NO:34); про-инсулин_B18-27, VCGERGFFYT (SEQ ID NO:35); про-инсулин_B20-27, GERGFFYT (SEQ ID NO:36); про-инсулин_B21-29, ERGFFYTPK (SEQ ID NO:37); про-инсулин_B25-C1, FYTPKTRRE (SEQ ID NO:38); про-инсулин_B27-C5, TPKTRREAEDL (SEQ ID NO:39); про-инсулин_C20-28, SLQPLALEG (SEQ ID NO:40); про-инсулин_C25-33, ALEGSLQKR (SEQ ID NO:41); про-инсулин_C29-А5, SLQKRGIVEQ (SEQ ID NO:42); про-инсулин_А1-10, GIVEQCCTSI (SEQ ID NO:43); про-инсулин_А2-10, IVEQCCTSI (SEQ ID NO:44); про-инсулин_А12-20, SLYQLENYC (SEQ ID NO:45) или их комбинацию.

[0020] В следующих аспектах могут применяться пептидные антигены, связанные с рассеянным склерозом (PC), включающие: MAG_287-295, SLLLELEEV (SEQ ID NO:46); MAG_509-517, LMWAKIGPV (SEQ ID NO:47); MAG_556-564, VLFSSDFRI (SEQ ID NO:48); МВРI_110-118, SLSRFSWGA (SEQ ID NO:49); MOG_114-122, KVEDPFYWV (SEQ ID NO:50); MOG_166-175, RTFDPHFLRV (SEQ ID NO:51); MOG_172-180, FLRVPCWKI (SEQ ID NO:52); MOG_179-188, KITLFVIVPV (SEQ ID NO:53); MOG_188-196, VLGPLVALI (SEQ ID NO:54); MOG_181-189, TLFVIVPVL (SEQ ID NO:55); MOG_205-214, RLAGQFLEEL (SEQ ID NO:56); PLP_80-88, FLYGALLLA (SEQ ID NO:57) или их комбинацию.

[0021] В некоторых аспектах комплекс антиген-МНС может быть сшит (конъюгирован) с описанными здесь наносферами. Один из способов конъюгирования наносфер с комплексом антиген-МНС, не являющийся исчерпывающим, включает (а) реакцию комплекса антиген-МНС с конъюгирующим агентом, приводящую к формированию комплекса антиген-МНС-; и (б) реакцию биологически совместимых биодеградируемых наносфер с комплексом, образованным на этапе (а). В одном воплощении способ включает концентрирование комплекса, образованного на этапе (а) перед осуществлением этапа (б). В другом воплощении конъюгирующий агент содержит гетеробифункциональный агент.В следующем воплощении конъюгирующий агент содержит DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол), сульфо-LC-SMPT (сульфосукцинимидил-6-(α-метил-α-(2-пиридилтио)толуамидо)гексаноат, реагент Трота (2-иминотиолан-HCl) или любую их комбинацию. См. Публикацию U.S. 20070059775; патенты США 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; 4,589,071; 7,186,814 и 5543391 заявку на европейский патент 188,256, в которых обсуждается конъюгирование комплексов с микрочастицами или наночастицами.

[0022] Аутоиммунное нарушение может включать сахарный диабет, реакцию отторжения трансплантата, рассеянный склероз, синдром истощения яичников, склеродермию, болезнь Шегрена, волчанку, витилиго, алопецию (облысение), полигландулярную недостаточность, диффузно-токсический зоб, гипотиреоидизм, полимиозит, пемфигоид, болезнь Крона, колит, аутоиммунный гепатит, гипопитуитаризм, миокардит, болезнь Аддиссона, аутоиммунные заболевания кожи, увеит, пернициозную анемию, гипопаратиреоидизм, и/или ревматоидный артрит, но не ограничивается ими. В некоторых воплощениях пептидный компонент комплекса антиген/МНС/наносфера получают или создают на основе аутоантигена или эпитопа аутоантигена или его миметика, играющего активную роль в аутоиммунном ответе, который надлежит исследовать, снижать интенсивность, или ослаблять воздействием терапии. В конкретных воплощениях аутоантиген представляет собой пептид, углевод или липид. В некоторых аспектах аутоантиген представляет собой фрагмент, эпитоп или пептид белка, углевод или липид, экспрессируемый некоторыми клетками индивида, такими как бета-клетки поджелудочной железы, и включает фрагмент IGRP, инсулина, GAD или белка IA-2, но не ограничивается ими. При различных аутоиммунных состояниях были идентифицированы разнообразные протеины или эпитопы. Аутоантиген может представлять собой пептид, углевод, липид или т.п., полученные из второго эндокринного или нейрокринного компонента, например, околоостровковых клеток Шванна или им подобных.

[0023] В следующих аспектах данного изобретения компонент МНС комплекса антиген/МНС/наносфера представляет собой классический или неклассический полипептидный компонент МНС класса I или МНС класса II. Компонент МНС класса I может содержать любую или некоторые из молекул HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, в частности, любую или некоторые из таких молекул как молекула HLA-A*0201 МНС класса I. Неклассический компонент МНС класса I может содержать CD1-подобные молекулы. Компонент МНС класса II может содержать любую или некоторые из молекул HLA-DR, HLA-DQ или HLA-DP. В некоторых аспектах комплекс антиген/МНС ковалентно или нековалентно связан или присоединен к субстрату (комплексу антиген/МНС/наносфера). Как правило, субстрат представляет собой биологически совместимую абсорбируемую наносферу. В одном воплощении наносфера содержит металл, например, железо или оксид железа. В другом воплощении наносфера содержит биосовместимый биоабсорбируемый полимер. В любом случае наносфера претерпевает биоабсорбцию in vivo, так что накопление наночастиц in vivo ограниченно. Пептиды по изобретению могут быть химически связаны с субстратом и в частности, связаны посредством химического или пептидного линкера. Молекулы CD1 являются примером неклассических молекул МНС.Неклассические молекулы МНС характеризуются как не-полиморфные, консервативные у различных видов и имеющие узкие глубокие гидрофобные лиганд-связывающие карманы. Эти связывающие карманы способны презентировать гликолипиды и фосфолипиды естественным киллерным Т-клеткам (NKT-клеткам). NKT-клетки представляют собой уникальную популяцию лимфоцитов, ко-экспрессирующую маркеры NK-клеток и полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR). Они задействованы в регуляции иммунных ответов, связанных с широким спектром заболеваний.

[0024] В некоторых воплощениях Т клетки, число которых было увеличено под воздействием терапии, были пре-активированы в ходе патологического процесса и обладают фенотипом клеток памяти. В одном аспекте Т клетки происходят от аутореактивных предшественников, распознающих эпитоп-мишень с низкой авидностью. Авидность может быть определена при помощи теста связывания тетрамеров или аналогичным способом. В следующем аспекте комплекс антиген/МНС/наносфера вводят до, после или и до, и после появления клинических симптомов аутоиммунного заболевания, представляющего интерес. В еще одном аспекте способ может содержать этап, включающий оценку биологических параметров аутоиммунного состояния, таких как уровень глюкозы крови субъекта перед и/или после лечения. Способы по изобретению могут также включать оценку аутоиммунного статуса субъекта, включая оценку любого аутореактивного иммунного ответа. В некоторых аспектах Т клетка представляет собой CD4⁺ или CD8⁺ Т клетку или NK Т (NKT) клетку.

[0025] Следующие воплощения изобретения включают способы увеличения числа антипатогенных аутореактивных Т клеток, включая введение комплекса антиген/МНС/наносфера в количестве, достаточном для стимуляции увеличения числа антипатогенных аутореактивных Т клеток. В некоторых аспектах Т клетка представляет собой CD8⁺ или CD4⁺ Т клетку или NKT клетку.

[0026] В следующих воплощениях изобретение включает способы защиты клеток субъекта, таких как клеток островков поджелудочной железы, от аутоиммунного ответа, в частности, патогенного аутоиммунного ответа, включающие введение индивиду комплекса антиген/МНС/наносфера в количестве, достаточном для ингибирования деструкции клеток или тканей, содержащих клетки, где антиген или антигенная молекула, из которой он получен, происходит от аутоантигена, связанного с клетками.

[0027] В следующем воплощении изобретение включает способы диагностирования аутоиммунных процессов, включающие оценку вызванного терапией усиления антипатогенных CD8⁺ или CD4⁺ Т клеточных ответов как индикатора активного аутоиммунного процесса.

[0028] Воплощения изобретения могут включать способы предупреждения, облегчения или лечения отторжения трансплантированных тканей за счет аллогенного или аутоиммунного ответа при помощи введения субъекту комплекса антиген/МНС функционально связанного с субстратом (т.е. комплекса антиген/МНС/наносфера) в количестве, достаточном для увеличения числа антипатогенных аутореактивных Т клеток или индукции пролиферации антипатогенных клеток, распознающих аллоантигены или аутоантигены, экспрессируемые трансплантируемыми тканями или органами.

[0029] В воплощениях изобретения предложены способы повышения или поддержания количества функциональных клеток заданного типа у млекопитающего, например, островковых клеток, путем предупреждения или ингибирования клеточной гибели или киллинга. В некоторых воплощениях этот способ применяют для лечения аутоиммунного заболевания, когда требуется регенерация эндогенных клеток и/или тканей. Такие аутоиммунные заболевания включают сахарный диабет, рассеянный склероз, синдром истощения яичников, склеродермию, болезнь Шегрена, волчанку, витилиго, алопецию (облысение), полигландулярную недостаточность, диффузно-токсический зоб, гипотиреоидизм, полимиозит, пемфигоид, болезнь Крона, колит, аутоиммунный гепатит, гипопитуитаризм, миокардит, болезнь Аддиссона, аутоиммунные заболевания кожи, увеит, пернициозную анемию, гипопаратиреоидизм, ревматоидный артрит и т.п, но не исчерпываются ими. В одном аспекте изобретения предложен новый двухкомпонентный терапевтический подход для прекращения существующего аутоиммунного процесса в ходе переобучения иммунной системы.

[0030] В некоторых аспектах комплекс антиген/МНС/наносфера не нуждается в совместном введении адъюванта для индукции иммунного ответа, например, антительного ответа. В конкретных воплощениях композиция антиген/МНС/наносфера может применяться вместе с известными технологиями получения поликлональных и моноклональных антител для получения антитела с применением пониженного количества адъювантов или без их применения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0031] Следующие рисунки являются частью данного описания и включены для наглядного представления некоторых аспектов данного изобретения. Ссылки на графические материалы в сочетании с подробным описанием воплощений, представленным в данном документе, дают возможность лучше понять изобретение.

[0032] Фиг.1А-1С. Низкоаффинные аутореактивные 17.6α/8.3β CD8⁺ Т клетки являются анти-диабетогенными. Фиг.1А, частота возникновения диабета у мышей 17.6α/8.3β-NOD (n=95) в сравнении с мышами 17.4α/8.3β-NOD (n=598). Фиг.1В, индекс инсулита у трансгенных мышей (n=6 для 17.6α/8.3β-NOD, n=3 для 17.4α/8.3β-NOD). Фиг.1C, частота возникновения диабета у мышей NOD (n=56) в сравнении с LCMV-NOD (n=10).

[0033] Фиг.2А-2В. Развитие Т-клеток, несущих 17.6α/8.3β TCR. Фиг.2А, Развитие Т-клеток трансгенных мышей, несущих 17.6α/8.3β TCR или 17.4α/8.3β TCR. На верхних панелях представлены репрезентативные графики, показывающие экспрессию CD4 и CD8 у спленоцитов. На нижней панели сравниваются CD8⁺ Т клетки, связанные с NRP-V7/K^d тетрамером. Фиг.2В, Развитие Т-клеток, несущих 17.6α/8.3β TCR или 17.4α/8.3β TCR, у трансгенных мышей RAG-2-/-. На верхних панелях представлены репрезентативные графики, показывающие экспрессию CD4 и CD8 у спленоцитов. На нижней панели сравниваются CD8⁺ Т клетки, связанные с NRP-V7/K^d тетрамером.

[0034] Фиг.3. Частота возникновения диабета у мышей 17.6α/8.3β-NOD.RAG-2-/- (n=13) в сравнении с мышами 17.4α/8.3β-NOD.RAG-2-/- (n=106).

[0035] Фиг.4А-4В. Развитие Т-клеток, несущих 17.6α/8.3β TCR или 17.4α/8.3β TCR, у трансгенных мышей TCRα-7-. Фиг.4А, На верхних панелях представлены репрезентативные графики, показывающие экспрессию CD4 и CD8 у спленоцитов. На нижней панели сравниваются CD8⁺ Т клетки, связанные с NRP-V7/K^d тетрамером. Фиг.4В, Частота диабета у мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- (n=14) в сравнении с мышами 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/- (n=28). Значения на точечных диаграммах проточной цитометрии соответствуют процентному содержанию клеток в каждом секторе, а значения на гистограммах соответствуют процентному содержанию позитивных клеток (среднее значение±станд. ошибка).

[0036] Фиг.5A-5J. 17.6α/8.3β CD8⁺ Т клетки спонтанно дифференцируются в Т-клетки памяти с регуляторной функцией. Фиг.5А, репрезентативные профили CD8⁺ Т клеток селезенки мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- в сравнении с клетками мышей 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-, полученные при помощи FACS-анализа. Фиг.5В, процентное содержание CD44^hi CD122⁺ CD8⁺ Т клеток в селезенке (n=12 для 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- и n=9 для 17.4α/8.30β-NOD.TCRα-/-), панкреатических лимфоузлах (n=9 для 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- и n=6 для 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-) и костном мозге (n=4 для 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- и n=3 для 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-) трансгенных мышей TCRα-/- (среднее значение ± станд.ошибка). Возраст мышей составлял 9-18 недель. Фиг.5С, репрезентативные профили CD8⁺ Т клеток селезенки мышей 17.6α/8.30β-NOD.TCRα-/-, связанные с NRP-V7/K^d тетрамером и антителом анти-CD122, полученные при помощи FACS-анализа. Приведены средние значения ± станд. ош., полученные в пяти различных экспериментах. Фиг.5D, фенотипический анализ наивных CD8⁺ Т-клеток в сравнении с CD8⁺ Т-клетками памяти селезенки мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-. Для каждого маркера приведены репрезентативные графики по меньшей мере из двух экспериментов. Фиг.5Е, окрашивание на CD122 у CD8⁺CD4^- тимоцитов в сравнении с CD8⁺ спленоцитами трансгенных мышей TCRα^-/-. Приведены репрезентативные графики по меньшей мере из четырех экспериментов. Фиг.5F, включение BrdU CD8⁺ Т клетками селезенки трансгенных мышей TCRα^-/-. Фиг.5G, верхняя панель: репрезентативные профили пролиферации CD8⁺ Т клеток селезенки трансгенных мышей в ответ на цитокины IL-2 и IL-15 (оба в концентрации 100 нг/мл), полученные при помощи FACS-анализа. Нижняя панель: пролиферация наивных CD8⁺ Т клеток в сравнении с CD8⁺ Т-клетками памяти мышей 17.6α/8.30β-NOD.TCRα^-/- в ответ на различные концентрации IL-2 и IL-15. Приведены репрезентативные графики по меньшей мере из трех экспериментов. Фиг.5Н, продукция IFN-γ наивными CD8⁺ Т клетками селезенки мышей 17.4α/8.3β-NOD.TCRα^-/- в сравнении с наивными и CD8⁺ Т клетками памяти мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα^-/- в ответ на дендритные клетки, активированные 1 мкг/мл NRP-A7 через 24 и 48 часов. Фиг.5I, внутриклеточное окрашивание на IFN-γ наивных CD8⁺ Т клеток селезенки мышей 17.4α/8.3β-NOD.TCRα^-/- в сравнении с наивными и CD8⁺ Т клетками памяти мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα^-/- в ответ на дендритные клетки, активированные 1 мкг/мл NRP-A7, через 6 часов. Фиг.5J, продукция IL-2 и пролиферация в ответ на дендритные клетки, активированные 1 мкг/мл NRP-A7, через различные промежутки времени. На Фиг.5Н и Фиг.5J приведены репрезентативные данные из четырех экспериментов, а на Фиг.5I приведены репрезентативные данные из трех экспериментов.

[0037] Фиг.6. Пролиферация 17.4α/8.3β CD8⁺ Т клеток, окрашенных CFSE. Пролиферация 17.4α/8.3β CD8⁺ Т клеток, окрашенных CFSE, в ответ на дендритные клетки, активированные NRP-A7, в присутствии наивных или CD8⁺ Т клеток памяти мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα^-/- (верхняя панель) или в присутствии наивных CD8⁺ Т клеток мышей 17.4α/8.3β-NOD в сравнении с клетками мышей LCMV-NOD (нижняя панель). Приведены репрезентативные данные, по меньшей мере, из пяти экспериментов.

[0038] Фиг.7А-7В. 17.6α/8.3β CD8⁺ Т клетки памяти уничтожают активированные антигеном антиген-презентирующие клетки. Фиг.7А, Цитотоксичность in vitro свежевыделенных наивных CD8⁺ Т клеток мышей 17.4α/8.30β-NOD.TCRα^-/- в сравнении с наивными и CD8⁺ Т клетками памяти мышей 17.6α/8.30β-NOD.TCRα^-/- в отношении дендритных клеток костного мозга, активированных NRP-A7 и TUM. Приведены репрезентативные данные из трех экспериментов. Выделенные дендритные клетки костного мозга активировали 1 мкг/мл NRP-A7 или TUM и помечали [⁵¹Cr]-натрий хроматом. Соотношение эффектор:мишень составляло 8:1 (40000 эффекторных клеток:5000 клеток-мишеней). Супернатант собирали через 8 часов. Фиг.7В, определение цитотоксичности in vivo: NRP-A7-активированные (CFSE^lo) или TUM-активированные (CFSE^hi) В-клетки (верхние панели) или свежевыделенные дендритные клетки селезенки и лимфоузлов (нижние панели) инжектировали трансгенным хозяевам в соотношении 1:1. В-клетки или свежие дендритные клетки (из селезенки и лимфоузлов) выделяли при помощи технологии MACS с использованием гранул, несущих антитела анти-В220 или анти-CD11c, активировали пептидами в концентрации 10 мкг/мл в течение 2 часов, отмывали, окрашивали CFSE (TUM: 3 мкМ CFSE, NRP-A7: 0,3 мкМ CFSE) в течение 3 мин при 37°С, отмывали 3 раза и инжектировали хозяевам по 4-5×10⁶ клеток из каждой популяции. Через 18 часов мышей умерщвляли и исследовали спленоциты при помощи FACS анализа.

[0039] На Фиг.8 показано увеличенное изображение рМНС, конъюгированных с наносферами PLGA (поли(D,L-лактид-ко-гликолид)).

[0040] На Фиг.9 показана выработка IFNγ CD8+ Т-клетками в ответ на комплексы наносфер IGRP/Kd-PLGA при указанной концентрации наночастиц на лунку.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0041] Следует понимать, что данное изобретение не исчерпывается конкретными описанными воплощениями, поскольку они, безусловно, могут варьировать. Также следует понимать, что используемая здесь терминология использована только в целях описания конкретных воплощений и не является исчерпывающей, поскольку рамки данного изобретения будут ограничены только прилагаемой формулой.

[0042] Следует отметить, что используемые в описании и в прилагаемой формуле изобретения существительные в единственном числе также подразумевают их множественное число, если из контекста явно не следует противоположное. Так, напрмимер, ссылка на «эксципиент» включает множество эксципиентов.

I. Определения

[0043] Все технические или научные термины в данном документе имеют такое же значение, как и в общепринятом понимании специалистов в той области, к которой относится изобретение, если не указано иначе. Следующие термины в данном документе имеют следующее значение.

[0044] Термин «содержать» или «содержащий», используемый здесь, означает, что композиции или способы включают перечисленные элементы, не исключая других. «По существу состоящий из» при определении композиций и способов будет означать исключение других элементов, имеющих принципиальное значение для комбинации в указанных целях. Так, композиция, по существу состоящая из элементов, указанных в данном документе, не будет исключать другие материалы или этапы, которые не влияют существенным образом на основы и новые характеристики заявленного изобретения. «Состоящий из» будет означать по отношению к веществу, что вещество может содержать лишь следовые примеси других веществ, а по отношению к способу, что способ не содержит других существенных стадий. Воплощения, обозначенные любым из указанных родственных терминов, находятся в рамках данного изобретения.

[0045] Под «биологически совместимыми» понимают компоненты системы доставки, которые не будут вызывать повреждение тканей или повреждение биологических систем человеческого организма. Для обеспечения биологической совместимости предпочтительно применять полимеры и эксципиенты, для которых ранее была продемонстрирована безопасность применения у человека или которые признаны безвредными (Generally Accepted As Safe). Под биологической совместимостью понимают то, что ингредиенты и эксципиенты, используемые в композициях, в конечном итоге будут «биологически абсорбированы» или выведены организмом без побочных эффектов на организм. Композиция считается биологически совместимой и нетоксичной, если она не оказывает токсичного влияния на клетки. Аналогично, термин «биоабсорбируемые» обозначает наночастицы, изготовленные из материалов, которые проходят биоабсорбцию in vivo за такой период времени, который позволяет избежать долговременного накопления материала у пациента. В предпочтительном воплощении биологически совместимые наночастицы абсорбируются за период времени менее 2 лет, предпочтительно менее 1 года и еще более предпочтительно менее 6 месяцев. Скорость биоабсорбции зависит от размера частиц, использованного материала и других факторов, хорошо известных специалистам. Для изготовления наносфер, применявшихся в данном изобретении, может применяться смесь биоабсорбируемых, биологически совместимых материалов. В одном воплощении может применяться комбинация оксида железа (III) и биологически совместимого биоабсорбируемого полимера. Например, для изготовления наночастиц можно использовать комбинацию оксида железа (III) и PGLA.

[0046] Комплекс антиген/МНС/наносфера обозначает презентирование пептида, углевода, липида или другого антигенного сегмента, фрагмента или эпитопа молекулы антигена или белка (т.е. собственного пептида или аутоантигена) на поверхности, такой как поверхность биологически совместимой биодеградируемой наносферы. «Антиген» в данном документе обозначает часть, фрагмент, сегмент молекулы или целую молекулу, которая способна вызвать иммунный ответ у субъекта или увеличение числа антипатогенных клеток.

[0047] Термин «приблизительно» при употреблении пер